顺铂及依托泊苷对神经母细胞瘤细胞中Trk基因家族表达的影响及临床意义

目的神经母细胞瘤(NB)是儿童常见的实体瘤,而三种不同Trk基因的表达变化与NB的预后及转归关系密切;为研究如何优化化疗药物疗效以提高NB患儿的生存率,本文检测了顺铂(DDP)及依托泊苷(VP16)对人NB的SK-N-SH细胞系的杀伤作用及对细胞中Trk基因家族表达的影响。方法通过CCK-8药物诱导细胞毒性实验检测不同浓度梯度的DDP及VP16对SKN-SH细胞的杀伤作用以及半数杀伤浓度(IC50);用qRT-PCR方法检测DDP及VP16在不同浓度下分别作用24 h及48 h后,对SK-N-SH细胞中TrkA、TrkB和TrkC基因表达变化。结果(1)IDDP及VP16药物浓度的增加与其对SK-N-SH细胞的杀伤作用呈线性关系;且48 h比24 h杀伤作用更明显。(2)SK-N-SH细胞中TrkA及TrkC的表达均随着DDP浓度和作用时间的增加而上调,尤其在10μg/mL浓度、24h最明显;而TrkB的表达在24 h时随着DDP浓度增加而上调,48 h时该促进作用不明显;(3)SK-N-SH细胞中TrkA、TrkB及TrkC的表达亦随着VP16浓度和作用时间的增加而上调。结论 DDP及VP16对NB细胞SK-N-SH有明显杀伤作用并对其Trk基因家族的表达有影响。     

CCK-8法检测阿糖胞苷对白血病细胞株增殖抑制作用

目的探索阿糖胞苷(Ara-C)治疗急性白血病的剂量、时间与效应的相关性。方法采用CCK-8法,检测不同剂量梯度范围内(0.1～200μmol/L)、Ara-C作用不同时间(4～48 h),对白血病细胞株Jurkat(ALL)和NB4(AML)增殖抑制作用的差异与特征规律。结果 Jurkat细胞和NB4细胞在一定的Ara-C作用浓度范围内,均存在着随作用时间延长,增殖抑制逐渐提升的效应。在4 h和8 h 2个作用时间组中,随着Ara-C剂量递增,Jurkat细胞的增殖抑制率明显增加;而NB4细胞仅在0.5～50μmol/L浓度梯度范围内呈现剂量与效应的相关性。结论 Ara-C作为细胞周期特异性药物(CCSA),对肿瘤细胞的增殖抑制效应存在明显的时间-剂量相关性,Jurkat对Ara-C的敏感性高于NB4。[临床儿科杂志,2012,30(5):460-463]     

丹参酮ⅡA抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进人白血病NB4细胞株自噬的实验研究

目的探讨丹参酮ⅡA(TanⅡA)体外对人急性早幼粒细胞白血病(APL) NB4细胞株自噬的影响及其信号通路研究。方法 0、4、8、16μg/m L TanⅡA作用于人白血病NB4细胞24h、48h、72h后,以噻唑蓝(MTT)比色法检测NB4细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞自噬率,Western印迹检测自噬相关蛋白P62及磷酸肌醇3激酶-I(PI3K-I)、蛋白激酶B(Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达水平。结果 TanⅡA呈剂量和时间依赖性抑制NB4细胞增殖(P <0. 05)。TanⅡA可诱导NB4细胞自噬形成自噬流,并呈一定浓度和时间依赖性,各组间差异有显著性(P<0. 05)。Western印迹显示,TanⅡA作用NB4细胞48h后,细胞自噬相关蛋白P62水平明显降低,与对照组相比差异具有显著性(P <0. 05);而p-PI3K-I、p-Akt、p-mTOR蛋白表达相较对照组明显下降,差异有显著性(P值均<0. 05)。结论 TanⅡA可靶向抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,增强NB4细胞自噬活性、诱发自噬性死亡,从而发挥抗APL效应。     

