蛋氨酸补偿代谢途径及蛋氨酸酶抗肿瘤研究进展

蛋氨酸是唯一1种含硫必需氨基酸,是蛋白合成和细胞转甲基化作用的必需成分,同时也是同型半胱氨酸的前体物质.研究发现,与正常细胞相比,肿瘤细胞对蛋氨酸呈现出依赖的特性.这种依赖是一种代谢缺陷,可从蛋氨酸的生物代谢角度解释肿瘤细胞产生蛋氨酸依赖的缺陷.正常细胞代谢中存在蛋氨酸补救途径即5,-甲硫基腺苷酸(MTA)循环合成蛋氨酸,而肿瘤细胞却无此途径,表现出对蛋氨酸的绝对需要.L-蛋氨酸γ-裂解酶能够特异性地裂解L-蛋氨酸产生氨、α-丁酮酸和甲硫醇.蛋氨酸酶在抗肿瘤研究中表现出对肿瘤特异性高,毒副作用小等特点,有较好的发展前景,给肿瘤基因治疗开辟了新的路径.     

蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体构建

目的构建蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体.方法运用Cre-LoxP重组酶系统,通过DNA重组技术,将L-蛋氨酸-γ裂解酶基因(L-Methioneγ-Lyase Gene)与供体载体pDNR-CMV重组,获得含有Metase重组基因的供体载体pDNR-Metase-CMV.将pDNR-Metase-CMV片段与真核腺病毒载体PLP-Ade-X-CMV进行重组,获得pLP-Ade-Metase-CMV重组分子.结果获得了重组腺病毒载体pLP-Ade-Metase-CMV,并证实该重组腺病毒载体中有Metase Gene.结论采用LoxP/Cre体外重组法成功地构建了含蛋氨酸酶基因的真核表达重组腺病毒载体.     

重组腺苷蛋氨酸合成酶酶促反应条件的研究

目的：对重组腺苷蛋氨酸合成酶催化L-蛋氨酸（Met）和三磷酸腺苷（ATP）合成腺苷蛋氨酸的反应条件进行研究。方法：将重组腺苷蛋氨酸合成酶制成粗酶液,对其酶促反应条件进行研究和优化,摸索反应的最适pH值、最适反应时间及最适酶量,解决产物抑制问题和产物分解问题。根据试验摸索的条件进行450L生物反应罐的中试放大。结果：重组腺苷蛋氨酸合成酶催化Met和ATP合成的反应最适pH值为7．0,反应时间为8h,选择硼酸钠-硫酸缓冲液作为反应的缓冲系统,确定了反应液中酶液的最佳比例为1：10,解决产物抑制问题的对甲苯磺酸钠的用量为9％。将镁离子和钾离子的盐酸盐形式改为硫酸盐形式,从而保证了最小限度的产物分解。中试放大结果：三批收率分别达到86．8％、87．1％和88．4％。结论：建立了重组腺苷蛋氨酸合成酶酶促反应的方法,为酶促法合成腺苷蛋氨酸大规模生产奠定了基础。     

蛋氨酸裂解酶的基因克隆及序列分析

目的：克隆蛋氨酸裂解酶（METase）中阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶（TVMGLl）基因，探讨重组METase（rMETase）对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法：从培养的阴道毛滴虫提取总RNA，以此为模板，利用RT-PCR获取TVMGL1基因，琼脂糖电泳分离纯化所得目的基因并克隆至T-Vector，ABI3730自动序列分析仪分析所得基因序列。结果：PCR产物经琼脂糖电泳，目的基因片段大小与预期大小相符；序列分析所得基因序列为1191bp，与国外报导的序列相符。结论：从培养的阴道毛滴虫中成功克隆出TVMGLVI基因，为METase抗肿瘤作用的研究奠定了基础。     

重组蛋氨酸裂解酶原核体系的表达及纯化

目的 建立L-蛋氨酸γ-裂解酶的原核表达、纯化体系.方法 合成Metase基因并构建重组质粒pBSK-Metase.通过分子克隆技术,构建重组表达质粒pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,并将重组子转化到感受态大肠杆菌Dh5α中.pGEX-4T-1-Metase经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导;pBV220-Metase经42℃温度诱导;并对诱导条件进行优化,获得大量表达;建立蛋氨酸裂解酶纯化体系.结果 构建出Metase基因的两种高效原核表达体系pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,并优化各自的最佳诱导表达条件;建立重组蛋氨酸裂解酶的纯化体系.结论 成功建立重组蛋氨酸裂解酶的原核表达、纯化体系;获得高效原核表达重组子pGEX-4T-1-Metase,且获得纯度高达95%的蛋氨酸酶.     

