肝再生大鼠血清诱导骨髓干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的观察肝大部切除大鼠再生血清和肝细胞生长因子(HGF)诱导骨髓干细胞向肝实质细胞分化的作用；探讨骨髓干细胞向肝细胞分化和增殖的体外培养条件和方法，为患者应用自身骨髓细胞修复损伤肝脏提供实验依据。方法制作肝大部切除大鼠肝再生动物模型，收集术后24h血清；分别应用鼠肝再生血清和HGF对大鼠骨髓细胞进行定向诱导分化培养；以免疫组化、RTPCR和western blot等方法对分化不同阶段细胞进行检测。将分化细胞经尾静脉输入同系大鼠，观察输注细胞在肝、脾内的生长情况。结果活体移植分化细胞能定向迁移至肝和脾；体外及体内分化细胞在mRNA水平和蛋白质水平均表达白蛋白，并在一定时期内表达甲胎蛋白。结论大鼠骨髓干细胞在肝大部切除再生血清或HGF的诱导下能横向分化为肝实质样细胞。     

小鼠骨髓干细胞诱导分化为肝细胞的实验研究

目的探讨成年小鼠骨髓干细胞在肝细胞生长因子(HGF)作用下分化为肝细胞的可能性及其分化特性，为肝细胞移植提供实验基础。方法HGF100ng／ml体外诱导小鼠骨髓干细胞向肝细胞分化，于诱导的第0、7、l4、21、28天，观察细胞形态特征；半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)mRNA水平的表达；免疫细胞化学法检测ALB、AFP和细胞角蛋白l9(CK19)蛋白水平的表达。结果新鲜分离的骨髓干细胞ALB及AFP mRNA呈弱阳性。在非诱导组，培养7d时ALB mRNA已检测不到，AFP mRNA明显减弱，14d时消失。在诱导组，7d时ALB mRNA检测不到，14d时再次出现阳性条带，21d时表达量最大，而AFP mRNA在诱导组始终呈阳性，14d时表达量最大，以后逐渐减少。免疫细胞化学结果与RT-PCR结果基本一致，但CK19蛋白始终阴性。结论小鼠骨髓干细胞在HGF单独作用下能诱导分化为肝细胞样细胞，诱导分化的最佳时期是2～3周。     

小鼠骨髓基质干细胞的鉴定及体外诱导分化为肝细胞的可行性

目的:分离、鉴定小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)并探讨在体外多种细胞因子的诱导下分化为肝细胞的可行性.方法:获取小鼠骨髓干细胞,进行体外贴壁培养、纯化,观察不同传代次数细胞形态特点.流式细胞法检测不同传代细胞的表面标志物CD45和CD90.分离后的MSCs再经含有HGF,FGF-4,EGF三种细胞因子的诱导体系继续培养21 d,分别以半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测诱导后细胞的白蛋白(ALB)、细胞角化蛋白18(Cg18)、以及甲胎蛋白(AFP)在基因和蛋白水平的表达.结果:培养的骨髓干细胞随传代次数增多细胞形态趋向为长梭形.传代到第5代,基质干细胞的表面标志CD90阳性细胞从原代的25.42%增加到93.47%,造血干细胞的表面标志CD45表达阳性细胞从原代的86.49%降低到2.77%.通过RT-PCR可检测出诱导第7天细胞表达AFP mRNA,ALB mRNA及CK18 mRNA;通过Western blot可检测出诱导第21天的细胞表达ALB和CK18.结论:小鼠MSCs可以在体外被有效地分离纯化,可以被诱导为表达肝细胞表面标志的肝细胞样细胞.     