苦参碱对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用机制

目的 探讨苦参碱对人神经母细胞瘤( NB) SH-SY5Y细胞的作用机制.方法 取对数生长期的细胞,分为对照组(含细胞、无苦参碱)及药物处理组(苦参碱质量浓度为2.0g·L-1,对细胞的作用时间分别为16 h、24 h、32 h)共4组,每组5个复孔.应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测NB SH-SY5Y细胞增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率;比色法检测Caspase-8的相对活性.采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析.结果 MTT检测对照组及各时间点药物处理组增殖抑制率分别为(4.98±1.20)％、(11.01±0.85)％、(15.22±0.71)％和(22.31±1.45)％;FCM法检测对照组及各时间点药物处理组细胞的凋亡率分别为(5.23±1.19)％、(10.74±1.65)％、(14.00±0.98)％和(17.81±1.06)％;比色法测定各组Caspase-8的相对活性分别为(4.25±1.00)％、(10.69±1.10)％、(14.80±1.44)％和(19.80±0.97)％;以上检测各组间比较差异均有统计学意义(Pa＜0.05).结论 苦参碱可抑制人NB SH-SY5Y细胞增殖,并可通过上调Caspase-8的活性诱导NB SH-SY5Y细胞凋亡,其作用随时间的延长逐渐增强.     

全反式维甲酸、三氧化二砷联合地西他滨对SK-N-SH细胞系活性及分化的影响

目的通过检测全反式维甲酸(ATRA)、三氧化二砷(ATO)联合地西他滨(DAC)对神经母细胞瘤(NB)细胞系SK-N-SH活性及分化的影响,探讨上述药物联合应用提高NB疗效的可能性。方法不同浓度ATRA和DAC处理SK-N-SH细胞,测定其IC50。测定单药或联合用药处理后细胞的凋亡率并记录细胞形态;采用SPSS 20.0分析数据。结果 (1)ATRA及DAC均可抑制NB细胞增殖、促进凋亡,IC50_((ATRA))=372.5μM,IC50_((DAC))=452.5μM。(2)10μM ATRA联合DAC处理NB细胞,其凋亡率为(7.31±0.94)%,高于ATRA单药组(4.90±1.58)%和DAC单药组(4.62±0.99)%。3μM ATO联合DAC处理细胞,其凋亡率由(8.44±0.86)%增加至(15.51±1.80)%。(3)1μM、10μM浓度ATRA处理SK-N-SH细胞,开始分化的时间分别为7天和3天;随时间延长,细胞分化、死亡增多。5μM DAC单药,持续观察9天,未见分化细胞。联合用药组细胞分化出现更早。结论 (1)ATRA、DAC对SK-N-SH细胞有抑制增殖、促进凋亡和诱导分化的作用;(2)联合去甲基化药物DAC可提高ATRA对SK-N-SH细胞的杀伤作用和诱导分化作用;(3)联合去甲基化药物DAC可提高ATO对SK-N-SH细胞的杀伤作用。     

阿糖胞苷作用下白血病细胞膜人核苷转运体1基因表达变化研究

目的检测肿瘤细胞膜上人平衡型核苷转运体1(human equilibrative nucleoside trans-porter 1,hENT1)基因表达及其变化,探索影响阿糖胞苷(Ara-C)治疗急性白血病(AL)疗效的相关因素。方法根据目前临床采用的低剂量、中剂量和大剂量Ara-C(HD-AraC)治疗时所能达到的血浆药物浓度,分别采用0.5～100μmol/L中的6种不同剂量(0.5、1.0、5.0、15、50、100μmol/L)体外作用于白血病细胞株Jurkat和NB4,经4～48 h的5个时间段(4、8、12、24、48 h)作用后,采用定量RT-PCR方法测定hENT1 mRNA表达及其变化。结果 (1)Jurkat和NB4细胞的hENT1mRNA原始相对表达量(ΔCt值)分别为5.21±0.02和5.34±0.05,两者差异无显著性(P0.05)。(2)在较低剂量Ara-C(0.5～15μmol/L)作用下,hENT1 mRNA表达恒定,与阴性对照组差异无显著性(P0.05);但在高浓度Ara-C(50μmol/L和100μmol/L)作用48 h后,Jurkat和NB4细胞的hENT1 mRNA表达明显增强,ΔCt分别为2.02±0.17和2.19±0.02,与对照组(5.21±0.02)比较差异均有显著性(P0.05)。(3)同一种细胞在50μmol/L和100μmol/L两个剂量组的hENT1mRNA表达增高程度,差异无显著性(P0.05);分别来源于ALL和AML的Jurkat和NB4细胞的表达量间差异亦无显著性(P0.05)。结论 HD-AraC处理48 h后,Jurkat和NB4细胞的hENT1mRNA表达可明显提高,有利于药物进入细胞,以增强抗白血病效应,推测临床HD-AraC疗法采用48～72 h的疗程是必要的。     

