肾综合征出血热病毒血凝素单克隆抗体的建立与鉴定

用HFRSV血凝素免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,共获得56株分泌抗HFRSV McAb的杂交瘤细胞系。对其中10株细胞系应用血凝抑制试验证明有9株为特异性分泌抗HFRSV血凝素McAb的杂交瘤细胞系。应用微量细胞培养中和试验证明6株具有中和活性。z株(3D_8和3G_1)具有高滴度的血凝抑制活性和中和活性。10株HFRSV血凝素McAb均能与从不同疫区,不同宿主分离的HFRSV反应,说明HFRSV血凝素具有群共同性。     

分泌抗人IgA及补体C_3成份McAb杂交瘤细胞株的初步建立

1.抗人IgA McAb的建立从人初乳中提纯IgA。免疫BALB/C鼠,将鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞SP2/0-G融合,用间接ELISA法测定抗体,得到三株分泌抗人IgA的McAb杂交瘤细胞株。腹水滴度为1∶8,100,与正常人血清作免疫电泳可见较清晰的沉淀线。其中有2株细胞经过3次有限稀释,连续传代培养2个多月,仍能持续分泌抗体。后者究属何亚类尚待确定。2.抗人C_3成份McAb的建立从正常人血清中粗提补体C_3成份。免疫BALB/C鼠。将鼠脾细胞与NS-1或SP2/0细胞融合,用抗补体免疫酶法抗、补体免疫荧光法及C_3溶血     

乙型肝炎表面抗原亚型决定簇“a”单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本研究中用纯化乙型肝炎表面抗原(HBsAg)“adr”免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合。以ELISA和RIA法检测抗体,获得9孔抗-HBs阳性的杂交瘤,经过5次有限稀释,建立4株单克隆细胞。选其中一株SH_1D_9杂交瘤细胞进行体外连续传代,接种小鼠腹腔,抗-HBs滴度在组织培养上清液中为1∶10,000,小鼠腹水为1∶50,000。经特异性、稳定性鉴定,证明其抗-HBs对HBsAg具有持续的和良好的亲和性,正常人血清无交叉反应,经亚型及Ig亚类鉴定为抗-HBs“a”亚型决定簇,IgG型单克隆抗体,杂交瘤细胞染色体平均为104个。本文并对HBsAg免疫Balb/c小鼠采取的不同方案及建立单克隆抗体杂交瘤细胞株的实验方法加以讨论。     

分泌抗人C反应蛋白单克隆抗体杂交瘤的建立

应用C反应蛋白免疫的Balb/c小鼠脾细胞与P_3V_1C_2小鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇4000作用下融合,并经克隆后获得了3株抗人CRPMcAbs的杂交瘤细胞抗CRPI—2—3—1、2—3—4、2—6—1.用ELISA法测定培养的其杂交瘤细胞上清,及腹水,含有较高滴度的抗体含量,用琼脂免疫双扩散法证明它仅与人CRP及CRP阳性血清出现透明沉淀反应.用山羊抗鼠Ig亚类血清鉴定,其McAbs均属小鼠1gG.     

抗猴逆转病毒Ⅰ型(SRV-1)杂交瘤细胞株的建立及应用

以SRV-1蔗糖梯度离心纯化抗原免疫SPF级的BALB/c小鼠,用SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞融合。应用间接免疫荧光法(IFA)检测抗体,抗原为感染SRV-110d的Raji细胞。筛选出两株SRV-1小鼠杂交瘤细胞株及单克隆抗体(McAb)C_4和C_(15)。两株杂交瘤细胞经3次克隆后分别注入同品系的小鼠腹腔,所产生的腹水经IFA和ELISA法测定其滴度为1:800～1:1600。经琼脂免疫双扩散法鉴定,C_4McAb     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

抗乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)单克隆抗体的研究

用纯化HBsAg致敏的BALB/C小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤株NS-1进行体细胞杂交,获得了6株分泌抗HBsAg McAb的杂交瘤。6个瘤株分泌的McAb在培养上清及接种裸鼠和BALB/C小鼠腹水中均有较高滴度,能与HBsAg在琼脂双扩散中形成免疫沉淀线,其中4C1、4C3、3B6为抗-a决定簇,1 B10为抗-d决定簇。6个McAb均为IgG1亚类。这些McAb试用于ELISA、RIA中包被固相载体和标记、以及免化定位肝癌组织内HBsAg,显示了较好的应用前景。     