体外不同诱导条件下对大鼠胚胎肝干细胞分化影响的实验研究

目的探讨和比较不同体外条件对大鼠胚胎肝干细胞分化成熟的影响。方法将取自孕14d胎龄F344大鼠胚胎肝组织的肝干细胞分别接种至含10、20、40ng/mLHGF,0.5%、1%、2%二甲基亚砜(DMSO),10ng/mLHGF+0.5%DMSO、20ng/mLHGF+1%DMSO、40ng/mLHGF+2%DMSO以及空白的培养基中进行体外培养15d;诱导15d后,ELISA检测和比较不同组细胞内甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的浓度,实时定量PCR比较不同组细胞ALB、葡萄糖6-磷酸酶(G-6p)、角蛋白8、18(CK-8、CK-18)的mRNA的表达水平。结果与空白对照组相比,诱导15d后各实验组肝干细胞ELISA检测AFP明显下降(P0.01),ALB明显升高(P0.01);实时定量PCR结果表明各实验组ALB、G-6P、CK-8、CK-18mRNA水平较对照组均明显升高,其中大鼠胎肝干细胞体外最佳诱导条件为20ng/mLHGF+1%DMSO(P0.05)。结论 HGF和DMSO均可在体外诱导大鼠肝干细胞分化,不同浓度HGF和DMSO影响其分化成熟程度;HGF、DMSO对大鼠胚胎肝干细胞的分化具有协同效应。     

共同培养诱导骨髓基质干细胞向肝细胞分化的研究

目的 探索大鼠骨髓皋质干细胞（MsCS）向肝细胞分化的能力，及肝细胞生长的微环境埘其诱导分化的作用。方法 采用梯度离心法，获取大鼠骨髓基质干细胞；改良的两步法获取大鼠肝细胞。将鉴定的MsCS和肝细胞以半透膜相隔共同培养，以单独培养的MSCs作对照。在第1、3、7．14．21、28天，分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学分析检测甲胎蛋白（AFP）、白蛋白、细胞角蛋白l8（CK-l8）的基因和蛋白表达。结果在MSCs与肝细胞共同培养过程中，MSCs出现明显的细胞形态、体积和数量变化，可见双核或多核细胞，细胞轮廓较清晰。RT-PCR检测：共同培养的MSCs第7天即出现AFP基因表达，第14天表达增强，第21天表达减弱；第14天开始出现白蛋白、CK-18基因表达，并持续表达。单独培养的MSCs均无表达。共同培养的MSCs，于第7天进行免疫细胞化学检测，AFP即呈阳性；第14天白蛋白和CK-18也呈阳性；单独培养的MSCs未见AFP、白蛋白及CK-18表达。结论 大鼠骨髓基质干细胞与肝细胞共同培养，可被诱导分化为肝细胞。     

骨形态发生蛋白2在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用

目的：观察骨形态发生蛋白2（BMP2）在骨髓间充质干细胞（BMSCs）向肝细胞分化中的作用。方法采用贴壁法分离培养大鼠股骨BMSCs ,将体外扩增的第3代BMSCs制作细胞爬片,并行肝细胞定向诱导。根据诱导因子不同分为：肝细胞生长因子（ HGF）组、HGF＋BMP2组、BMP2组及空白对照组。培养10 d左右收集细胞,观察各组细胞形态的变化,并采用ELISA法检测培养液上清中肝细胞特异性标志物甲胎蛋白（ AFP）、白蛋白（ ALB）,免疫细胞化学法检测诱导分化后细胞CK-18的表达。结果 HGF组和HGF＋BMP2组可检测到ALB、AFP及CK-18,且HGF＋BMP2组ALB、AFP及CK-18明显高于HGF组（P均＜0．05）。结论 BMP2不能单独诱导BMSCs向肝细胞分化,但能增强HGF诱导BMSCs向肝细胞分化的作用。     

大鼠骨髓源性肝干细胞肝内移植后定居状况

目的 探索大鼠骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况.方法 采用全骨髓培养法体外培养细胞,贴壁筛选纯化骨髓间充质干细胞并进行体外培养、扩增,应用肝细胞生长因子(HGF)诱导分化出肝干细胞,鉴定后,经肝脏中叶注射入同种异体正常组和暴发性肝衰竭组大鼠体内,于移植后的第1、2、4周取受体肝脏移植原位(注射部位)、邻位(距注射部位0.5 cm)组织,应用PCR技术检测性别决定因子基因片段,研究肝干细胞在大鼠肝脏内定居情况.结果 经肝脏注射移植的肝干细胞在正常组和肝损伤组的肝脏内均能定居,且定居的细胞数量上肝损伤组明显多于正常组.结论 经肝脏注射移植的骨髓源性肝干细胞可以定居于肝脏内,且定于肝脏的干细胞数量与肝脏是否损伤密切相关.     