二十碳五烯酸对E.coli LF82感染后肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1 mRNA的影响

目的探讨二十碳五烯酸(EPA)对黏附侵袭性大肠杆菌(AIEC)LF82感染后肠上皮细胞(Caco-2)紧密连接蛋白(ZO-1)表达的影响。方法用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞紧密连接模型,分为EPA处理组,EPA 0、25、50、100、200μmol/L干预96 h;以及EPA(EPA 0、25、50、100、200μmol/L)+E.coli LF82联合处理组,在不同浓度EPA干预96 h的基础上,予E.coli LF82分别干预0 h、6 h、12 h。通过细胞形态学观察,MTT法测定细胞生长曲线,以及细胞膜两侧碱性磷酸酶(ALP)活性检测对Caco-2细胞模型进行评价。流式细胞术检测不同浓度EPA对Caco-2细胞凋亡的影响。RT-q PCR检测EPA和/或E.coli LF82作用于Caco-2细胞后ZO-1 m RNA的表达情况。酶联免疫吸附法检测Caco-2细胞上清中TNF-α的变化。结果 EPA25、50μmol/L处理后,Caco-2细胞存活率均高于0浓度组,且增高呈浓度依赖性(P0.05);EPA100、200μmol/L处理组的细胞存活率下降呈浓度依赖性,均低于0浓度组(P0.05)。EPA浓度为100、200μmol/L时,细胞凋亡率较0浓度组增加(P0.05)。单独E.coli LF82干预Caco-2细胞6 h、12 h后,ZO-1 m RNA表达随处理时间延长而减少,均低于未处理组(P0.05)。EPA 25、50μmol/L干预联合E.coli LF82处理6 h或12 h,Caco-2细胞的ZO-1 m RNA表达随EPA浓度增加而增加,均高于E.coli LF82单独处理组(P0.05)。单独E.coli LF82处理6 h、12 h组的TNF-α分泌随干预时间延长而增加,均高于未处理组(P0.05)。EPA25、50μmol/L联合LF82处理6 h或12 h,细胞上清液中TNF-α分泌量随EPA浓度的增加而减少,均少于单独LF82处理组(P0.05)。结论 EPA能有效预防E.coli LF82感染后肠上皮细胞紧密连接的破坏,抑制炎症因子的分泌,对肠黏膜屏障有一定的保护作用。     

冬凌草甲素通过下调Brg1表达抑制Jurkat细胞生长

目的探讨冬凌草甲素对人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞的作用及其机制。方法体外培养Jurkat细胞株,用不同浓度冬凌草甲素(0、1.25、2.5、5和10μmol/L)作用Jurkat细胞不同时间(24、48、72 h),MTT实验观察细胞增殖情况,荧光显微镜观察不同浓度冬凌草甲素处理Jurkat细胞12 h后的细胞核形态变化。采用Western blot半定量法检测不同浓度冬凌草甲素作用Jurkat细胞24 h,以及5μmol/L冬凌草甲素处理Jurkat细胞不同时间(0、2、6、12和24 h)后的Brg1、P53和C-myc蛋白表达。用si RNA沉默Jurkat细胞的Brg1,观察其对P53、C-myc蛋白表达以及对增殖的影响。结果与无处理组相比,冬凌草甲素对Jurkat细胞增殖有抑制作用(P0.05),且呈浓度和时间依赖性;荧光显微镜下发现,冬凌草甲素处理后的Jurkat细胞出现细胞核浓集、固缩等典型凋亡形态变化。与无处理组相比,5μmol/L冬凌草甲素作用下,Jurkat细胞的Brg1和C-myc表达下降,而P53表达上升。si RNA沉默Jurkat细胞的Brg1后,P53表达升高,C-myc蛋白表达下降,细胞生长明显受抑(P0.05)。结论冬凌草甲素对Jurkat细胞生长具有抑制作用,其机制可能通过影响Brg1信号通路起作用。     

