浙江省病毒性脑炎病原柯萨奇B1病毒分子特征研究

目的:为了查明引起2008-2009年浙江省疑似病毒性脑炎的病原,分析病原的分子特征。方法:采用Hep-2和RD细胞从疑似患者脑脊液样本中分离肠道病毒,对分离株扩增VP1基因,测序并进行同源性与进化分析。结果:从患者11份脑脊液样本中分离到4株柯萨奇B1病毒(CVB1);测得VP1基因全长为834核苷酸(nt),无插入和缺失,推导编码278个氨基酸(aa)。4株浙江CVB1分离株(ZJ/CVB1)之间在VP1区nt和aa的同源性分别为96.3%~99.9%和100%。浙江CVB1分离株BLAST比对nt同源性最高的毒株为2006年山东株(SD/168/06),同源性为98.7%;与CVB1原型株(Conn-5/86)的nt同源性为78.9%。VP1区氨基酸进化树显示浙江CVB1分离株在CVB1 Clade3进化支上,与浙江株亲缘关系最近的毒株为山东CVB1株,均在同一进化支上。结论:从病毒分离结果证实浙江省疑似病毒性脑炎是由肠道病毒CVB1引起,2008-2009年在浙江循环的CVB1病毒之间没有明显差异,浙江CVB1流行株与山东株亲缘关系最近。     

浙江省2002年2例柯萨奇B5病毒VP1区基因特性分析

目的：研究2002年浙江省病毒性脑膜脑炎病原CoxB5病毒VP1区的基因特征。方法：用Hep-2和RD两种细胞对患者脑脊液和粪便标本进行病毒分离，提取病毒RNA，再用RT—PCR扩增病毒VP1区基因片断，对纯化产物进行核苷酸序列测定，采用DNAMAN和Bioedit软件进行分析处理。结果：两株CoxB5病毒的VP1区核苷酸长度均为849bp，二者核苷酸同源性为98.7％，氨基酸同源性达100％。结论：浙江省两株CoxB5病毒为同一性状毒株，它们的亲缘关系与侵犯中枢神经系统的CoxB5的原型株AF—114383CoxB5(Swend—16—1998)最为接近。但这两株CoxB5毒株与欧美国家相比，核苷酸同源性仅为79.3％～81．5％，氨基酸同源性为96.82～97．53％，核苷酸序列有了18.5％～20.7％的变异，与国外报道的CoxB5株之间存在一定的差异。这两株病毒与安徽明光市2001年从无菌性脑膜脑炎病人粪便中分离到的两株CoxB5病毒MG—18—2001和MG—39—2001在同一小分枝上，核苷酸同源性达98．5％～98．9％，氨基酸同源性达99．29％～99.65％。     

龙岩市柯萨奇病毒B5型基因特征分析

目的分析龙岩市2012年病毒性脑炎病例柯萨奇B组病毒5型(CVB5)的基因特征。方法采集患者脑脊液进行病毒分离,用中和试验确定毒株血清型,用008-013(GCRTGCAATGAYTTCTCWGT/GGIGCRTTICCYTCIGTCCA)和012-011(ATGTAYGTICCICCIGGIGG/GCICCIGAYTGITGICCRAA)两对引物分段扩增VP1区,进行序列分析。结果从152份患者脑脊液标本中,分离出2株CVB5,其部分VP1编码区序列长度为469/434个核苷酸,编码156/144个氨基酸。2株核苷酸同源性为92%,氨基酸同源性86%;与原型株Faulkner的核苷酸同源性73%~77%,氨基酸同源性82%~91%。与2011年3株龙岩分离株的核苷酸同源性83%~92%,氨基酸同源性78%~93%。系统进化树分析显示,2株龙岩分离株同属D组基因型。结论龙岩市2012年流行的CVB5病毒株出现了较大变异,患者可能出现神经系统并发症。应加强对CVB5株所致疾病的监测及其遗传进化的研究,为相关疾病防控提供依据。     