骨髓干细胞在大鼠肝再生环境中的分化

研究大鼠骨髓干细胞在部分肝切除后肝再生环境中的分化。从部分肝切除模型大鼠的胫骨中提取骨髓细胞,应用流式细胞仪富集骨髓干细胞,以PKH26-GL体外标记后通过门静脉进行自体移植,2周后行白蛋白和角蛋白8免疫组化检查。结果肝板肝细胞间PKH26-GL标记骨髓干细胞表达白蛋白、角蛋白8。提示骨髓干细胞在部分肝切除后肝再生环境中能分化为肝细胞,骨髓干细胞可能参与部分肝切除后的肝再生过程。     

肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化

目的 探索肝细胞生长因子（HGF）-4成纤维生长因子4-（FGF-4）诱导人骨髓来源多能成体祖细胞（hMAPCs）分化为肝细胞的可行性，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法 （1）取志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心＋贴壁培养获取骨髓间充质干细胞（MSCs），将MSCs通过CD45、GlyA免疫微磁珠负分选得到hMAPCS。（2）将hMAPCs用HGF＋FGF-4进行诱导分化。实验分组：A组：HGF（20ng／m1）＋（FGF-4）10ng／m1诱导hMAPCS；B组（阳性对照组）：L-02人肝细胞株；C组（阴性对照组）：未加任何诱导因素的hMAPCs。（3）免疫细胞化学鉴定不同诱导分化阶段细胞的白蛋白（A1b）、甲胎蛋白（AFP），细胞角蛋白-18（CK-18）等肝细胞特征的表型变化评计数阳性细胞比率。（4）逆转录-聚合酶链反应检测不同诱导分化阶段细胞的A1b、AFP，CK-18的mRNA转录。（5）Western blot检测诱导分化第21，35天后细胞的A1b表达。结果（1）免疫细胞化学结果：A1b、CK18在诱导组中不同时间段基本为阳性着色；AFP在诱导分化第7天为阳性着色，在诱导第14，21天为阴性着色。（2）逆转录聚合酶链反应结果：作为不成熟肝细胞表型的AFP，在诱导分化的第7天有mRNA阳性表达；作为成熟肝细胞表型的A1b及CK-18，在不同时间段mRNA均为阳性表达。（3）Western blot检测诱导分化第21、35天后细胞的A1b表达。结论hMAPCS在一定诱导条件下具有向肝样细胞分化的潜能。     

剔毒护肝方及其拆方对大鼠骨髓干细胞增殖分化的影响

目的：观察剔毒护肝方及其拆方含药血清对大鼠骨髓干细胞增殖作用和向肝系分化的影响。方法：40只Wistar大鼠被随机分为剔毒护肝方组、黄芪组、莪术组、叶下珠组、生理盐水对照组、肝再生血清组，制作药物血清；使用密度梯度离心和贴壁筛选相结合，分离骨髓干细胞；通过噻唑氮蓝（MTT）比色法检测含药血清处理48小时时骨髓干细胞的增殖率；采用免疫组化法检测骨髓干细胞肝系标志（AFP、白蛋白）表达情况。结果：经各组血清培养48小时后，剔毒护肝方组、黄芪组和肝再生血清组对大鼠骨髓干细胞增殖率分别为10.4％、14．3％和26．5％；剔毒护肝方组、黄芪组、肝再生血清组，AFP和白蛋白表达情况强于其他组；剔毒护肝方组、黄芪组、肝再生血清组可见糖原阳性表达。结论：剔毒护肝方组、黄芪组合药血清对骨髓干细胞有增殖作用，可诱导骨髓干细胞横向分化为肝实质细胞。剔毒护肝方中发挥主要作用的药物可能是黄芪，但剔毒护肝方的作用强于黄芪组，说明组成剔毒护肝方的三味药不是简单的叠加。     