13-顺维甲酸体外诱导神经母细胞瘤干细胞分化的体外实验

目的 体外观察并鉴定13-顺维甲酸诱导神经母细胞瘤（NB）干细胞的分化作用,为临床用维甲酸治疗NB微小残留病灶提供实验依据。方法 取14例伴骨髓转移的Ⅳ期NB患儿的骨髓液标本,分离出NB细胞,将原代肿瘤细胞接种于无血清干细胞培养基中悬浮培养;在含5 μmol·L-1 13-顺维甲酸的分化培养基中培养神经球细胞,观察细胞的形态变化;RT-PCR法检测神经球细胞诱导前、诱导3和9 d Oct-4表达水平的改变;利用细胞免疫荧光技术比较诱导前及诱导9 d神经球细胞nestin表达的差异。结果 14例骨髓标本中,4例分离到原代NB细胞。无血清培养基中培养4~6 d后,可见原代悬浮神经球形成,传代后成球细胞能再次分裂增殖为神经球。神经球细胞在血清培养基中呈贴壁生长,呈三角形或星形,添加5 μmol·L-1 13-顺维甲酸后,细胞生长速度降低,形态发生明显改变。RT-PCR法检测结果显示,13-顺维甲酸诱导9 d后,神经球细胞Oct-4表达水平逐渐降低;细胞免疫荧光显示诱导9 d后神经球细胞nestin表达减弱。结论 13-顺维甲酸能有效诱导NB干细胞分化。     

牛初乳短链胰岛素样生长因子对脂蛋白(a)诱导的肾小球系膜细胞增生与转化生长因子-β1表达的影响

目的探讨牛初乳短链胰岛素样生长因子(Bct-IGF)对脂蛋白(a)[Lp(a)]诱导的肾小球系膜细胞(GMCs)增生与转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法将GMCs分为6组培养:对照组,Lp(a)组和不同浓度的Bct-IGF组,后5组培养时均加入5.0 mg.L-1Lp(a),后4组培养时分别加入100μg.L-1、200μg.L-1、400μg.L-1、800μg.L-1Bct-IGF。利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖率,末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)测定GMCs凋亡率;ELISA法测定培养上清TGF-β1水平,反转录-PCR法检测TGF-β1 mRNA表达。结果与400μg.L-1Bct-IGF组比较,Lp(a)组、100μg.L-1Bct-IGF组、200μg.L-1Bct-IGF组GMCs细胞增殖率均明显增高,差异有统计学意义(Pa<0.05);800μg.L-1Bct-IGF组较之降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。与400μg.L-1Bct-IGF组比较,LP(a)组、100μg.L-1Bct-IGF组、200μg.L-1Bct-IGF组GMCs细胞凋亡率均明显降低,差异有统计学意义(Pa<0.05);800μg.L-1Bct-IGF组较之增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。Lp(a)组培养上清中TGF-β1水平显著高于400μg.L-1Bct-IGF组(P<0.01);Lp(a)组培养细胞TGF-β1 mRNA表达显著高于400μg.L-1Bct-IGF组(P<0.01)。结论 Lp(a)可以促进GMCs增生及TGF-β1的过表达,Bct-IGF可以抑制Lp(a)诱导的GMCs的异常增生,促进Lp(a)诱导的GMCs的凋亡。     

