壬基酚对P450arom和MIS基因表达的影响

[目的]研究壬基酚(p-nonylphenol,NP)对细胞色素P450芳香化酶基因(P450arom)和苗勒氏管抑制物基因(MIS)表达的影响,探索其对鱼类雌激素样作用的分子机制。[方法]日本比目鱼在性分化过程中能随环境因子改变而发育为不同性别,在幼鱼孵化后第30天到第100天性分化敏感期于27℃水温下,给予幼鱼投食NP 100μg/g饲料。分别对各组比目鱼生殖腺做病理组织切片,判断其性别和雌雄比例,并通过原位杂交方法结合RT-PCR分析第100天青年期鱼生殖腺中P450arom和MISmRNA的表达,观察NP对比目鱼性分化标志基因的作用。[结果]NP对27℃水温饲养下的比目鱼幼鱼有一定程度的雌性化诱导作用,成年雌性的百分比为30%,高于27℃水温对照组(0%);比目鱼幼鱼出生后第100天时对其生殖腺进行原位杂交分析显示,P450arom的mRNA在各组的雌鱼卵巢中有明显表达,但在雄鱼精巢中未见表达;而MIS的mRNA在各组的雌鱼卵巢中不表达,却在雄鱼精巢中能见到很明显的表达。RT-PCR分析也显示,P450芳香化酶的mRNA仅仅在雌鱼卵巢中表达,而MIS也仅仅在雄鱼精巢中表达,证实了原位杂交实验的结果。[结论]在日本比目鱼体内,NP染毒可以诱导P450芳香化酶mRNA表达并抑制MIS的mRNA的表达,从而对生殖腺性分化期的幼鱼发挥雌激素样干扰作用。     

双酚A对硬骨鱼性腺分化的作用机制研究

[目的]研究双酚A对硬骨鱼生殖腺性分化的影响并探索其作用机制。[方法]运用日本比目鱼由饲养水温决定性别的生物学特性,在鱼卵孵化后的第30天到第100天性分化敏感期内,利用27℃水温使幼鱼都分化成表型的雄性,同时给予幼鱼双酚A100μg/g的饲料。在第100天(青年期)和第300天(成年期),分别对各组比目鱼样本做病理组织切片,判断其性别和雌雄比例,通过原位杂交分析以及RT-PCR分析,探索它们的作用机制。[结果]双酚A对27℃水温饲养下的雄性比目鱼幼鱼都有雌性化诱导作用,100μg/g组成年鱼的雌性比例占57%,显著高于27℃对照组(0%);比目鱼幼鱼出生后第100天时,原位杂交分析显示,芳香化酶P450的mRNA在双酚A组的雌鱼卵巢中有明显表达,但在雄鱼精巢中不表达;而苗勒氏管抑制物质(MIS)的mRNA在双酚A组的雌鱼卵巢中不表达,却在雄鱼精巢中能见到极其明显的表达。RT-PCR实验也证实了原位杂交的结果。[结论]双酚A对日本比目鱼的生殖腺性分化有雌激素样的作用,雌性化作用的机制很可能是诱导了芳香化酶P450的mRNA表达且抑制了MIS的mRNA表达。     

苯并(a)芘对大鼠睾丸支持细胞连接蛋白基因表达的影响

[目的]探讨苯并(a)芘(BaP)对大鼠原代培养睾丸支持细胞的连接蛋白(connexin 43、occludin、ZO-1、N-cadherin)基因mRNA表达的影响及可能机制. [方法]取出生21d SD大鼠睾丸组织,分离支持细胞,细胞分离后,均按照1.5×106个/mL浓度接种于细胞培养板中.培养48h后,以0、1、10、50、100 μmol/L浓度的BaP同时染毒于原代培养的大鼠支持细胞12h,每个剂量设置6个平行孔.检测支持细胞活力、凋亡蛋白caspase-3活性,以及连接蛋白基因的mRNA表达. [结果]在BaP 50 μmol/L时,支持细胞活力降低(和对照组相比,P＜0.01);在BaP 10 μmol/L时caspase-3活性升高,连接蛋白connexin 43、occludin、和ZO-1基因的mRNA表达降低(和对照组相比,P＜0.05).在BaP 100 μmol/L时连接蛋白N-cadherin基因的mRNA表达降低(和对照组相比,P＜0.05).加入caspase-3抑制剂后,BaP所诱导的连接蛋白基因表达下降,且随caspase-3活性变化而发生改变. [结论]BaP能诱导大鼠支持细胞连接蛋白mRNA表达下降,BaP诱导的caspase-3活性上升是调节连接蛋白mRNA表达下降的可能机制.     

