XIAP基因与耐紫杉醇卵巢癌细胞A2780/Taxol耐药关系的研究

目的 探讨X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）基因与卵巢癌对紫杉醇耐药的相关性。方法 以5、10、20、40、80、160、320 ng/mL的紫杉醇处理卵巢癌紫杉醇敏感细胞A2780和耐药细胞A2780/T,噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞的抑制率（IR）, 逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印记（Western blot）检测紫杉醇100 ng/mL处理A2780和A2780/T细胞后XIAP基因和蛋白的表达;将A2780/T细胞分为空转染组（转染空载体质粒）、小干扰RNA（siRNA）-XIAP（siRNA-XIAP）组（转染siRNA-XIAP质粒）、非特异性转染组（转染非特异性质粒）、空白对照组（不转染质粒）,RT-qPCR和Western blot检测各组细胞XIAP基因和蛋白的表达,并加入含不同质量浓度的紫杉醇（0、1 000、1 500、2 000、2 500 ng/mL）,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 不同质量浓度紫杉醇处理后,A2780细胞IR随紫杉醇质量浓度的增加而增高（P<0.05）,A2780/T细胞IR无明显变化。紫杉醇100 ng/mL处理A2780和A2780/T细胞后,A2780细胞XIAP mRNA的表达低于紫杉醇未处理组（P<0.05）,A2780/T细胞中XIAP mRNA的表达与紫杉醇未处理组差异无统计学意义(P>0.05),但A2780/T细胞XIAP mRNA和蛋白表达均高于A2780紫杉醇处理组（P均<0.05）;siRNA-XIAP组XIAP mRNA和蛋白的表达均低于其他各组（P<0.05）,在紫杉醇2 000 ng/mL及2 500 ng/mL作用下,siRNA-XIAP组凋亡率高于其他各组（P<0.05）。结论 卵巢癌对紫杉醇耐药与XIAP基因的高表达有关,特异性的siRNA可通过降低XIAP的表达,促进细胞凋亡,增加耐药癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

P27对卵巢癌多细胞球体紫杉醇耐药性影响的实验研究

目的：检测p27在卵巢癌多细胞球体中的表达,探讨p27反义寡核到（p27-ASON）对卵巢癌多细胞球体紫杉醇耐药的逆转作用。方法：以三维培养方法获得的人卵巢癌A2780、CAOV3多细胞球体（MCS）为模型,以单层细胞为对照,采用流式细胞仪（FACS）检测细胞周期变化,用蛋白质免疫印迹法（Western blot）、流式细胞仪（FACS）检测p27表达。用激光共聚焦显微镜（Confocal）检测p27蛋白的亚细胞分布。将p27-ASON经脂质体（LipofectAMINE）包裹转染人卵巢癌细胞A2780、CAOV3,用台盼蓝排除实验法和FACS检测细胞凋亡率来分别比较单层细胞、p27-ASON转染前后培养的MCS的紫杉醇敏感性。结果：（1）Western blot、Confocal检测提示MCS中p27表达明显高于单层细胞,FACS检测也提示将单层细胞培养成MCS时,其p27表达明显增高（PA2780=0.011,PCAOV3=0.024）,G0-G1期细胞比率增加,S期和G2-M期细胞比率降低。（2）不同浓度的紫杉醇（0.2、2.0、10.0、20.0μmol/L）作用后,MCS细胞抑制率明显低于单层细胞（PA2780=0.003,PCAOV3=0.015）;经20μmol/L的紫杉醇作用后,单层细胞的细胞凋亡率明显高于MCS,差异有显著意义。（3）p27-ASON转染前培养的MCS较致密,而转染后的较疏松。（4）p27-ASON转染后培养的MCS(p27-ASON/MCS),p27表达明显下调,G0-G1期细胞比率减少,细胞抑制率、细胞凋亡率检测其对紫杉醇的敏感性明显高于转染前。结论：卵巢癌MCS对紫杉醇化疗的耐药与p27的表达上调有关,p27-ASON可一定程度的逆转卵巢癌对紫杉醇化疗的耐药性,提高化疗疗效。     