姜黄素对H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制

目的探讨姜黄素对H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。方法首先用5～15μmol.L-1姜黄素处理H9c2心肌细胞12 h,双波长法检测血红素加氧酶-1(HO-1)活性。其次用400μmol.L-1过氧化氢(H2O2)处理H9c2心肌细胞3 h,以建立细胞氧化应激损伤模型,给予15μmol.L-1姜黄素预处理12 h,或在姜黄素预处理1 h前给予HO-1抑制剂Znpp-Ⅸ10μmol.L-1共孵育。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;采用流式细胞术Annexin-V FITC/PI染色和Caspase-3活性检测评估细胞凋亡;硫代巴比妥酸显色法检测细胞丙二醛(MDA)水平,氮蓝四唑显色法检测细胞总超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用Western blot法检测细胞核因子-κB(NF-κB)蛋白表达水平。结果 HO-1活性检测显示,与对照组比较,5～15μmol.L-1姜黄素能够呈浓度依赖性地诱导HO-1活性增加。MTT和细胞凋亡检测显示,与H2O2组比较,15μmol.L-1姜黄素能够显著上调细胞存活率,下调细胞凋亡率和Caspase-3活性。细胞MDA水平和总SOD活性检测显示,15μmol.L-1姜黄素能够显著降低细胞MDA水平,提高总SOD活性。此外,与H2O2组相比,15μmol.L-1姜黄素能显著下调细胞NF-κB蛋白表达水平。HO-1抑制剂Znpp-Ⅸ能够部分逆转姜黄素的上述作用。结论姜黄素可能通过上调HO-1活性,抑制NF-κB激活以及维持细胞氧化还原平衡状态,对抗H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激损伤。     

叶酸对人T淋巴细胞性白血病细胞体外的作用

目的探讨叶酸对人T淋巴细胞性白血病细胞株(CEM)细胞的作用。方法1.四氮甲基唑蓝(MTT)法检测叶酸不同浓度.不同作用时间对CEM细胞增殖影响;2光镜下观察不同浓度叶酸作用于CEM细胞24、48、72 h细胞形态变化;3.流式细胞术检测叶酸持续作用于CEM细胞48 h细胞凋亡率、细胞周期分布及细胞表面凋亡相关蛋白Bcl-2、C-myc表达;4.DNA 电泳分析凋亡细胞DNA片段化的生化改变;5.MTT法检测叶酸对甲氨蝶呤(MTX)抗肿瘤作用影响。结果1叶酸对CEM 的增殖有明显抑制作用,在(0 4～3.0)×10-4μg/L时抑制作用最明显,抑制率30%～40%;2.叶酸分别作用于CEM细胞24、48、72 h后,光镜下可见CEM细胞出现典型的细胞凋亡各阶段的变化,在浓度为(0 2～6.0)×10-4 μg/L均可见到凋亡细胞, 尤其在(0 4～3.0)×10-4 μg/L凋亡率较高;3流式细胞术分析,叶酸浓度为3 0×10-4 μg/L时诱导凋亡作用最强,凋亡率为6.19%,CEM细胞经叶酸处理后细胞周期无明显变化规律,但叶酸作用于CEM细胞48 h,在Pl荧光的直方图上可见凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰,细胞表面凋亡相关蛋白Bcl-2、C-myc表达率均明显下降;4.CEM细胞经0 4×10-4 μg/L和3.0×10-4 μg/L 叶酸处理48h,提取DNA电泳,可见典型的梯状条带;5.叶酸在浓度为(0.2～12.0)×10-4 μg/L 不影响     

