细胞密度调节结肠癌细胞整合素αvβ6表达——癌细胞永生化侵袭生长机制的研究

目的：探讨细胞高密度和细胞挤压状态对结肠癌细胞表面整合素αvβ6表达的影响效果，探讨结肠癌细胞永生化侵袭生长的机制。方法：用流式细胞术检测结肠癌细胞系WiDr、Sw480细胞株和人正常角质细胞系HaCaT细胞株，在高低密度培养条件下各细胞表面的αvβ6表达水平；同时将100例结肠癌标本高细胞密度易侵袭的肿瘤边缘部分及低细胞密度的肿瘤中心部分制作成200点的组织芯片，用免疫组织化学方法检测整合素叫B6在结肠癌不同部位的分布和表达差异。结果：表达αvβ6的结肠癌细胞出现细胞密度依赖的αvβ6表达增加，而缺乏αvβ6表达的癌细胞和正常角质细胞系HaCaT细胞在高低密度培养条件下αvβ6表达没有改变。组织芯片免疫组织化学检查结果显示结肠癌αvβ6阳性表达率为38％，在癌细胞密度高、细胞拥挤的肿瘤边缘部分αvβ6高表达占73．7％（28／38），且αvβ6密布于肿瘤侵袭边缘，而肿瘤中央组织以仅αvβ6低表达为主，高表达仅占28．9％（11／38）。结论：细胞高密度和细胞挤压状态诱导癌细胞αvβ6表达可能是构成结肠癌细胞永生化侵袭性生长的基础。     

细胞密度对结肠癌细胞整合素αγβ6表达和基质金属蛋白酶9分泌的影响

目的 探讨细胞密度对结肠癌细胞整合素αγβ6表达和基质会属蛋白酶9(MMP-9)分泌的影响. 方法用流式细胞仪榆测结肠癌细胞系WiDr和人正常角质细胞系HaCaT细胞株在高、低细胞密度培养条件下αγβ6表达的情况;用Biotrak MMP-9测定仪和明胶酶谱法分别测定不同的结肠癌细胞WiDr和SW480细胞株在高、低密度培养条件下MMP-9的活性和分泌水平. 结果表达αγβ6的结肠癌WiDr细胞出现细胞密度依赖的αγβ6表达增加,而正常角质细胞系HaCaT细胞在高、低密度培养条件下αγβ6表达无改变.Biotrak MMP-9活性分析显示,每个表达αγβ6的WiDr细胞和SW480β6细胞的MMP-9分泌量在高密度培养条件下分别是(3.3±1.2)×10-7-ng和(27.2±3.0)×10-7ng,在低密度培养条件下分别足(1.8±0.7)×10-7ng和(10.9±2.0)×10-7ng,而每个缺乏αγβ6表达的SW480 wild细胞在高、低细胞密度培养条件下分别足(3.9±1.7)×10-7ng和(3.8±0.7)×10-7ng,MMP-9分泌水平无明显变化(t=0.47,P＞0.05).明胶酶谱分析显示SW480 β6细胞的MMP-9活性水平在高密度培养时比低密度培养明显增加,而SW480 wild和HaCaT细胞的MMP-9活性水平无明显改变.结论 细胞高密度诱导结肠癌细胞αγβ6表达,促进MMP-9的分泌,构成了癌细胞永生化侵袭浸润性生长的基础.     