旋毛虫幼虫单克隆抗体制备和鉴定

本实验用旋毛虫幼虫可溶性抗原,免疫BALB/c小鼠的脾细胞,与NS_1鼠骨髓瘤细胞融合后,选择4株连续分泌抗旋毛虫幼虫McAb的杂交瘤细胞。经ELISA、IFA鉴定分析,证明这4株细胞能分泌高效价特异性McAb。McAb亚类鉴定结果为IgG_3和IgG_1。是抗幼虫表面抗原,虫体抗原和虫体及囊液不同部位的特异性McAb。     

抗登革Ⅱ型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与鉴定

采用登革Ⅱ型病毒免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞,在40％PEG1000的作用下进行融合,获得6株分泌抗登革Ⅱ型病毒单克隆抗体的杂交瘤,用间接免疫荧光法鉴定其单克隆抗体(McAb)对登革Ⅱ型病毒均有特异性。HIA和CF试验有5株McAb为CF型特异的。5株具有HIA抑制活性。     

抗重组人白细胞介素12单克隆抗体的制备及其生物学特性

以纯化的重组人白细胞介素12（rhIL-12）蛋白为抗原,制备具有生物活性的rhIL-12单克隆抗体（McAb）,并对其特性进行研究鉴定,为肿瘤及免疫相关性疾病的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。方法： 以纯化的rhIL-12p70免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术,用间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及多次克隆化,培养制备杂交瘤细胞系,用clutathione sepharose 4B进行纯化。采用间接ELISA及Western blotting等方法对McAb的Ig亚类（型）腹水效价及特异性进行鉴定。结果：建立了3株持续分泌rhIL-12p70　McAb的杂交瘤细胞株,3株细胞染色体数目均为100条左右,证实为杂交瘤细胞,所分泌的抗体为2株IgG1亚类及1株IgG2a亚类,轻链属k型,小鼠腹水效价测定分别为1∶5.9×106、1∶2.9×10⁷、1∶3.6×10⁷,亲和力依次为EM5>EM6>EV9。结论：成功地制备了3株能稳定分泌抗rhIL-12p70的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高。     

登革热Ⅳ型病毒McAb的研究

将SP2/0-Ag小鼠骨髓瘤细胞与经登革热病毒Ⅳ型H_241株免疫的瑞士种小鼠脾细胞融合,获得1株分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞,经克隆化得6E_5和6F_4两个细胞株。此McAb用免疫荧光法检查属型特异性,而用血凝抑制试验检查则呈组特异性。此抗体和一些蚊媒病毒和虫媒病毒Langat株有交叉反应。用6E_5组织培养上清液标记荧光素获得成功,这使从蚊     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗恶性疟原虫EBA—175的单克隆抗体（McAb），为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法以恶性疟原虫EBA-175（Ⅱ区F2段）重组抗原免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株．测定其免疫球蛋白亚类及其效价，ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4Al、4C3、4H9，6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1，1株为IgG2a，6株McAb的培养上清ELISA效价为1：256～1：512，腹水效价为1：12800-1：25600，间接ELISA显示其中4株McAb 1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合，而只有1F3、4A1、4H9在Western blot试验中识别恶性疟原虫Mr约35000的虫源蛋白。结论获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp）单克隆抗体（McAb）,并对其特异性进行鉴定,用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westen blotting试验分析其特导性。结果,制备出2A5和 1H10两株能稳定分泌抗LDHp　McAb的杂交瘤细胞株,两株单抗均为IgG2b,2A5和1H10培养上清的ELISA效价分别为1:512和1:256,腹水效价分别为1:25600和1:12800,两株单抗与间日疟、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应,能识别恶性疟原虫的33Kda虫源蛋白。证明制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