福建省龙岩市2011年病毒性脑炎病例埃可病毒30型分析

目的分析龙岩市2011年病毒性脑炎病例埃可病毒[人肠道致细胞病变孤儿病毒,Enteric Cytopathogenic Human Orphan(ECHO)Virus]30型(ECHO30型)特征。方法对龙岩市2011年某医院病毒性脑炎住院病例采集脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)进行病毒分离、血清中和试验定型;选取4株ECHO30型分离株,测定VP1编码区序列,与国内外其他病毒株进行比较。结果从142份患者CSF标本中分离到ECHO30型20株、ECHO11型7株、ECHO6型10株。4株ECHO30型VP1编码区序列长度为606个核苷酸,编码202个氨基酸。4株的核苷酸和氨基酸同源性分别为97%~100%和88%~100%。与2000年Bastianni原型株的核苷酸和氨基酸同源性分别为81%~82%和81%~93%。与2010年山东省、2011和2012年福州市流行毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为96%~100%和87%~100%。系统进化树分析显示,4株龙岩分离株同属基因型(Genotype)Ⅱ。结论龙岩市2011年病毒性脑炎病例的ECHO_(30)型为GenotypeⅡ。     

开封地区病毒性脑炎病原分离株Echo30的分子流行病学分析

目的研究开封地区2008年病毒性脑炎病原分离株Echo30VP1区基因特征及其分子流行病学特点。方法对开封地区2008年病毒性脑炎监测病例脑脊液标本中分离到的8株Echo30病毒进行VP1区全基因序列测定,与GeneBank上发表的ECHO30型VP1区进行同源性比较,通过构建进化树对其进行遗传进化分析。结果所测8株Echo30VP1区基因全长均为876bp,翻译的氨基酸全长292aa。8株病毒VP1区核苷酸同源性为92.8%～99.7%,氨基酸同源性为93.0%～99.7%;与GenBank相关毒株基因组序列比对显示开封地区2008年分离株均与江苏省2003年分离株同源性较高;进化分析表明属于第7组。结论 2008年开封地区Echo30分离株与2003年江苏省分离株亲缘关系最近,可能具有相同来源。     

引发脑膜脑炎流行的柯萨奇B5病毒的序列分析

安徽省明光市 2 0 0 1年 6～ 7月发生了一起无菌性脑膜脑炎流行 ,从病人脑脊液和粪便标本中分离到 17株柯萨奇 (Coxsackie ,Cox .)B5病毒 ,血清学实验证明所分离的病毒为此次无菌性脑膜脑炎流行的病因。对其中的 2株病毒 (MG/ 18/ 2 0 0 1和MG/ 39/ 2 0 0 1)测定了VP1区全基因核酸序列并做了比较分析。结果显示 :所测 2株病毒VP1区核苷酸长度均为 849bp ,两毒株之间仅有 1个核苷酸不同。这两株病毒与从 (GenBank)检索到的Cox B5病毒的核苷酸同源性约为 82 %,氨基酸序列亦有改变。从进化树上看 ,这两株病毒同在一个小分支上 ,与它们亲缘关系最近的是从一疑似脊髓灰质炎的儿童分离到的AF114383 -Cox B5病毒 ,而与从手足口病患者分离到的X6 770 6-Cox B5病毒相对较远。表明此次脑膜脑炎的病因病毒与同是侵犯中枢神经系统的Cox B5的原型株 -AF114383 -Cox B5病毒亲缘关系最近 ,但核苷酸已经发生了 >18%的变异 ,可以认为其是Cox B5新亚型病毒。     