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞生物学特性和体外杀瘤机制

目的 探讨树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)生物学特性和体外杀瘤机制.方法　从白血病患儿外周血分离单个核细胞,经过γ干扰素(IFN-γ)、抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)、IL-2 诱导并与树突细胞(DC)共培养后,获得DC-CIK.采用MTT法检测DC-CIK对多种白血病细胞株的杀伤作用.在予以10 mg·L-1、20 mg·L-1小鼠抗人淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)单克隆抗体处理后,流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞比例,RT-PCR与Western blot方法检测Foxp3基因表达水平.结果 诱导后的DC-CIK细胞形态规则,其对肿瘤细胞B95、Jhhan、M07e 均表现出杀伤活性.其中对B95细胞的杀伤作用较强,在效靶比为51、101 时DC-CIK对B95细胞的杀伤作用均>60%,而对Jhhan、M07e的作用不明显.在予以10 mg·L-1、20 mg·L-1LFA-1单克隆抗体处理后,与阴性对照组比较,2个处理组均使CD4+CD25+ Treg细胞表达增加(t=6.783、7.282,Pa＜0.05).RT-PCR与Western blot结果表明与阴性对照组比较,2个处理组均使Foxp3基因mRNA表达水平增加(t=11.671、10.909,Pa＜0.05),Foxp3基因蛋白表达水平增加(t=16.734、9.562,Pa＜0.05).结论　DC-CIK具有强大的体外杀瘤作用,Foxp3基因参与LFA-1介导的DC-CIK杀瘤途径,其杀瘤机制表现为CD4+CD25+Treg细胞途径受抑制.     

2E8-Genistein免疫毒素靶向杀伤Nalm-6白血病细胞作用及其机制研究

目的 观察2E8(自制鼠抗人CD19新单克降抗体)-4',5',7-三羟基异黄酮(Genistein,Gen)免疫毒素(2E8-Gen)体外靶向杀伤Nalm-6细胞作用及其机制,为靶向治疗B细胞系自血病、淋巴瘤奠定基础.方法 通过细胞形态观察、台盼蓝拒染法、细胞生长曲线比较、MTT比色法和流式细胞术.结果作用24 h,2E8-Gen对Nalm-6细胞具有明显的杀伤作用,浓度在20～100 nmol/L 9个观测点的细胞存活率[从20 nmol/L时的(71.8±7.9)%逐步降到100 nmol/L时的(16.6±12.9)%,n=3]与对照组[(100±13.9)%]相比差异均有统计学意义(P<0.05),浓度在80 nmol/L以上杀伤作用显著加强;100 nmol/L 2E8-Gen在24、48、72 h对Nalm-6细胞生长抑制率分别为82%、84%、94%,呈时间依赖关系.100 nmo/L浓度2E8-Gen组的Nalm-6细胞生长曲线与空白组、PBS组和相同浓度的纯2E8组的Nalm-6细胞生长曲线相比,差异有统计学意义(F=152.15,P=2.15×10-7),但后3组间差异无统计学意义(F=1.51,P=0.29);而100 nmol/L 2E8-Gen对CD19阴性的Molt-3细胞的生长曲线与空白组相比无明显影响(F=0.34,P=0.59).24 h 100 nmol/L 2E8-Gen组早期凋亡Nalm-6细胞阳性率[(33.45±8.77)%]明显高于对照组[(10.44±1.28)%,t=-4.39,P=0.001].结论 2E8-Gen对有CD19抗原表达的Nalm-6细胞具有良好的选择性杀伤作用,并呈时间依赖关系,浓度在80 nmol/L以上杀伤作用显著加强,凋亡机制参与了该杀伤作用.     