抗脱氧雪腐镰刀茵烯醇单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗脱氧雪腐镰刀茵烯醇(DoN)单克隆抗体(McAb)并对其进行初步鉴定.方法 采用小剂量长周期的免疫方案,以DON-牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫雌性BALB/c小鼠,采用细胞融合的方法制备杂交瘤细胞株,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中McAb,对抗体分泌阳性的细胞株进行克隆化,直至抗体阳性率100%,用竞争抑制ELISA法进一步检测McAb的特异性,腹水诱生法制备大量McAb,并用饱和硫酸铵对其进行纯化,用抗体亚类鉴定试剂盒对该McAb亚类进行鉴定,BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量,ELISA检测McAb的滴度、参考工作稀释度和亲和常数.结果 DON-BSA免疫的BALB/c小鼠血清效价为1∶256000,与BSA有强烈的交叉反应.细胞融合后,ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞株,经3轮克隆化,建立了1株能稳定分泌抗DON-BSA McAb的杂交瘤细胞株3G5,腹水诱生法制备了大量的McAb.该McAb属IgG1,IgG含量为6.06 g/L,抗体滴度为1∶500000,参考工作稀释度为1∶64 000,抗体亲和常数为1.62×109.用间接竞争抑制ELISA测得校正曲线线性范围9.8～10 000 ng/mL,线性方程Y=-0.272 6X+0.225 9(r=0.930 9).结论 获得了分泌抗DON-McAb的杂交瘤细胞株,该单克隆抗体灵敏度高,特异性强,可用于制备高质量国产DON-ELISA检测试剂盒.     

分泌抗人精子单克隆抗体杂交瘤细胞的建立

用人精子免疫BALB/C小鼠,用杂交瘤技术制备出9株抗人精子单克隆抗体。经酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光实验证明,9株抗人精子单克隆抗体均能与人精子产生特异性免疫反应。连续传代及液氮中保存的杂交瘤细胞分泌抗人精子单克隆抗体的滴度持续稳定。     

抗人IgA McAb的鉴定

用人IgA免疫BALB/C小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP 2/0-Ag 14融合,测定99个融合孔,抗体阳性者10孔。其中2个经克隆获得代表株39-1,2-9。对后者所分泌的McAb及杂交瘤细胞免疫小鼠的腹水,进行了特异性和纯度鉴定。被动血凝抑制试验证明,2个McAb均可被抗原IgA所抑制,抑制率与抗原量成正比;用含2％PEG-6000的琼脂免疫双扩散试验,39-1McAb和免疫抗原IgA产生一条沉淀线,     

抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。方法利用重组Derf1蛋白为免疫原,免疫BALB／c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,其Ig亚型均为IgG1,且6株单抗均具有良好的效价。ELISA和Western—blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组Derf1蛋白和天然的粉尘螨提取物。其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别。结论成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Derf1检测及纯化方法奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白T单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的：建立抗人心肌肌钙蛋白T(cTnT)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。方法：从人心肌组织中提取纯化人cTnT，免疫BALB／C小鼠，采用杂交瘤技术，间接ELISA法选择能稳定分泌抗cTnT　McAb的杂交瘤细胞株。结果：建立了2株稳定分泌抗cTnT　McAb的杂交瘤细胞株N15C和N16D，其染色体数目为90-106，McAb Ig亚类均为IgG，，间接ELISA法测定McAb腹水效价分别为1：8000和1：32000。免疫印迹结果显示2株McAb均可识别cTnT中Mr为37000的单一区带，不识别人骨骼肌提取物。间接ELISA法测定N15C和N16DMcAb与cT—nT反应的最低浓度分别为47μg/L和23μg／L。相加试验表明2株McAb能识别不同的抗原表位。结论：获得2株能稳定分泌特异性抗人心肌cTnT McAb的杂交瘤细胞株。     

抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文用呼吸道合胞病毒(RSV)作抗原免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立3株分泌抗RSV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。经鉴定所产生的McAb确系抗RSV的McAb。     

抗ANXA2单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备ANXA2特异性单克隆抗体(McAb),为研究ANXA2的生物学功能和检测该蛋白提供有力的抗体工具。方法用经IPTG诱导表达的基因重组PGEX-4T-1-ANXA2抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法筛选抗ANXA2杂交瘤细胞,用ELISA法鉴定所得单抗腹水的效价及Western blot鉴定McAb特异性。单抗纯化和Eu3+标记后,分别包被聚苯乙烯板及作为铕标单抗,利用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)筛选出检测ANXA2蛋白的最佳配伍单抗。结果经细胞融合、筛选、克隆化,获得了16株可分泌高效价单抗的杂交瘤细胞,间接ELISA显示16株McAb与空载体PGEX-4T-1均未发生交叉反应,抗体特异性良好,16株抗体腹水效价为1∶8 000~1∶256 000,培养上清效价为1∶256~1∶512,纯化的腹水单抗经配对试验,2D6和9H9-Eu3+配对最佳。结论获得16株能稳定分泌高特异性抗ANXA2的杂交瘤细胞,能用于后续研究。