柯萨奇B5病毒引起山东省一起无菌性脑膜炎暴发的鉴定及其亲缘进化分析

目的 鉴定引起2005年山东省兖州市一起无菌性脑膜炎暴发的病原体,并对分离的柯萨奇B5病毒(CVB5)进行基因特征分析.方法 从兖州市无菌性脑膜炎暴发期间部分住院患者中采集78份粪便标本和58份脑脊液标本进行病毒分离和血清型鉴定;同时对其阳性分离物采用反转录-聚合酶链反应进行分子定型,对其中的CVB5进行全长VP1区核苷酸序列测定和亲缘进化分析.结果 78份粪便标本和58份脑脊液标本的病毒分离率分别为38.5%(30/78)和48.3%(28/58).58株阳性分离物的血清型鉴定和分子定型结果显示,其中54株为CVB5,2株为ECHO24,CVB3和CVA9各1株.病原学结果显示引起此次无菌性脑膜炎暴发的病原体主要为CVB5.同源性分析显示,CVB5分离株与2002年浙江分离株(Zhejiang/12/02株)在核苷酸水平上同源性最近,为97.5%～97.8%;与CVB5原型株(Faulkner株)相比核苷酸同源性为78.3%～78.6%.VP1区亲缘进化树显示CVB5可以分为A、B、C、D 4个基因型,引起本次暴发的CVB5属于基因型D.结论 CVB5是引起兖州市无菌性脑膜炎暴发的病原体.优势基因型的变迁可能是造成无菌性脑膜炎反复暴发的因素之一.     

盐城市1起病毒性脑炎疫情的肠道病毒Echovirus18VP1基因分子特征

目的对盐城市1起病毒性脑炎聚集性疫情分离的Echovirus18(E-18)型肠道病毒进行VP1基因分子进化特征分析。方法通过实时荧光RT-PCR方法,对2019年盐城市病毒性脑炎聚集性疫情标本进行肠道病毒的检测,对非EV71或CVA16其他肠道病毒进行分子分型,采用RT-PCR扩增E-18型肠道病毒VP1基因并测序,采用生物信息软件从核苷酸、氨基酸和分子进化3个层面进行分子特征分析。结果该起病毒性脑炎聚集性疫情是由E-18型肠道病毒感染引起,其6例病例;肛拭子肠道病毒核酸通用阳性4例,阳性率66.67%;均为轻症,全部治愈。4株E-18型肠道病毒株VP1基因片段均未见核苷酸的插入或者缺失,长度均为861bp、编码287个氨基酸,其核苷酸、氨基酸同源性分别为99.9%～100.0%和100.0%;与2019年E-18型手足口病盐城株(151/HFMD/JSYC/2019)VP1基因核苷酸、氨基酸同源性分别为99.5%～99.7%和100.0%;与原型株Metcalf VP1基因核苷酸、氨基酸同源性分别为79.0%～79.1%和93.4%。遗传进化树显示,2019年盐城市4株病毒性脑炎代表株与1株手足口病代表株聚集成簇,构成1个独立进化分支,属于C2基因亚群分支毒株。与原型株Metcalf相比,盐城市4株病毒性脑炎代表株涉及19个氨基酸位点的变异,变异率为6.62%,与1株手足口病代表株在VP1基因B-C loop区域发生了R84N氨基酸位点的变异。结论该起病毒性脑炎聚集疫情由E-18型肠道病毒引起,该病毒属于C2基因亚群优势进化分支,与本地手足口病代表株可能有共同的来源。     

急性出血性结膜炎病原学分子特征分析

目的 检测分析引发浙江省急性出血性结膜炎(AHC)爆发流行的病原学及毒株的分子特征.方法 采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法直接从AHC患者眼拭子样本中检测肠道病毒(EV)和柯萨奇病毒A24变异株(CA24v)核酸;用Hep-2细胞分离病毒,对阳性分离物扩增病毒VP1基因和3C区片段,测定核苷酸序列,应用DNAMAN和MEGA软件进行同源性和进化分析.结果 3株浙江CA24v分离株VP1基因全长915个核苷酸(nt).3C区全长549 nt,均没有nt的插人和缺失;浙江分离株Zhejiang/13/08与CA24v原型株EH24/70在VP1和3C区核苷酸同源性分别为85.3%和86.5%,与2005年新加坡分离株Singapore/DSO-26/05和2007年广东分离株Guangdong/332/07株在VP1区和3C区的核苷酸同源性分别为97.0%～99.1%和96.7%～99.5%;浙江CA24v分离株在3C区进化树的Ⅲ基因亚型B分支上(GⅢ/B),在VP1进化树的CA24v Group2分支上.结论 引起2007-2008年浙江省急性出血性结膜炎爆发流行的病原为CA24v GⅢ亚型,该病毒最有可能来源于新加坡.     