重组L-蛋氨酸γ-裂解酶基因原核表达载体构建及初步鉴定（摘要）

目的构建原核表达载体,筛选高表达克隆,提取蛋氨酸酶蛋白,为深入研究蛋氨酸酶体内外抗肿瘤作用做前期准备．方法化学法合成METase基因,将所得基因插入原核表达载体PGEX-4T-1,得到重组质粒并转化人大肠杆菌．通过蛋氨酸诱导筛选高表达克隆．用SDS—PAGE初步检测蛋白．结果重组质粒经PCR检测、酶切、测序证实与预期一致．重组的质粒在蛋氨酸的诱导下表达大量的蛋氨酸酶,并经SDS—PAGE检测,表达产物的分子量同预期结果相符．     

2种重组真核蛋氨酸酶原核体系表达及活性比较

目的构建2种真核L-蛋氨酸γ-裂解酶(MGL1 MGL2)的高效原核表达载体,诱导表达及纯化,比较活性差异.方法通过分子克隆技术构建2种重组表达质粒pGEX-4T-1-MGL1,pGEX-4T-1-MGL2;重组质粒转化感受态大肠杆菌Dh5α,诱导表达纯化蛋氨酸酶.结果构建了高效表达载体pGEX-4T-1-MGL1,pGEX-4T-1-MGL2;pGEX-4T-1-MGL1表达的酶纯度为82.5%,活性为0.505 2 IU/mg,pGEX-4T-1-MGL2表达的酶纯度为81.4%,活性为0.305 2 IU/mg.结论 pGEX-4T-1-MGL1,pGEX-4T-1-MGL2都能表达蛋氨酸酶;pGEX-4T-1-MGL1表达的蛋氨酸酶纯度比较高,酶活性比较高.     

人YB-1蛋白的高效原核表达、纯化及其多抗的制备

目的 构建YB-1原核表达系统,诱导表达后纯化YB-1融合蛋白并制备其多抗.方法 采用RT-PCR扩增YB-1编码序列,将该序列克隆至载体pET-32a(+);转化BL21(DE3),确定最佳表达条件;采用亲和层析与超滤纯化目的 蛋白,经Western blot鉴定后免疫家兔,制备其抗体.结果 成功扩增YB-1编码序列并构建了其表达载体;SDS-PAGE结果显示,表达条件经优化后(28 ℃, 5 h, 0.5 mmol/L IPTG),YB-1融合蛋白在BL21中得到高效可溶性表达;Western blot结果证实,表达产物经纯化后获得了纯度较高的YB-1融合蛋白,将该蛋白免疫家兔后获得了效价与特异性较高的抗体.结论 成功建立了YB-1蛋白的原核表达系统及蛋白纯化方法,并制备了其抗体.     

燃煤污染型砷中毒患者GST基因多态性与GST酶活力的关系

目的:探讨燃煤污染型砷中毒患者谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因多态性与GST酶活力的关系,为深入了解砷中毒的致病机制提供实验依据.方法:选择130例燃煤污染型砷中毒患者和140例健康人作为研究对象,采用多重等位基因特异聚合酶链反应(多重PCR)检测GSTM1、GSTT1基因缺失;采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测GSTP1 Ile105Val、GSTO1 Ala140Asp、GSTO2 Asn142Asp基因多态性;采用化学比色法检测谷胱甘肽硫转移酶(GST)活力,并分析上述基因多态性与GST酶活力的关系.结果:GSTT1基因缺失基因璎、非缺失基因型以及GST02 Asn142Asp基因Asn/Asn、Asn/Asp、Asp/Asp基因型,在砷中毒组和对照组的分布差异有统计学意义(P<0.05);砷中毒患者GST酶活力增高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);砷中毒组和对照组GSTO1 Ala140Asp基因不同基因型间的GST酶活力有差异(砷中毒组P>0.05,对照组P<0.05);未发现GSTM1、GSTT1、GSTP1 lle105Val、GSTO2 Asn142Asp多态性与GST酶活力有关.结论:GS-T01 Ala140Asp基因多态性可能影响燃煤污染型砷中毒患者的GST酶活力,其原因尚需进一步研究.     