乙烯雌酚通过雌激素受体表达对男性生殖细胞影响的分析

[目的]精子形成过程中雌激素的细胞生物学作用目前为止已得到验证,本文通过乙烯雌酚的投药对男性生殖细胞产生的细胞凋亡和雌激素受体α和β之间的关系进行了研究。[方法]用DNA末端转移酶标记法检测细胞凋亡,用免疫组织化学和非放射性原位杂交的方法检测蛋白表达和受体α和βmRNA。[结果]己烯雌酚浓度在100 ng和20 mg时,引起最大的促进细胞凋亡的产生,且雌激素受体α蛋白表达无变化,但雌激素受体β蛋白表达和mRNA基因表达下降明显。[结论]己烯雌酚诱发了男性生殖细胞的凋亡,且和浓度不相关,雌激素受体β的不同表达和细胞凋亡相关。     

体外染镉对大鼠卵巢孕激素合成的影响及其机制

目的 研究镉对孕激素合成过程中类同醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)基因表达的影响及其与环磷腺苷(cAMP)的关系,为研究镉对孕激素合成影响的分子机制提供科学依据.方法 未成年Wistar大鼠皮下注射孕马血清促性腺激(PMSG)100U,48 h后取出卵巢颗粒细胞体外培养,备用.(1)取备用细胞随机分成4组,染镉剂量分别为0、10、20、40μmol/L,孵化30 min后,放射免疫方法测黄体酮、cAMP含量,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 测P450scc、StAR的mRNA表达水平.(2)再取备用细胞随机分为3组,分别为空白对照组、40μmol/L CdCl_2、l mmol/L 8-Br-cAMP(cAMP类似物)+40 μmol/L,CdCl_2,培养2 h后,测黄体酮含量及P450scc、StAR的mRNA表达水平.结果 (1)不同剂量染镉组卵巢颗粒细胞孵育液中黄体酮含量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);随着染镉剂量的增加,cAMP含量逐渐减少;各染镉剂量组StARmRNA和P450scc mRNA表达强度均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01).(2)加入1 mmol/L 8-Br-cAMP共同培养后,黄体酮含量增加,高于染镉(40 μmol/L)组和对照组.差异均有统计学意义(P<0.01);StAR mRNA和P450scc mRNA表达强度均高于40μmol/L染镉组,低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 镉可通过直接和(或)间接途径影响孕激素合成过程StAR和P450scc的表达,进而干扰孕激素的合成;镉对细胞内cAMP的影响可能是其干扰StAR和P450scc基因表达的机制之一.     

邻苯二甲酸二乙基己基酯暴露对青春期大鼠卵巢StAR、P450scc基因表达的影响

目的研究邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)对大鼠卵巢组织类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)mRNA表达的影响。方法取青春期雌性SD大鼠32只,随机分为对照组(8只)和DEHP(低、中、高)3个实验组,每组各8只。按10、100和1000 mg/(kg·d)DEHP分别对各实验组大鼠灌胃,并用溶剂(玉米油)作为对照为对照组灌胃。连续灌胃10天,取大鼠卵巢组织提取总mRNA,逆转录PCR(RT-PCR)测定StAR和P450scc基因表达水平。结果大鼠体重保持上升;高剂量组大鼠卵巢重量较对照组降低(P0.05);中剂量、高剂量组大鼠卵巢组织StAR、P450scc mRNA表达降低(P0.05,P0.01)。结论 DEHP体内暴露可能降低StAR、P450scc基因的转录水平。     

孕期暴露双酚A对子代雌性大鼠卵巢类固醇激素合成的影响

目的研究孕期双酚A(BPA)暴露对子代雌性大鼠卵巢类固醇激素合成的影响。方法选择SPF级3月龄的健康成年SD大鼠,按雌雄比为2∶1同笼配种。取妊娠大鼠20只,随机分成4组,于妊娠第5天~第20天,分别按0,10,50,250mg/(kg·d)BPA进行灌胃染毒。母鼠正常分娩,观察雌性仔鼠生长发育变化至10周龄,确定发情间期后处死动物。ELISA法测定血清中卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、孕酮(P4)、雌二醇(E2)及睾酮(T)水平;实时PCR测定卵巢中类固醇激素急性调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)、细胞色素P450-17α羟化酶(P450-17α)、17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)、芳香化酶(P450arom)mRNA的基因表达。结果出生28~36d期间,50和250mg/kg组体质量与对照组比较明显增加,差异有统计学意义(P0.05);各剂量组与对照组相比,T水平明显下降,差异有统计学意义(P0.05);50和250mg/kg组与对照组相比,LH、FSH、E2水平明显减少,差异有统计学意义(P0.05));各剂量组卵巢中17β-HSD mRNA的基因表达与对照组比较明显降低,差异有统计学意义(P0.05);50和250mg/kg组P450arom mRNA的基因表达与对照组比较明显降低(P0.05),差异有统计学意义。结论孕期暴露BPA对子代雌性大鼠卵巢中类固醇激素合成酶的基因表达有一定的影响,可能影响类固醇激素合成,进而影响下丘脑-垂体-卵巢轴的正常调节。     