浙江省2013年病毒性脑膜脑炎病原学及分子流行病学特征

目的 分析2013年浙江省监测点病毒性脑膜脑炎病原学及分子流行病学特征。方法 从浙南和浙北监测点医院采集疑似病毒性脑膜脑炎患者脑脊液和/或粪便样本,用荧光定量PCR方法检测样本中人类肠道病毒(HEV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)、腮腺炎病毒(MuV)、单纯疱疹病毒(HSV)和巨细胞病毒(CMV)核酸,采用人横纹肌瘤细胞(RD)和人喉表皮样癌细胞(Hep-2)分离HEV,对HEV阳性分离物或核酸阳性样本扩增VP1基因并测序,然后进行同源性与进化分析。结果 在229例患者共计239份样本中检测到病毒核酸阳性92份(38.5%),其中HEV阳性87份,MuV、HSV和CMV阳性分别为1、2和2份;87份HEV中柯萨奇病毒(CV)38份和埃可病毒(E)49份;239份样本中分离到56株(23.4%)HEV;在31份HEV核酸阳性但病毒分离阴性的脑脊液样本中,检出最多的为E9(9份),其次为CVA9(8份);HEV血清型分别为CVA9、CVB4、CVB5、E6、E7、E9、E11、E14、E16、E25和E30;浙南监测点优势流行株为CVB5,浙北为E6。VP1区进化分析显示,浙江省HEV均为B组EV。结论 2013年浙江省监测点病毒性脑膜脑炎的主要病原为HEV-B,涉及11个血清型,首次在浙江省分离到E7;浙南优势流行株为CVB5,浙北为E6;核酸检出率明显高于病毒分离率,采用常规EV分离法存在漏检E9和CVA9的风险。     

2006-2020年四川省急性弛缓性麻痹病例中柯萨奇B组病毒的基因特征分析

目的 了解2006-2020年四川省急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中各血清型柯萨奇B组病毒(Coxsackie virus B,CVB)的时空分布情况及基因特征,探索CVB在四川省的传播动态.方法 对AFP病例标本进行细胞分离培养,血清学鉴定,全VP1基因序列的测定及同源性...     

Coxsackievirus B5 virus-like particle vaccine exhibits greater immunogenicity and immunoprotection than its inactivated counterpart in mice

Coxsackievirus B group 5 (CVB5) represents one of the major pathogens that cause diseases such as hand, foot and mouth disease (HFMD) and aseptic meningitis et al. Currently, no specific drugs and vaccines are available, and a safe and effective CVB5 vaccine is of great value for control of the diseases. In this study, CVB5 P1 precursor and 3CD protease were co-expressed in Sf9 cells by using a baculovirus expression system. The P1 was processed by 3CD and self-assembled into CVB5 virus-like particles (VLPs). VP1 and VP3 capsid proteins of CVB5 could be detected by SDS-PAGE and Western blotting. Transmission electron microscopy revealed that the CVB5 VLPs were spherical particles with a diameter of about 30 nm, mimicking wild-type CVB5 virus. Our study showed that the total IgG and neutralizing antibodies induced by CVB5 VLPs were higher than those induced by inactivated vaccine. More importantly, the CVB5 VLPs conferred full protection to the CVB5-challenged suckling mice via passive immunity while protection efficiency of the inactivated vaccine was only 80%. The CVB5 VLPs vaccine could protect the limb muscles, brain, and heart tissues of suckling mice from CVB5-induced damage. These results demonstrated that the CVB5 VLPs vaccine possessed stronger immunogenicity and provided more robust immunoprotection than the inactivated CVB5 vaccine, suggesting that the CVB5 VLPs promise to be a CVB5 vaccine candidate in future.     