整合素αvβ6与钙黏蛋白Fat1在结肠癌中的表达差异性及其意义

目的：探讨整合素αvβ6和钙黏蛋白Fat1在结肠癌中的表达情况,进一步揭示其背后的意义。方法：将100例结肠癌标本的肿瘤边缘部分及肿瘤中心部分制作成200点的组织芯片,用免疫组织化学方法检测整合素αvβ6和钙黏蛋白Fat1在结肠癌不同部位的分布和表达差异。利用siRNA技术和转基因技术对HT-29结肠癌细胞和SW480结肠癌细胞进行试验分组,用流式细胞术检测各组结肠癌细胞表面整合素ανβ6和钙黏蛋白Fat1表达水平;应用Western Blot分析各组结肠癌中Ras蛋白活化的情况。结果：肿瘤侵袭边缘,整合素αvβ6呈现高表达,而钙黏蛋白Fat1低表达;瘤体中央,整合素αvβ6低表达,而钙黏蛋白Fat1高表达。流式细胞分析证实在结肠癌细胞表面,整合素αvβ6和钙黏蛋白Fat1表达水平同样呈现负相关关系。Western Blot分析证实,整合素αvβ6能够促进结肠癌细胞Ras蛋白的活化水平。结论：整合素αvβ6和钙黏蛋白Fat1在结肠癌中呈现负相关表达,αvβ6通过抑制Fat1功能促进Ras蛋白的活化。     

整合素ανβ6与MMP-9在结肠癌组织中的表达及其相关性研究

目的：研究结肠癌组织中整合素ανβ6与基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达及其意义。方法：采用免疫组织化学SP法检测80例结肠癌及切缘正常组织中整合素ανβ6与MMP-9的表达并分析二者与结肠癌临床病理因素之间关系。结果：结肠癌组织中整合素ανβ6、MMP-9阳性率明显高于切缘结肠组织（P〈0.01）,且与结肠癌的分化程度、Dukes分期和淋巴结转移密切相关（P〈0.05）。结肠癌组织中整合素ανβ6与MMP-9表达呈正相关（r=0.892,P〈0.01）。结论：检测整合素ανβ6与MMP-9在结肠癌组织中表达情况,可作为结肠癌预后评估指标之一;针对二者进行相关靶向研究可能为治疗结肠癌提供新途径。     

整合素ανβ6与肿瘤关系的研究进展

整合素ανβ6是由α、β亚单位以非共价键结合组成的跨膜异二聚体,只表达于恶性上皮性肿瘤组织而健康组织及良性肿瘤组织无表达.目前研究发现,整合素ανβ6参与多种信号传导通路,在多种肿瘤的发生发展、侵袭转移过程中发挥重要作用.对整合素ανβ6的深入研究为恶性肿瘤的诊治提供一条新的思路.     

整合素αvβ6-ERK2直接通路调控MMP-9分泌与结肠癌转移关系的实验研究

目的 探讨在结肠癌细胞中整合素ανβ6-ERK2信号直接通路对MMP-9分泌的影响，进一步探讨结肠癌转移的机制。方法 采用流式细胞仪检测各细胞表面ανβ整合素的表达，采用明胶酶谱分析法和MMP-9活性检测法，定性定量分析不同结肠癌细胞在TCM中MMP-9的分泌水平。结果 WiDr MOCK，HT29MOCK细胞表面β6表达量明显高于WiDrA／Sense，HT29A／Sense细胞，且每个细胞分泌到无血清TCM中的MMP-9总量比WiDrA／Sense、HT29A／Sense细胞高2～3倍。SW480 β6 Full Length细胞分泌到TCM中的MMP-9分泌量不仅显著高于SW480MOCK细胞，而且能被MEK-1抑制剂PD98059所抑制。SW480 β6 Full Length细胞表面β6表达量和SW480 β6 Truncate细胞表面β6表达量相近，但SW480 β6 Truncate细胞在TCM中MMP-9的分泌量降低到SW480Mock细胞的分泌水平。结论 抑制β6的表达，阻滞MEK或删除β6-ERK2的连接位点均可抑制MMPO的分泌；阻断ανβ6-ERK2直接连接可降低结肠癌细胞MMPO的分泌，抑制结肠癌细胞侵袭和转移。     