用酶联免疫吸附法测定多抗甲素含量的探讨

作者采用酶联免疫吸附测定(ELISA)夹心法及二步竞争法,测定多抗甲素的含量。经实验条件的优化,均采用微滴板上烘干包被兔抗体,结合多抗甲素后,分别加入辣根过氧化物酶标记的免抗体或该酶标记的多抗甲素,再显色测定。除包被一步外,均在4小时内完成测定,比常规补体结合法快速,包被的微滴板4℃储存3个月仍不影响使用。灵敏度:夹心法为0.64～7.4μg/孔;二步竞争法为0.6～1.2μg/孔。     

1.8％AVM乳油对小鼠肝微粒体CYP450酶系与GST影响的初探

目的 观察1.8％阿维菌素(AVM)乳油对小鼠肝微粒体细胞色素P450 (CYP450)酶系与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的影响,初步探讨1.8％AVM在肝脏的可能的代谢过程和毒性机理.方法 40只清洁级昆明种小鼠(雌雄各半)灌胃给予1.8％AVM乳油(70、35、17.5 mg/kg),连续7d,以0.9％氯化钠溶液作对照.末次给药后处死小鼠,采用差速离心法制备大鼠肝微粒体,Brandford法测定微粒体蛋白浓度,CO还原差示光谱法检测肝微粒体CYP450含量,差示光谱法则定肝微粒体b5 (Cyt-b5)含量,紫外分光光度法则定肝微粒红霉素N-脱甲基酶活性(ERD)和氨基比林-N-脱甲基酶(ADM)和GST的活性.结果 各1.8％AVM乳油染毒剂量组ERD、ADM活性均低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);各剂量组小鼠肝脏指数、CYP450与b5的含量及GST的活性与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05),且不同剂量组间差异亦无统计学意义(P＞0.05).结论 1.8％AVM乳油可抑制小鼠肝微粒体ERD(主要反映CYP3A活性)和ADM(主要反映CYP2E1)的活力,而对CYP450和b5含量及GST活性影响小,未观察到1.8％AVM乳油对小鼠肝微粒体重要的Ⅰ相酶CYP450和Ⅱ相酶GST的诱导或抑制作用.     

蛋氨酸裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达

目的:使来源于人阴道毛滴虫的蛋氨酸裂解酶基因在大肠杆菌中高效表达;纯化表达产物获得重组蛋氨酸裂解酶。方法:用蛋氨酸裂解酶基因片段克隆至pGEX4T-2,转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下体外表达重组蛋白,亲和层析纯化重组蛋白。结果:表达产物经SDS-PAGE,显示在相对分子质量68000处出现高浓度的GST融合蛋白,其相对分子质量与预期的GST-重组蛋氨酸裂解酶大小相符;薄层扫描显示重组蛋白占总菌量的34%。结论:人阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶基因在大肠杆菌中成功地获得高效表达。     

血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗接种后保护力的观察

为了探讨血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫鼠后对尾蚴攻击感染的保护性作用,采用１０６ＣＦＵ和１０８ＣＦＵ重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗皮下接种ＢＡＬＢ／Ｃ鼠,接种后８周用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染,感染后６周剖杀小鼠,计算减虫率、减卵率,同时进行虫卵肉芽肿周长和面积测量,以及抗体水平和抗原水平测定,同时设有ＰＢＳ对照组。结果表明重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫小鼠后,１０６ＣＦＵ、１０８ＣＦＵ组与对照组相比,减虫率分别为２７．３４％、１６．６４％,减卵率分别为５５．７５％、６０．５０％,虫卵肉芽肿的平均周长和平均面积、免疫后血清抗体水平差别均具有非常显著意义;１０８ＣＦＵ与１０６ＣＦＵ组相比,血清抗原水平差别具有显著意义,说明血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗是一种比较理想的新型疫苗,值得进一步深入研究     