A nucleotide sequence comparison of coxsackievirus B4 isolates from aquatic samples and clinical specimens.

Ten coxsackievirus B4 (CVB4) strains isolated from clinical and environmental sources in Northern Ireland in 1985-7, were compared at the nucleotide sequence level. Dideoxynucleotide sequencing of a polymerase chain reaction (PCR) amplified fragment, spanning the VP1/P2A genomic region, classified the isolates into two distinct groups or genotypes as defined by Rico-Hesse and colleagues for poliovirus type 1. Isolates within each group shared approximately 99% sequence identity at the nucleotide level whereas < or = 86% sequence identity was shared between groups. One isolate derived from a clinical specimen in 1987 was grouped with six CVB4 isolates recovered from the aquatic environment in 1986-7. The second group comprised CVB4 isolates from clinical specimens in 1985-6. Both groups were different at the nucleotide level from the prototype strain isolated in 1950. It was concluded that the method could be used to sub-type CVB4 isolates and would be of value in epidemiological studies of CVB4. Predicted amino acid sequences revealed non-conservation of the tyrosine residue at the VP1/P2A cleavage site but were of little value in distinguishing CVB4 variants.     

2015-2016年贵州省手足口病非EV71、非CVA16肠道病毒型别鉴定和分析

目的 探讨2015-2016年贵州省手足口病非EV71(Enterovirus 71,EV 71)、非CVA16(Coxsackievirus A16,CVA16)肠道病毒株的病原构成及优势型别。方法 共收集2015-2016年贵州省儿童手足口病疑似患者肛拭子350例标本,应用实时荧光定量PCR法筛选出非EV71、非CVA16型肠道病毒,采用 RT-PCR法扩增病毒VP1区序列,PCR阳性扩增产物进行测序,对测得序列进行型别鉴定并与国内外各型代表株进行核苷酸同源性分析,构建系统进化树。结果 从收集到的手足口病疑似患者肛拭子标本中,共分离到21株其他肠道病毒,分别为:CVA5、CVA7、CVA9、CVB3(Coxsackievirus B3,CVB3)、 CVB4 、E11(Echovirus11,ECHO11)、 E17各1株,CVA10 、CVB1各2株,CVB5、E7各5株。通过系统发育树揭示,分离到的同型别毒株之间具有同源性,而非同型别的毒株与国内外各代表株之间具有同源性。结论 贵州省引起手足口病的非EV71、非CVA16型肠道病毒型别分布较广,包括CVB组,CVA组和ECHO病毒,其中CVB5、E7为非EV71、非CVA16型肠道病毒主要病原体。     

Immunogenicity of a DNA vaccine for coxsackievirus B3 in mice: protective effects of capsid proteins against viral challenge

Coxsackievirus (CVB) 3 induces viral myocarditis and ultimately dilated cardiomyopathy (DCM). However, there is no vaccine in clinical use. We constructed recombinant CVB3 plasmids using a highly effective mammalian expression vector and evaluated their immunogenicity in vivo on the basis of survival rate. Four recombinant plasmids were constructed, which encode CVB3 capsid proteins (VP1 or VP3) or VP1 partial proteins (VP1-1 or VP1-2), and used to immunize BALB/c mice by electroporation. Although VP1, VP3, VP1-1, and VP1-2 induced specific antibodies against the corresponding proteins in mice, neutralizing antibodies were not present in the sera. These recombinant plasmids, except VP1-1 (12.5%), dramatically increased the survival rate in mice at 46 days after challenge (42.9-75.0%, p<0.05). VP3 (75.0%) protected mice against viral infection and the middle regions of VP1 (VP1-2, 50.5%) conferred a protective effect like that conferred by VP1 (42.9%), suggesting that the epitopes in VP3 as well as in the middle of VP1 protect against CVB3 infection in vivo. In conclusion, some recombinant CVB3 plasmids used in this study reduced the destruction of myocytes and improved the survival rates in mice immunized and challenged compared with the control. Thus, pCA-VP3 as well as pCA-VP1 are good candidates for a CVB3 DNA vaccine.     