真菌不同接触方式对自然杀伤细胞表面受体表达的影响

目的本研究通过Transwell隔离培养体系探讨烟曲霉菌、白色念珠菌的不同菌体形态及不同接触方式对脐血来源细胞因子诱导自然杀伤(NK)细胞表面受体表达的影响,揭示NK细胞抗真菌与抗肿瘤作用机制的异同。方法利用聚碳酯膜孔径0.4μm的Transwell隔离培养系统,将实验组分为直接混合培养组(即直接接触组)和隔离组(即间接接触组);将NK细胞与真菌(烟曲霉菌孢子或菌丝、白色念珠菌孢子或菌丝)、K562细胞按10∶1比例进行直接混合和隔离培养,每组3个重复孔;培养6 h后通过流式细胞仪检测各组NK细胞胞膜受体NKG2D、TLR2及CD94/NKG2A的表达。结果烟曲霉菌、白色念珠菌的孢子和菌丝的直接接触作用均可上调NK细胞表面受体TLR2的表达(P值均<0.05),但间接接触作用对TLR2的表达无影响(P值均>0.05),真菌的直接、间接接触作用对NKG2D、CD94/NKG2A的表达均无影响(P值均>0.05);与K562细胞的直接接触可上调NK细胞表面受体NKG2D的表达(P值<0.05),但对TLR2、CD94/NKG2A的表达无影响(P值均>0.05)。结论真菌可以直接接触作用的方式通过上调TLR2的表达激活NK细胞,这与肿瘤细胞激活NK细胞的方式不同;真菌及肿瘤细胞的刺激均对NK细胞胞膜受体CD94/NKG2A的表达无影响。     

脑源性神经生长因子经自噬对胚鼠神经元缺氧损伤的保护作用

目的 探讨脑源性神经生长因子(BDNF)对胚鼠缺氧神经元是否有保护作用及其机制是否与激活自噬有关.方法 将SD大鼠胚鼠(孕17 ～ 19 d)的大脑皮质神经元在体外进行原代细胞培养,并进行神经元鉴定.培养7～10d,选取生长良好的神经元用于前后两部分实验.1.第一部分随机分为3组,对照组:不加入药物,只作缺氧处理;3-甲基腺嘌呤组(3-MA组):提前加入不同浓度的3-MA后作缺氧处理,依次为5 mmol·L-1 3-MA组、10 mmol·L-1 3-MA组、20 mmol·L-1 3-MA组;BDNF组:提前加入不同浓度的BDNF后作缺氧处理,依次为50μg· L-1 BDNF组、100 μg·L-1 BDNF组、200 μg·L-1 BDNF组.观察不同剂量3- MA、BDNF对缺氧神经元损伤的作用.之后以细胞计数盒-8(CCK-8)测定各组细胞活力,确定干预缺氧神经元的最佳药物浓度.2.第二部分分为3组,对照组:单纯缺氧,不加药物;100 μg·L-1 BDNF组:加入100 μg·L-1BDNF;10 mmol·L-1 3-MA组:加入10 mmol·L-1 3-MA.免疫蛋白印迹法检测3组缺氧神经元在不同缺氧时间点细胞自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,以LC3Ⅱ/actin的相对表达量判断自噬发生的程度.结果 1.免疫荧光鉴定:与未缺氧神经元比较,缺氧神经元突触回缩,细胞网状结构被破坏.2.神经元细胞活力:50 μg·L-1BDNF组缺氧神经元细胞活力最强,100 μg·L-1BDNF组缺氧神经元细胞活力其次(Pa＜0.05);随3-MA剂量加大,各剂量组神经元活力明显降低.3.免疫印迹:于缺氧1h、3h、5h,100 μg·L-1 BDNF组缺氧神经元的LC3表达量,均较对照组相应时间点明显上调(Pa＜0.05).结论 BDNF通过自噬途径对缺氧损伤神经元起保护作用.     

三氧化二砷抑制神经母细胞瘤细胞侵袭性实验研究

目的 探讨不同水平三氧化二砷(As2O3)对神经母细胞瘤(NB)细胞侵袭力的影响,为As2O3用于NB的治疗提供理论依据.方法 1.选取生长良好的NB LA-N-5细胞,分别按As2O3终浓度为0.75、1.50、3.0、6.0 μmol/L加药,作用24 h;2.收集贴壁细胞,计数并重新悬浮,加入到铺有人工基底膜胶的细胞侵袭小室,使每孔约为2×104 个细胞, 孵育24 h;3.取下人工基底膜胶,甲醇固定穿过膜的肿瘤细胞,苏木晶染色;4.光学显微镜观察肿瘤细胞并计数穿过膜的肿瘤细胞数量,了解细胞侵袭力的改变.结果 砷剂作用24 h后,实验组的LA-N-5侵袭细胞数较对照组显著减少(实验组穿过膜的细胞数分别为28.0±4.0,19.33±4.16,6.33±1.53,对照组平均为46.33±6.11)(P=0.013,0.003,0);实验组0.75 μmol/L与1.50 μmol/L组间结果 比较无显著性差异(P=0.06);0.75 μmol/L与3.0 μmol/L、 1.50 μmol/L与3.0 μmol/L组间比较均有显著性差异(P=0,0.007),以3.0 μmol/L组穿过膜的细胞数最少.结论 As2O3能够抑制NB细胞系LA-N-5细胞的侵袭力;3.0 μmol/L组的As2O3抑制作用最强.     