钙黏蛋白12在结肠癌细胞株与结肠直肠癌组织中的表达及其影响

目的：研究钙黏蛋白12（cadherin-12,CDH-12）在结肠癌细胞株与结肠直肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞株增殖、侵袭、迁移的影响。方法：应用实时PCR和Western印迹法在7株结肠癌细胞株中筛选CDH-12高表达细胞株;shRNA瞬转干扰高表达细胞株SW1116,Western印迹法验证干扰效果;CCK-8检测癌细胞增殖活性变化;transwell实验验证癌细胞迁移、侵袭能力的变化;组织芯片免疫组织化学技术检测CDH-12在结肠直肠癌组织中的表达。结果：实时PCR和Western印迹结果显示CDH-12在细胞株中表达,SW1116和LoVo两个细胞株高表达CDH-12,在成功下调SW1116细胞中CDH-12表达之后,SW1116结肠癌细胞株的增殖、迁移、侵袭能力较对照组明显下降;免疫组化染色结果显示,CDH-12在结肠直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织中的表达。结论：CDH-12在结肠直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,证实了CDH-12为癌基因的可能性;下调CDH-12在结肠癌细胞株SW1116的表达可明显抑制细胞的增殖、迁移、侵袭能力,显示其在肿瘤细胞生长和转移中的重要作用。     

整合素αvβ6缺失ERK2结合位点对SW480细胞基因表达的影响

目的:研究整合素αvβ6缺失细胞外调节蛋白激酶2(ERK2)结合位点对结肠癌SW480细胞基因表达调控的影响。方法:构建稳定转染β6基因结构的结肠癌SW480细胞(SW480β6)和缺失ERK2结合位点的缺失突变型β6转染的SW480细胞(SW480β6Del.mutant),并通过Western blot实验检测整合素αvβ6、总ERK(t-ERK)及磷酸化ERK(p-ERK)表达水平,通过Transwell实验检测整合素αvβ6缺失ERK2结合位点对SW480细胞侵袭能力的影响。通过RNA测序研究整合素αvβ6缺失ERK2结合位点对SW480细胞基因表达谱的影响,并对差异表达基因(DEGs)进行GO和KEGG功能富集分析。结果:SW480β6和SW480β6 Del.mutant细胞均高表达αvβ6,两者之间的t-ERK表达水平差异无统计学意义(P>0.05),SW480β6 Del.mutant细胞p-ERK2水平较SW480β6细胞明显降低,且侵袭能力也明显下降(P<0.05)。通过RNA测序,在SW480β6Del.mutant细胞中共筛选出2249个DEGs,包括上调基因936个,下调基因1313个,DEGs显著富集在癌症通路、PI3K-AKT通路、MAPK通路、细胞与细胞因子受体互作方面。结论:整合素αvβ6通过αvβ6-ERK2直接连接提高ERK2的磷酸化水平,激活MAPK信号通路,促进结肠癌细胞侵袭。缺失整合素αvβ6-ERK2直接连接后,DEGs除富集于MAPK通路外,还富集于多条在结肠癌中具有重要作用的通路,提示在结肠癌中各种信号通路具有互补作用,多靶点药物对结直肠癌是一种有前景的治疗方式。     

伴侣蛋白CCT6A参与结肠癌细胞迁移及侵袭的作用研究

目的:研究伴侣蛋白CCT6A在结肠癌细胞株迁移和侵袭过程中的作用。方法:培养9株结肠癌细胞,抽取总RNA和蛋白。采用实时定量PCR和Western印迹法筛选CCT6A高表达的细胞株。设计购买3种siRNA片段,转染高表达CCT6A的结肠癌细胞株,利用实时定量PCR和Western印迹法验证干扰效果。选择干扰效果最优的RNA干扰片段,通过Transwell实验来评估转染后结肠癌细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:SW1116细胞株中的CCT6A在mRNA及蛋白水平都呈现高表达;3种干扰片段转染SW1116细胞后,CCT6A表达量均有不同程度下降,其中以片段2的干扰效果最优。在迁移实验中,CCT6A干扰组穿膜细胞数为(6±2)个,低于阴性对照组(23±12)个和空白对照组(21±11)个;在侵袭实验中,CCT6A干扰组穿膜细胞数为(9±2)个,低于阴性对照组(40±12)个和空白对照组(43±10)个;上述差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:下调CCT6A的表达能显著抑制结肠肿瘤细胞的迁移、侵袭能力,提示CCT6A可能在结肠癌浸润和转移中起到一定作用。     