Vaccination with coxsackievirus B3 virus-like particles elicits humoral immune response and protects mice against myocarditis

Coxsackievirus B3 (CVB3), along with other enteroviruses, is involved in about 50% of myocarditis cases and in the pathogenesis of dilated cardiomyopathy. Prevention of CVB3 infection is therefore highly desirable. Virus-like particles (VLPs) are structurally similar to native virus particles and therefore are far better immunogens than any other subunit vaccines. Recombinant baculoviruses carrying either the intact, entire coding region of CVB3 or the four individual coding regions for virus proteins 1-4 (VP1-4) were constructed. Expression of CVB3 capsid proteins in insect cells infected with recombinant baculovirus was detected by immunofluorescence and Western blot analysis. Sucrose gradient ultracentrifugation fractions of the infected cell lysates contained peaks of CVB3 antigen with an approximate density of 1.14g/ml. Electron microscopy demonstrated the presence of VLP in these sucrose fractions. The CVB3 VLP was non-infectious in tissue culture. SWR (H-2(q)) mice vaccinated with CVB3 VLP developed antibodies to CVB3 capsid proteins after the first boost. Antibody titre was comparable to the level induced by an attenuated CVB3 vaccine. Vaccinated animals were protected from myocarditis when subsequently challenged with cardiovirulent CVB3 (chimera-2). Vaccination with VLP produced from the complete CVB3 coding region gave a greater immune response and afforded better protection than with VLP from the quadruple expression vector. These results demonstrate that CVB3 capsid proteins expressed in insect cells have the intrinsic capacity to assemble into non-infectious VLP, which afforded protection from CVB3 infection to mice when used as a vaccine.     

浙江省2002－2018年病毒性脑膜炎病原学与分子流行病学特征

目的 了解2002-2018年浙江省病毒性脑膜炎病原学及分子流行病学特征。方法 从设立的监测点医院采集疑似病毒性脑膜炎患者样本2 173份,其中脑脊液1 718份、粪便455份,用荧光定量PCR方法检测脑脊液中人类肠道病毒(HEV)、腮腺炎病毒(MuV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)和乙型脑炎病毒(JEV)核酸,粪便样本只检测HEV;用ELISA方法检测脑脊液中上述5种病毒IgM抗体;对HEV核酸阳性样本扩增病毒VP1基因和测序,确定病毒型别并进行进化分析。结果 在2002-2018年2 173份样本中检出HEV核酸阳性871份(40.1%),其中脑脊液1 718份、阳性654份(38.1%),粪便455份、阳性217份(47.7%);871份HEV核酸阳性样本,VP1扩增测序阳性670份,其中HEV-A 5份、HEV-B 665份,涉及23个病毒血清型,分别为柯萨奇病毒(CV)A组CVA4、CVA6、CVA9、CVA10,CVB组1~5, 埃可病毒(EchoV;E)E3、E4、E6、E7、E9、E11、E14、E16、E18、E21、E25、E30、E33和肠道病毒(EV)-71,位于前3位的分别为E30、E6和CVB5,该3个血清型间隔若干年呈现病毒活动性增强的趋势。从2012-2015和2018年795份脑脊液中检出HEV核酸阳性374份、MuV 6份、HSV和CMV均为5份,对其中的368份脑脊液同时检测5种病毒IgM抗体,HEV抗体阳性2份、JEV 6份、MuV 1份。670份HEV中除1份EV-71外,EchoV 517份、CV 152份,两者之比为3.4:1,两类病毒间隔3~5年存在优势株交替变化的趋势。VP1进化树显示,浙江省HEV位于HEV-A和HEV-B分支上,E30存在h和i基因亚型。结论 浙江省病毒性脑膜炎的主要病原为HEV-B;EchoV检出率明显高于CV,两类病毒存在交替变化的趋势;优势血清型E30、CVB5和E6间隔若干年呈现病毒活动性增强的趋势;监测点HEV活动强度与病毒性脑膜炎暴发疫情的发生两者之间在时间上有较好的相关性。