氨基乙酰丙酸光动力疗法对同种异体激活淋巴细胞选择性清除作用的研究

目的探讨氨基乙酰丙酸(ALA)对同种异体活化的外周血单个核细胞(PBMCs)的清除作用,摸索最佳ALA浓度和孵育时间。方法取正常人PBMCs进行单向淋巴细胞混合培养(MLC)5d后将其分为ALA组、光照组、ALA 光照组以及对照组。ALA组和ALA 光照组分别加入ALA终浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L。将以上MLC细胞分别孵育2、4、6h后,光照组和ALA 光照组接受410nm光源照射1h。加入原去增殖的PBMCs孵育48h。使用MTT比色法进行检测,并计算ALAPDT后的单向MLC细胞对原去增殖PBMCs的杀伤率。通过杀伤率间接比较ALAPDT清除同种异体激活细胞的效果。结果ALA 光照组对刺激细胞的杀伤率明显低于光照组、ALA组和对照组,分别为(33.0±26.5)%比(87.1±2.2)%、(89.2±2.5)%、(90.3±1.9)%(P均<0.005)。2.0mmol/L、孵育4h组杀伤率最低(P均<0.005)。结论ALAPDT能够选择性清除活化的淋巴细胞,使针对同种异体、淋巴细胞介导的免疫排斥反应减轻甚至消失,从而减轻移植物抗宿主反应。     

戊二酸致原代培养纹状体神经元神经毒性的体外研究

目的 探讨戊二酸(GA)干预体外培养纹状体神经元致神经元损伤的浓度和时间及其损伤机制.方法 体外培养新生大鼠纹状体神经元,于体外培养7 d行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色鉴定神经元纯度.纯度达90%以上,用不同浓度GA(1～50 mmol·L-1)孵育体外培养10 d的纹状体神经元24～96 h.倒置显微镜及赫斯特荧光染料33342(-/+)荧光活细胞染色后荧光显微镜观察神经元形态变化;四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测细胞线粒体功能变化;膜联蛋白-V/碘化丙啶双染流式细胞仪检测判断GA诱导纹状体神经元凋亡率及死亡率;实时定量反转录(RT)-PCR及Western blot法检测半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-3、Caspase-9表达.结果 GA处理组细胞线粒体功能受损程度呈浓度及时间依赖性改变:随着GA浓度升高,干预时间延长,神经元损伤加重.与正常对照组比较,10 mmol·L-1、25 mmol·L-1、50 mmol·L-1组GA干预24～72 h纹状体神经元活力均比正常对照组显著增高(P<0.05);1 mmol·L-1组干预72 h、96 h与正常对照组比较均明显升高(Pa<0.01).50 mmol·L-1组孵育72 h较孵育48 h细胞凋亡显著增加[(87.63±9.17)% vs (40.90±4.10)%,P<0.01];25 mmol·L-1组孵育72 h凋亡率为(24.73±2.95)%.10 mmol·L-1、25 mmol·L-1、50 mmol·L-1 GA作用神经元1 h、6 h,Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达明显增加,25 mmol·L-1、50 mmol·L-1 GA处理24 h后神经元Caspase-9、Caspase-3蛋白活化片段增加.结论 GA致纹状体神经元损伤呈浓度-时间依赖性,通过Caspase-9/Caspase-3途径诱导纹状体神经元凋亡,该机制可能与GA血症Ⅰ型大鼠纹状体退行性变有关.