elF4E和整合素αvβ6在结肠癌组织中的表达及临床意义

目的：探讨elF4E和整合素αvβ6在结肠癌组织中的表达及临床意义.方法：采用免疫组化SP法检测69例结肠癌及30例正常结肠组织中elF4E和整合素αvβ6蛋白的表达,并分析二者与结肠癌临床病理因素的关系.结果：结肠癌组织中elF4E和整合素αvβ6蛋白的表达明显高于正常结肠组织,差异有统计学意义（P＜0.01）.elF4E表达与淋巴结转移有关（P=0.013）,整合素αvβ6表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床TNM分期有关（P=0.027,P=0.034,P=0.031）.结肠癌组织中elF4E与整合素αvβ6蛋白的表达呈低度正相关（P=0.016,r=0.288）.Kaplan-Meier法生存分析显示,elF4E和整合素αvβ6蛋白的表达与患者5年生存率显著相关（P=0.008,P=0.040）.Cox回归分析显示,elF4E及整合素αvβ6蛋白的表达水平、组织分化程度、肿瘤浸润深度和年龄是结肠癌的独立危险因素,其中elF4E高表达和α V β 6阳性表达的相对危险度分别是4.212 （95％ Cl：1.779,9.973）和2.774（95％ Cl：1.148,6.700）.结论：结肠癌组织中elF4E和整合素αvβ6蛋白可作为结肠癌患者术后预后不良的独立预测指标,二者潜在的信号通路可能成为治疗结肠癌的新靶点.     

β1整合素表达下调对人结肠癌细胞侵袭和耐药的影响

目的 观察β1整合素表达下调对人结肠癌HT-29细胞侵袭和耐药的影响.方法 反义寡核苷酸技术转染HT-29细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测β1整合素表达下凋.Transwell侵袭窒方法检测HT-29体外侵袭力.流式细胞术(FCM)和噻唑蓝(MTT)比色法检测不同剂量的化疗药物[5-氟尿嘧啶(5-Fu)]对各组凋亡率和生长抑制率的影响.结果 实验组HT-29细胞βl整合素mRNA表达显著降低,体外侵袭实验迁移的HT-29细胞数(59±12)明显减少(P＜0.05),在高浓度5-Fu(100、200 mg/L)时HT-29细胞的生长抑制率(36.97%和47.58%)和细胞凋亡率[(15.7l±1.46)%、(27.82±1.58)%]与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 β1整合素表达下调可降低结肠癌细胞侵袭及化疗药物耐药性.     

αVβ6-ERK直接通路在乌司他丁抑制结肠癌侵袭转移中的作用机制

目的：探讨αVβ6-ERK直接通路在乌司他丁（UTI）抑制结肠癌侵袭转移中的作用。方法：100例结肠癌患者随机分为对照组和治疗组,ELISA检测血清MMP-9／2水平,免疫组织化学检测结肠癌组织αVβ6表达;HT-29细胞按UTI不同浓度分组,TransweⅡ小室检测细胞侵袭能力,明胶酶谱检测MMP-9／2水平,WestemBlot检测细胞αVβ6和ERK变化。结果：UTI可降低结肠癌患者血清MMP-9／2水平及肿瘤组织aV136表达强度;UTI可抑制HT-29细胞侵袭能力及MMP-9／2分泌水平,并显著下调αVβ6表达和ERK磷酸化水平。结论：UTI可显著抑制结肠癌的侵袭浸润,αVβ6-ERK直接通路介导的MMP-9／2分泌可能在其中发挥重要作用。     

JAK2激酶抑制剂AG490对结肠癌HT-29细胞侵袭性的影响

目的观察JAK2激酶抑制剂AG490对结肠癌HT-29细胞侵袭以及对基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的影响，探讨STAT3信号转导通路在结肠癌侵袭转移调控中的作用。方法应用JAK2激酶抑制剂AG490处理结肠癌HT-29细胞，Matrigel肿瘤体外侵袭模型检测肿瘤细胞侵袭；Western blot检测STAT3蛋白表达；逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测MMP2mRNA表达。结果AG490可抑制JAK2／STAT3信号转导通路活化及结肠癌HT-29细胞侵袭，在此过程中AG490在mRNA水平抑制MMP-2表达。结论STAT3信号转导通路参与结肠癌细胞侵袭调控，阻断STAT3通路活化可抑制结肠癌细胞侵袭，这一作用可能是通过抑制MMP-2表达实现的。     

