基于基因组学的日本血吸虫序列分析平台的构建及应用

[目的]构建基于基因组学的日本血吸虫序列分析平台。[方法]基于工作站和Linux操作系统,利用公开的日本血吸虫或相关资源,收集有关生物信息学序列分析工具,并自行编写相关软件实现多种资源的有机整合。[结果]构建了本地化的日本血吸虫序列分析平台,在此基础上,自主设计了日本血吸虫EST序列的电子延伸系统、基于日本血吸虫EST数据库的同源全长cDNA序列检索系统和序列自动注释系统等。[结论]所构建的序列分析平台不仅可以完成常规的序列分析工作,还可成功地完成EST序列的电子延伸,同源全长cDNA序列的检索以及序列的自动注释,它可对大规模日本血吸虫序列进行快速、方便、高效的分析,为充分利用血吸虫基因组开展疫苗研究和新药开发提供了有效的技术手段。     

日本血吸虫thioredoxin基因的克隆和表达

目的 结合分子生物学和生物信息学方法筛选鉴定日本血吸虫新基因。方法 从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，大陆株)成虫cDNA库中获取表达序列标签(expressed sequence tag，EST)，用电子拼接的方法延伸序列，用NCBI提供的BLAETx程序和Genbank数据库进行同源性分析以筛选基因；设计特异性引物从日本血吸虫成虫mRNA中扩增筛选基因并预测和分析；扩增产物克隆到原核表达载体并表达。结果 筛选出日本血吸虫Thioredoxin全长基因并对其进行了序列分析，克隆全长cDNA至PET原核载体并表达成功。结论 结合EST、电子延伸和传统的分子生物学方法是高效筛选S.jiaponicum功能基因的有效策略。     

日本血吸虫(中国大陆株)成虫表达序列标签的获取及分析

随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST（ex-pressed　sequence　tag）,获得的EST通过 BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GeneBank数据库进行比较及同源性分析。结果在随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库150个单个重组克隆中,获得了56个有价值的EST序列,其中47个在GeneBank dbEST中登录。7.1％EST序列为日本血吸虫已知序列,3.6％为日本血吸虫同源序列,曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占25％,未知序列占55.6％。通过同源性分析可知,大多数同源序列具有看家基因功能。另外,也发现了几个有价值的基因。     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosomajaponicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, eIF2α) 基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2 质粒上的5'端测序引物相匹配的PCR下游引物,从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上,并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI 站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索;用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因,核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87%和79%,编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因,编码eIF2α亚基,全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的 对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosoma japonicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法 将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行测序，测序结果经BLAS Tn程序搜索，发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit，elF2α)基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2质粒上的5′端测序引物相匹配的PCR下游引物，从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上，并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索；用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果 发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因，核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87％和79％，编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论 用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因，编码eIF2α亚基，全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

IRM-2小鼠cDNA文库的全长cDNA序列分析

目的分析IRM-2小鼠全长cDNA文库的cDNA序列。方法根据IRM-2小鼠的21条EST,从IRM-2小鼠全长cDNA文库测定基于该21条EST序列PCR扩增的全长cDNA序列,通过与GenBank基因库同源序列信息比对,分析全长cDNA序列和性质。结果根据21对引物PCR产物的拼接,获得5条全长cDNA序列,与小鼠已知基因不同源,而且得到了可能编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的性质。结论 5条全长cDNA序列提示IRM-2小鼠体内可能存在辐射抗性相关基因,为进一步分离和鉴定辐射抗性相关基因奠定了基础。     

Generation and analysis of 113 adult stage Schistosoma japonic um (Chinese strain) expressed sequence tags

目的：运用表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）技术快速、节约、有效地获得有关日本血吸虫（中国大陆株）成早表达基因的知识。方法：随机挑取日本血吸虫（中男大陆株）成虫cDNA库单个重组克隆进行部分测序以获得EST,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GeneBank数据库进行比较及同源性分析。结果：本研究共随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库单个重组克隆314个,获得了132个有EST价值的序列,其中113个成功在GeneBank dbEST中登录。7.6％有EST价值的序列为日本血吸虫已知序列,4.5％为日本血吸虫同源序列。曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的23.5％,未知序列占57.6％。通过同源性分析,发现了几个令人感兴趣的基因,另外,大多数同源序列具有看家基因功能。结论：EST方法具有快速、有效地获得有关日本血吸虫（中国大陆株）成虫表达基因的知识的价值。     