稳定过表达XAF1基因对A2780卵巢癌细胞生物学功能的影响

目的 构建稳定过表达XAF1基因A2780卵巢癌细胞株,并观察XAF1基因对卵巢癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及对紫杉醇敏感性的影响。方法 分别将质粒pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1（+）-XAF1转染至卵巢癌细胞A2780,通过质粒抗性标记（遗传霉素G418）筛选得到阴性对照细胞株（A2780/Negative control, A2780/NC）和稳定表达XAF1的细胞株（A2780/XAF1）;通过行细胞克隆形成实验和CCK8实验检测细胞增殖及对紫杉醇的敏感性,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡。结果 成功构建了稳定表达XAF1的卵巢癌细胞A2780/XAF1,细胞形态无明显变化;与A2780/NC相比,A2780/XAF1克隆形成能力能力更低（P= 0.0016）,细胞贴壁后第1天和第3天增殖活性更低（P=0.009,0.0035）,两组细胞的细胞周期分布差异存在统计学意义（P< 0.0001）,两两比较结果显示A2780/XAF1组G2-M期细胞百分比显著增加（P<0.001）。在无凋亡刺激、无血清培养及紫杉醇诱导下,A2780/XAF1的凋亡率均比A2780/NC更高（P<0.001）;在不同紫杉醇浓度作用下,A2780/XAF1的增殖活性均显著低于A2780/NC（P<0.001）,且A2780/XAF1的紫杉醇半数抑制浓度显著低于A2780/NC。结论 成功构建稳定表达XAF1的卵巢癌细胞A2780/XAF1;XAF1调控卵巢癌细胞A2780的增殖、凋亡及细胞周期,并增加了卵巢癌对紫杉醇的敏感性。     

TP53 G199X和V157fs点突变对卵巢癌A2780细胞功能的影响

目的：通过细胞实验对致病候选基因TP53进行功能实验,探讨TP53G199X和V157fs点突变对卵巢癌A2780细胞蛋白表达、增殖、迁移和侵袭的影响。方法：选择无内源性TP53基因表达的卵巢癌A2780细胞,分为野生型组、G199X组、V157fs组和空载体组。构建TP53野生型质粒,利用点突变试剂盒构建筛选得到的G199X和V157fs 2个点突变的质粒,利用脂质体转染法在A2780卵巢癌细胞中转染野生型、突变型和空载体相关质粒。采用Western blotting法检测各组A2780细胞中P53蛋白表达,CCK-8实验法检测各组A2780细胞增殖活性,划痕实验检测各组A2780细胞划痕愈合率,Transwell细胞侵袭实验检测各组A2780细胞的侵袭细胞数。结果：A2780细胞经转染后,TP53 G199X和V157fs突变型组及空载体组细胞中无P53蛋白表达。与野生型组比较,G199X组、V157fs组空载体组细胞增殖活性明显升高（P<0.01）;G199X组和V157fs组A2780细胞划痕愈合率升高（P<0.05或P<0.01）;G199X组、V157fs组和空载体组侵袭细胞数明显升高（P<0.01）。结论：TP53G199X和V157fs 2个点突变在A2780细胞中可终止P53蛋白的表达并促进卵巢癌A2780细胞的增殖、迁移和侵袭。     

真核表达质粒pcDNA3．1／EGR-1的构建和体外效应研究

目的 构建早期生长反应基因(early growth response gene-1,EGR-1)真核表达载体,体外观察其对卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol的影响.方法 将EGR-1基因重组于pcDNA 3.1质粒中,稳定转染A2780/Taxol细胞,流式细胞仪检测转染对A2780/Taxol细胞凋亡的影响;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察A2780/Taxol细胞对紫杉醇的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR检测转染前后EGR-1及MDR1 mRNA的表达水平.结果 经酶切和测序鉴定,成功构建质粒peDNA 3.1/EGR-1;RT-PCR显示,外源性EGR-1基因已整合于A2780/Taxol细胞并获稳定表达;转染使细胞凋亡明显增加(P<0.01);恢复A2780/Taxol细胞对紫杉醇药物敏感性;MDR1 mRNA表达显著下调.结论 转染EGR-1可降低A2780/Taxol凋亡的阈值和下调MDRl的表达,从而减少A2780/Taxol细胞对紫杉醇的耐受性.     

重组凋亡素真核表达载体诱导人卵巢癌细胞凋亡

目的 观察凋亡素基因（VP3）在卵巢癌细胞株CoCl中诱导凋亡的情况。方法 用Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ分别双酶切pMD18-CAVP3和pcDNA3．1（＋），分别回收365bp和5．0kb大小的片断，然后常规行连接反应，构建重组凋亡素真核表达栽体pcDNA3．1-VP3。采用Lipofectamine^TM 2000介导的基因转染法，在体外将pcDNA3．1-VP3转染入卵巢癌细胞株CoCl中，RT—PCR检测凋亡素在细胞中的表达，用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 酶切鉴定及测序结果表明重组凋亡素真核表达载体pcDNA3．1-VP3构建成功。RT—PCR证实VP3基因在COCl中存在并在转录水平表达。转染pcDNA3．1-VP3细胞凋亡率明显高于转染空质粒组（P〈0．01）。结论 凋亡素可有效诱导卵巢癌细胞COCl凋亡。     

沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞A2780顺铂耐药性的影响

目的：研究RNA干扰切除修复交叉互补基因1（ERCC1）的表达后,卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的变化。方法：A2780细胞分别转染ERCC1基因的siRNA和GFPsiRNA,并给予顺铂（使其终浓度达到3μmol／L）,蛋白质印迹法分别检测顺铂给药前后ERCC1蛋白的表达,并用MTT法检测顺铂不同浓度下A2780细胞的存活率。结果：①转染ERCC1 siRNA后,实验组蛋白质表达量较对照组显著降低;@ERCC1 siRNA＋顺铂组的ERCC1蛋白表达要弱于ERCC1 siRNA＋PBS组,而GFPsiRNA＋顺铂组的蛋白表达要弱于GFPsiRNA＋PBS组;③顺铂（浓度在0．75—12μmol／L之间）呈浓度依赖性地降低A2780细胞的存活率;④在相同浓度顺铂的作用下,与GFPsiRNA组相比,ERCC1 siRNA组的顺铂量效曲线左移。结论：顺铂能抑制沉默ERCC1基因后A2780细胞的生长,且在一定浓度范围内呈浓度依赖性;ERCC1是参与顺铂耐药性产生的重要因素之一。     

人金属硫蛋白1H基因对肺腺癌细胞A549耐药性的影响

目的：探讨金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因对人肺腺癌A549细胞耐药性的影响．方法：构建真核表达载体pcDNA3．1（-）-MT1H,利用脂质体介导将其转染肺腺癌A549细胞,G418筛选阳性克隆．分别以RT—PCR和Western方法检测MTIH mRNA和蛋白表达情况,MTT法检测细胞对顺铂的药物敏感性;流式细胞仪（FCM）检测顺铂诱导细胞凋亡率．结果：转染pcDNA3．1（-）-MT1H的细胞,其MT1H mRNA和蛋白表达水平显著高于亲本细胞及转染空载体细胞,细胞对顺铂药物敏感性明显下降,顺铂诱导的凋亡率明显降低．结论：MT1H能促进A549细胞耐药,可能和降低顺铂诱导细胞凋亡有关．     

姜黄素逆转卵巢癌对紫杉醇耐药的实验研究

目的:通过观察姜黄素作用人卵巢癌A2780/Taxol细胞株后,逆转该细胞株对紫杉醇的耐药作用,研究卵巢癌细胞对紫杉醇耐药的原因及姜黄素逆转耐药机制。方法:人卵巢癌A2780/Taxol细胞株在体外培养,将细胞分为对照组（A组）和实验组（不同浓度姜黄素组作用细胞）。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测2组细胞与相同浓度紫杉醇联用后细胞的生长抑制情况;Westernblot方法检测2组细胞内P-糖蛋白（P-gp）和蛋白激酶C-α（PKC-α）的表达情况。结果:四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法得出联合用姜黄素各组细胞生长抑制率均高于A组（P<0.05～P<0.01）;Western blot检测联合用姜黄素各组多药耐药蛋白-1/P-gp和PKC-α表达均较A组显著降低（P<0.01）。结论:姜黄素通过阻碍卵巢细胞中多药耐药蛋白-1/P-gp和PKC-α的表达,增加紫杉醇对细胞的毒性,降低细胞的耐药性。     

NDY1shRNA真核表达质粒构建及其在卵巢癌A2780细胞中的稳定表达

目的：构建NDY1 shRNA真核表达载体,并获得稳定表达shNDY1质粒的卵巢癌A2780细胞。方法根据Gen‐Bank数据库提供的NDY1基因核苷酸序列,设计并合成靶向干扰NDY1基因的小发夹RNA（shRNA）序列,插入表达载体获得重组质粒pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1。重组质粒测序鉴定正确后,脂质体介导转染A2780细胞,经G418筛选及有限稀释法获得稳定转染细胞,采用实时定量聚合酶链反应法（RT‐qPCR）和蛋白免疫印迹法分别检测A2780稳定转染细胞NDY1 mRNA及蛋白表达。结果重组质粒测序正确,转染shNDY1后,A2780细胞mRNA及蛋白表达水平分别下降（72．89±4．83）％及（55．85±4．84）％,与对照组相比差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论成功构建 pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1真核表达质粒,并获得shNDY1稳定转染的卵巢癌A2780细胞,为细胞水平研究NDY1与卵巢癌的关系奠定实验基础。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点,诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据,做出准确诊断,给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂,腹腔内疾病占64．63％,共17种病因;腹腔外疾病占35．37％,共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查,在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。