整合素αvβ6调控结肠癌细胞转录因子Ets-1表达的分子机制研究

目的:探讨整合素αvβ6对核转录因子Ets-1表达的影响,明确αvβ6-ERK2直接连接在该过程中发挥的作用。方法:流式细胞仪检测各结肠癌SW480细胞表面αvβ6的表达;采用Westernblotting法分别检测ERK表达、活化水平和Ets-1的表达水平。结果:SW480β6和SW480β6Del.mutant细胞均表达αvβ6;SW480β6细胞Ets-1的表达量较SW480细胞明显增多(P<0.05),同时ERK的磷酸化水平(p-ERK)也明显升高,而总ERK(t-ERK)表达水平二者无明显差异;SW480β6Del.mutant细胞ERK2的磷酸化水平较SW480β6细胞明显降低;SW480β6Del.mutant细胞和PD98059处理的SW480β6细胞Ets-1的表达水平明显低于对照组(P<0.05)。结论:整合素αvβ6通过αvβ6-ERK2直接连接提高ERK2的磷酸化水平,从而促进结肠癌SW480细胞核转录因子Ets-1表达。     

β1整合素表达下调对结肠癌肝转移的抑制作用

目的 探讨β1整合素表达下调对人结肠癌细胞(HT-29)肝转移的抑制作用.方法 采用脂质体将β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)转染到HT-29细胞内,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测β1整合素的表达.Transwell侵袭室方法检测HT-29体外侵袭转移能力.裸鼠开腹于脾脏被膜下注射转染的HT-29建立肝转移模型,30 d后处死裸鼠,计算肝转移癌的数量与大小,免疫组织化学(SP法)观察转移癌中β1整合素的表达.结果 与对照组比较,实验组β1整合素mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Transwell体外侵袭实验实验组迁移的细胞数明显减少(P<0.05);体内裸鼠肝转移实验组转移癌数量(4.00±0.93)个/只、平均体积(10.10±6.50)mm3/只、平均重量(0.0440±0.0008)g/只、免疫组织化学肝转移癌中β1整合素表达阳性细胞百分率(28.60±3.79)%均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 β1整合素表达下调对结肠癌肝转移具有抑制作用.     

去甲斑蝥素阻断αvβ6-ERK-ETS1信号通路抑制结肠癌细胞上皮-间质转化实验研究

目的:探讨去甲斑蝥素抑制结肠癌细胞上皮-间质转化的分子机制,为中药抗癌机制的研究奠定基础。方法:将HT-29结肠癌细胞经NCTD处理后,光镜下观察细胞形态学变化;流式细胞术检测处理前后细胞表面上皮表型及间质表型标志物的变化情况;Western Blotting分析常见调控细胞EMT过程信号传导通路中关键分子及其磷酸化状态的变化;转录因子活化技术观察核因子磷酸化状态的变化。结果:显微镜下观察发现,经NCTD处理后,结肠癌细胞EMT过程受到抑制;流式细胞术证实肿瘤细胞整合素αvβ6表达降低,同时上皮表型标志物表达升高,间质表型标志分子表达减少;Western Blotting分析常见调控细胞EMT过程信号传导通路中仅有ERK及p-ERK表达水平降低,其他关键蛋白无明显变化;转录因子活化技术发现利用si RNA技术干扰整合素αvβ6后,ERK下游的核转录因子中仅有ETS-1磷酸化水平改变,Western Blotting分析证实经NCTD处理后出现与干扰αvβ6表达造成的一致性改变。结论:去甲斑蝥素通过阻断αvβ6-ERK-ETS1信号通路抑制结肠癌细胞上皮-间质转化过程,从而发挥抗癌作用。     