日本血吸虫（大陆株）成虫基因表达谱的研究

报告作1998年至2000年有关日本血吸虫（大陆株）成早基因表达谱研究的结果，主要扬：已测定551条EST，其中519条EST已送入国际基因数据库（GenBank/dbEST），并获得了GenBank的登录号。经同源整合后，519长EST序列归类为388个基因序列，其中，24条（6.19％）为日本血吸虫已知基因序列；18条（4.64％）EST与曼长血吸虫已知基因序列同源，90条（23.19％）EST与其它生物的已知基因序列同源，同源基因包括精氮酸酶、酰胺酸酶、微纤维蛋白、肌动蛋白、细胞色素C氧化酶、二硫异构酶、加长因子、热激蛋白70、Y盒结合蛋白和抗凋亡因子等。其余的256条（65.98％）EST在Gen-Bank中未发现有已知基因的同源序列。将非日本血吸虫同源序列EST或未检索到同源序列的EST初步定义为日本血吸虫亲基因/未知基因序列EST，共364条。已克降日本血吸虫精氮酸酶基因、Y-盒结合蛋白基因和抗凋亡-1因子3个新基因的全长cDNA，其GenBank的登录号分别为AF402615、AF367371和AF333765。本研究结果丰富了血吸虫基因组数据，并为进一步筛选日本血吸虫疫苗候选基因或药物靶位提供了科学依据。     

日本血吸虫(大陆株)成虫基因表达谱的研究

报告作者 1998年至 2 0 0 0年有关日本血吸虫 (大陆株 )成虫基因表达谱研究的结果 ,主要包括 :已测定 5 5 1条EST ,其中 5 19条EST已送入国际基因数据库 (GenBank/dbEST) ,并获得了GenBank的登录号。经同源整合后 ,5 19条EST序列归类为 388个基因序列 ,其中 ,2 4条 (6 19%)为日本血吸虫已知基因序列 ;18条 (4 6 4 %)EST与曼氏血吸虫已知基因序列同源 ,90条 (2 3 19%)EST与其它生物的已知基因序列同源 ,同源基因包括精氨酸酶、酰胺酸酶、微纤维蛋白、肌动蛋白、细胞色素C氧化酶、二硫异构酶、加长因子、热激蛋白 70、Y盒结合蛋白和抗凋亡因子等。其余的 2 5 6条 (6 5 98%)EST在Gen Bank中未发现有已知基因的同源序列。将非日本血吸虫同源序列EST或未检索到同源序列的EST初步定义为日本血吸虫亲基因 /未知基因序列EST ,共 36 4条。已克隆日本血吸虫精氨酸酶基因、Y 盒结合蛋白基因和抗凋亡 1因子 3个新基因的全长cDNA ,其GenBank的登录号分别为AF4 0 2 6 15、AF36 7371和AF33376 5。本研究结果丰富了血吸虫基因组数据 ,并为进一步筛选日本血吸虫疫苗候选基因或药物靶位提供了科学依据。     

日本血吸虫中国大陆株琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白的克隆与表达

目的：克隆日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白（sjSDISP）全长编码基因,并对所获基因在大肠杆菌中进行表达。方法：根据基因库中SjSDISP对应的EST（BU804141）以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgtl1多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接成全长cDNA,将其克隆到表达载体pGEX-4T-1上,经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶消化、PCR和测序鉴定后,选择阳性克隆进行表达及Western印迹分析。结果：获得1071bp全长cDNA,其理论推导为编码278个氨基酸残基的蛋白质。SjSDISP基因在大肠杆菌BL2．中获得良好表达。该融合表达产物相对分子质量约为56kD,且能被日本血吸虫成虫抗原免疫血清特异识别。结论：编码日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达获得成功。     

日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶的生物信息学鉴定与分析

目的 鉴定日本血吸虫中存在的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,分析其蛋白结构特征.方法 采用双向同源比对、结构域搜索和系统发育分析等生物信息学手段,在已有转录组和蛋白质组数据基础上鉴定日本血吸虫的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,并采用同源建模方法获得日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶的结构特征.结果 获得了2条腺嘌呤磷酸核糖转移酶的同源蛋白序列;分析了这2条序列的EST丰度、理化性质及蛋白三维结构等信息.结论 日本血吸虫至少存在2个腺嘌呤磷酸核糖转移酶的异构体.     

日本血吸虫新基因—腺苷酸激酶基因的发现与克隆

目的：将用表达序列标签（expression sequence tag,EST)策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因－腺苷酸激酶（adenylate kinase,AK)cDNA克隆到表达质粒，pET32a( )上，为下一步研究该基因的功能做准备，方法：将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行,测序，用BLASTn程序搜索测序结果，根据表达质粒pET32a( )上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物，将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上，将重组T载体经EcoR I/Xho I双酶切后切下的SjAK基因导入原核一表达质粒pET32a( )中，结果：本研究所发现的新基因与曼氏血吸虫AK基因的同一性达86％，PCR产物的片段长度与预期大小一致，重组T载体及表达质粒经EcoR I及Xho I双酶切后有具有与目标片段工度相符的插入片段，结论：发现日本血吸虫的cDNA与曼氏血吸虫AKcDNA高度同源，并且成功地构建出重组表达质粒pET32a( )-SjAK。     

日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosorna japonicum,Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的防治提供药物靶标或候选疫苗。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶新基因的cDNA序列(AY226980)，全长594bp，编码157个氨基酸，编码蛋白与人类或鸽、鸡、鼠及果蝇的核苷二磷酸激酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的cDNA序列。