核糖核酸酶抑制因子的提纯及抗血清制备

核糖核酸酶抑制因子 (ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＲＩ)是一种存在于胞浆中的酸性糖蛋白 ,分子量为50ｋＤａ。ＲＩ是核糖核酸酶 (ＲＮａｓｅ)的抑制剂 ,它与ＲＮａｓｅ紧密结合 ,形成马蹄形的立体结构。在ＲＩ的结构中 ,有 11对二硫键和 8个游离的巯基。巯基是ＲＩ的活性必需集团 ,巯基的氧化会导致ＲＩ的失活。作为ＲＮａｓｅ的抑制剂 ,ＲＩ在体外实验中可以保护ｍＲＮＡ免受ＲＮａｓｅ的降解。最近关于ＲＩ的研究又有新的报道 ,血管形成因子 (ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ)是ＲＮａｓｅ超家族的一员 ,ＲＩ可以与其结合 ,并抑制…     

硫酸软骨素裂解酶ABC的制备

本文介绍了简便易行的制备硫酸软骨素裂解毒ＡＢＣ的方法，从普通变形杆菌６０１０菌体中提取了硫酸软骨素裂解酶ＡＢＣ，经链霉素沉淀，硫酸铵沉淀，ＤＥＡＥ－纤维素柱层析和磷酸纤维素柱层五步后，酶比活力提高９１倍，纯吕经聚丙烯酰胺凝电泳显示单一蛋白带。     

低硒、低蛋氨酸对大鼠体内GSH-Px及TBA值的影响

用人工合成饲料喂养大白鼠,控制硒蛋氨酸含量,观察其血及组织中GSH-Px及TBA值的变化。结果表明,低硒、低蛋氨酸均能降低GSH-Rx 活性,使TBA值升高。在低硒的条件下低蛋氨酸能进一步降低GSH-Px活性,TBA值有所升高。     

一种L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒的构建及高效表达

目的:拟通过构建人阴道毛滴虫的L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒,并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化表达产物,从而获得重组蛋氨酸裂解酶.方法:PCR法从人阴道毛滴虫的基因组中获得L-蛋氨酸γ-裂解酶获得L-蛋氨酸γ-裂解酶基因片段,并克隆至pGEX4T -2质粒,获得重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α中,在异丙基-B-D-硫代半乳糖苷诱导下,实现高效表达,表达产物经亲和层析纯化获得重组L-蛋氨酸γ-裂解酶.结果:表达产物进行SDS - PAGE检测,结果表明在相对分子质量68000处出现高浓度的GST融合蛋白,相对分子质量与预期大小相符;薄层扫描显示重组蛋白占总菌量的33.6％.结论:人阴道毛滴虫的L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒构建成功,并成功地获得高效表达.     

11C-蛋氨酸的制备及其正电子发射断层／CT显像

目的研究新型脑肿瘤显像剂11C-蛋氨酸（11C-MET）的制备方法，探讨11C-MET的临床显像方法及其在脑肿瘤显像中的应用。方法回旋加速器轰击产生11C-CO2，甲醇化后获得反应活性很强的甲基化前体11C-CH3I，再与L-高胱氨酸硫内酯在常温下反应获得11C-MET。对1例脑胶质瘤术后患者进行PET／CT脑显像。结果11C-MET合成时间约2min，合成效率为85％，放射化学纯度〉99％，质量控制指标合格。结论11C-MET合成速度快，合成效率较高，适用于临床PET显像。11C-MET在脑肿瘤内有较长的滞留时间，有较高的肿瘤／脑比值，是理想的脑肿瘤显像剂。     

野生型和失活型PAK1基因自我抑制域的GST标签真核表达载体的构建及表达

目的：构建不同活性的人p21活化激酶1(hPAK1)自我抑制域(AID)谷胱甘肽(GST)标签真核表达载体并鉴定其融合蛋白表达,以探讨PAK1 AID的功能及肿瘤治疗的靶向意义。方法：以pcDNA3.1HisC-PAK1全长质粒为模板,利用PCR扩增野生型(WT)PAK1 AID片段,再以此片段为模板采用大引物法扩增其突变体L107F片段,双酶切克隆至GST融合的真核表达载体pEBG。将质粒转染至工具细胞HEK293中,并经免疫印迹鉴定GST融合蛋白的表达。结果：PCR扩增出约200 bp大小的野生型和失活型PAK1 AID片段,双酶切得到与预期大小相符的载体与PAK1 AID片段,野生型与失活型pEBG-PAK1在工具细胞HEK293中表达,蛋白的相对分子质量均为33 000。结论：成功构建野生型和失活型PAK1基因 AID的GST标签真核表达载体,并表达出不同活性的GST-PAK1 AID的融合蛋白。