Cortactin过表达对结肠癌细胞转移能力的影响

目的:通过诱导皮层肌动蛋白(cortactin)的过表达分析其在结肠癌细胞侵袭迁移以及肝转移过程中的作用。方法:构建含CTTN基因和绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体,转染293T细胞。取含CTTN基因和绿色荧光蛋白的病毒上清液转染结肠癌细胞株SW1116使cortactin稳定表达。蛋白印迹实验检测cortactin的表达,通过Transwell实验评估结肠癌细胞侵袭迁移能力的改变。利用SW1116细胞株使裸鼠皮下成瘤,取肿瘤组织种植新一批裸鼠结肠壁并观察结肠癌肝转移的情况。结果:成功构建cortactin过表达的SW1116细胞。侵袭和迁移实验中,过表达组穿膜细胞数分别为(147±12)个、(286±17)个,而阴性对照组为(83±10)个、(112±11)个,空白对照组为(75±7)个、(103±9)个,后两组与过表达组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:上调cortactin的表达能显著促进结肠癌细胞的侵袭迁移和肝转移能力,提示cortactin在结肠癌的转移过程中发挥重要作用。     

生物强度电场对人表皮细胞株HaCaT和小鼠表皮细胞运动性及CD9表达的影响

目的:探讨生物强度电场对人表皮细胞株HaCaT和小鼠表皮细胞运动性及CD9表达的调节作用。方法:采用实验研究方法。取对数生长期人永生化表皮细胞株HaCaT细胞及分离自16只1～3 d龄雌雄不拘BALB/c小鼠的原代表皮细胞进行实验。将HaCaT细胞分为200 mV/mm电场强度处理3 h的加电组和模拟处理的假电组,在活...     

体内连续筛选法建立人结肠癌肝转移阶梯细胞模型

目的：通过在裸鼠体内进行SW1116结肠癌细胞株原位种植肝转移连续筛选,建立人结肠癌肝转移阶梯细胞模型系统,为研究结肠癌转移的分子机制提供实验模型。方法：将SW1116细胞株在裸鼠皮下连续5次传代后,取皮下种植瘤在裸鼠结肠进行原位种植,继而取肝脏转移灶进行下一代裸鼠结肠原位种植,经3次结肠原位种植肝转移筛选,建立大肠癌肝转移阶梯细胞模型。用免疫组化法验证种植瘤及转移灶的组织来源,并行同期体内外侵袭实验,检测经体内连续筛选出的癌细胞侵袭转移能力变化。结果：经5代皮下连续传代及3代结肠至肝的体内转移筛选,成功建立了第三代结肠癌肝转移筛选细胞系（CRCLM3）。裸鼠种植瘤及转移灶均表达人癌胚抗原,而同期体内外侵袭试验结果显示,经体内筛选得到的结肠癌细胞株转移能力逐渐加强。结论：经体内连续肝转移筛选所建立的结肠癌细胞系侵袭转移能力增强,而CRCLM3细胞系是研究结肠癌肝转移机制的理想细胞模型。     

人表皮细胞中侧群细胞表型的初步分析

目的:检测人表皮细胞中是否存在侧群(side population,SP)细胞,并研究该表型细胞是否表达通用干细胞标志物ABCG2和表皮干细胞的标志物整合素α6和β1.方法:运用中性蛋白酶和胰蛋白酶两步消化法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮细胞.经Hoechst33342荧光染料和PI染色,流式细胞仪分析并分选SP细胞.采用流式细胞仪分析SP细胞ABCG2、整合素α6和β1的表达情况.结果:人表皮细胞中存在SP细胞,其比例为0.2%～0.3%.用流式细胞仪可检测到在SP细胞以及总表皮细胞中均有少量细胞表达通用干细胞标志物ABCG2以及表皮干细胞的标志物整合素α6和β1,但二者阳性细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05).结论:表皮细胞中的SP细胞是否是富集的表皮干细胞仍存在疑问,还需要进一步的动物体内移植实验、克隆形成能力和增殖能力的研究证实.