Aroclor1254对斑马鱼胚胎发育、肝脏组织结构及其卵黄蛋白原基因的影响

[目的]使用脊椎动物模型斑马鱼评价Aroclor1254对斑马鱼胚胎发育、肝脏组织结构以及卵黄蛋白原（vtg）基因表达的影响,为Aroclor1254的毒性效应研究提供基础数据,以期选择Aroclor1254污染的敏感指标,进行早期污染监测和预警。[方法]将斑马鱼及其胚胎暴露在不同浓度的Aroclor1254溶液中,运用斑马鱼胚胎发育技术和组织病理观察法以及实时定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Aroclor1254对斑马鱼胚胎发育的影响、形态学的改变和卵黄蛋白原（vtg）基因的表达。[结果]斑马鱼胚胎试验显示,3．3、6．5、10．0mg／L Aroclor1254等均可诱导肝变性、肝脏发育不全,其中3.3mg／L Aroclor1254诱导斑马鱼卵黄部分变性,6．5、10．0mg／L Aroclor1254诱导斑马鱼卵黄大部分或者全部变性。肝脏组织病理观察发现,2．0、10．0、50．0μg/L Aroclor1254肝细胞肿大,胞质疏松,空泡明显增加,细胞质中可见脂沉积。vtgmRNA的表达在Aroelor1254暴露的斑马鱼个体中产生了显著的改变,雌鱼中表达普遍呈抑制趋势,其中以2．0μg／L抑制现象最明显,而在雄鱼中该剂量组vtg表达量被显著诱导。[结论]研究表明Aroclor1254对斑马鱼及其胚胎具有毒性效应,肝脏是产生毒性效应的重要靶器官。     

二氧化硅对人呼吸道上皮细胞及巨噬细胞内IL-8和TNFα的诱导作用

[目的]探讨二氧化硅对人支气管上皮细胞（BEAS-2B）、Ⅱ型肺泡上皮细胞（A549）及巨噬细胞（THP-1）内白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子（TNFα）基因表达的诱导作用。[方法]将100μg/mL二氧化硅悬液与上述3种细胞分别温育4h,提取总RNA,用定量PCR技术测定生理盐水（对照组）与二氧化硅染毒组细胞内IL-8及TNFα mRNA表达水平。[结果]与对照组相比,在同一实验剂量及刺激时间（100μg／mL,4h）下,二氧化硅刺激可致THP-1内IL-8及TNFα mRNA表达水平分别升高至76．79倍及4．49倍;BEAS-2B内IL-8及TNFα mRNA表达水平分别升高至3．46倍及2．33倍;A549内IL-8及TNFα mRNA表达水平分别升高至1．64倍及1．52倍。[结论]二氧化硅可提高矽肺发病相关细胞因子IL-8及TNFα基因的表达水平。二氧化硅的上述作用,以对THP-1内IL-8 mRNA的诱导作用为最强。     

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯暴露对青春期大鼠卵巢孕酮分泌及相关基因表达的影响

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)对青春期雌性大鼠血清孕酮分泌及卵巢组织相关类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)和胆固醇侧链裂解酶(P450scc)mRNA表达水平的影响。方法将32只健康6周龄清洁级SD雌性大鼠按体重随机分为4组,分别为对照(玉米油)组和10、100、1000mg/kg DEHP染毒组,每组8只。采用灌胃方式进行染毒,每天1次,连续染毒10 d。测定大鼠血清孕酮水平及卵巢组织StAR和P450scc mRNA的表达水平。结果与对照组比较,仅1 000 mg/kg DEHP染毒组大鼠血清孕酮水平明显升高,100、1 000 mg/kg DEHP染毒组大鼠卵巢组织StAR、P450scc mRNA的表达水平明显下降,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论 DEHP暴露可通过降低StAR、P450scc mRNA的转录而增加大鼠孕酮合成水平。