大鼠移植骨髓细胞向肝细胞转化的实验研究

目的 探讨体内骨髓细胞向肝细胞转化的可行性。方法 将雌性SD大鼠随机分为3组，每组15只。①R BMT(全身照射 骨髓移植)；②2—AAF R BMT；③2—AAF PH(部分肝切) BMT。进行交叉性别骨髓细胞移植，雄性骨髓植入雄性受体，分别于第5、10、20天处死雌鼠。以雄性性别决定基因sry作为细胞标记，用原位杂交和FISH作为检测方法对骨髓细胞的肝细胞转化进行分析。结果 PCR移植效果初步分析可见，R BMT组11例中有10例PCR阳性；2AAF PH BMT组11例中有7例阳性，2AAF B BMT组10例中有6例阳性。sry原位杂交染色发现，第5天各组雌性受体肝索中均未见sry阳性的肝细胞。第10天R BMT组可见1例sry阳性的细胞位于肝细胞索,FISH染色可见这一细胞白蛋白mRNA阳性。第20天各组PCR阳性各例均可在肝索中检测到sry阳性的细胞。FISH染色可见白蛋白mRNA阳性。经统计学分析第20天各组sry阳性细胞数无明显差异。结论 在B BMT、2—AAF PH BMT和2—AAF R BMT模型中移植的骨髓细胞均可以植入肝脏，并存在于肝细胞索。植入肝索的骨髓细胞最早可见于移植后第10天，并发生转分化，表达白蛋白mRNA。不经过全身照射的2—AAF PH BMT组，移植的骨髓细胞也可以进入肝脏发生转分化，因此全身照射并不一定是移植骨髓细胞活化、植入和转化的必须条件。     

Rat bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into hepatocytes in vitro

AIM: To investigate the mechanism and regulation of differentiation from bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into hepatocytes and to find a new source of cell types for therapies of hepatic diseases. METHODS: MSCs were isolated by combining gradient density centrifugation with plastic adherence. The cells were cultured in osteogenic or adipogenic differentiation medium and determined by histochemical staining. MSCs were plated in plastic culture flasks that were not coated with components of extracellular matrix (ECM). When MSCs reached 70% confluence, they were cultured in low glucose Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10 mL/L fetal bovine serum, 20 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) and 10 ng/mL fibroblast growth factor-4 (FGF-4). The medium was changed every 3 d and stored for albumin, alpha-fetoprotein (AFP) and urea assay. Glycogen store of hepatocytes was determined by periodic acid-Schiff staining. RESULTS: By combining gradient density centrifugation with plastic adherence, we isolated a homogeneous population of cells from rat bone marrow and differentiated them into osteocytes and adipocytes. When MSCs were cultured with FGF-4 and HGF, approximately 56.6% of cells became small round and epithelioid on d 24 by morphology. Compared with the control, levels of AFP increased significantly from d 12 to 15.5±1.4 μg/L (t = 2.31,P<0.05) in MSCs cultured with FGF-4 and HGF, and were higher (46.2±1.5 μg/L) on d 21 (t = 41.926, P<0.01), then decreased to 24.8±2.2 μg/L on d 24 (t = 10.345, P<0.01). Albumin increased significantly on d 21 (t = 3.325,P<0.01) to 1.4±0.2 μg/mL, and to 2.1±0.7 μg/mL on d 24 (t= 3.646, P<0.01). Urea (2.3±0.4 mmol/L) was first detected on d 21 (t= 6.739, P<0.01), and continued to increase to 2.6±0.9 mmol/L on d 24 (t = 4.753, P<0.01). Glycogen storage was first seen on d 21. CONCLUSION: The method combining gradient density centrifugation with plastic adherence can isolate MSCs. Rat MSCs may be differentiated into hepatocytes by FGF-4 and HGF. Cytokines may play a more important role in differentiation from rat MSCs into hepatocytes.     

Hepatic differentiation capability of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells

AIM: To investigate the different effects of mesenchymal stem cells (MSCs) and hematopoietic stem cells (HSCs) on hepatic differentiation. METHODS: MSCs from rat bone marrow were isolated and cultured by standard methods. HSCs from rat bone marrow were isolated and purified by magnetic activated cell sorting. Both cell subsets were induced. Morphology, RT-PCR and immunocytochemistry were used to identify the hepatic differentiation grade. RESULTS: MSCs exhibited round in shape after differentiation, instead of fibroblast-like morphology before differentiation. Albumin mRNA and protein were expressed positively in MSCs, without detection of alpha-fetoprotein (AFP). HSCs were polygonal in shape after differentiation. The expression of albumin signal decreased and AFP signal increased. The expression of CK18 was continuous in MSCs and HSCs both before and after induction. CONCLUSION: Both MSCs and HSCs have hepatic differentiation capabilities. However, their capabilities are not the same. MSCs can differentiate into mature hepatocyte-like cells, never expressing early hepatic specific genes, while Thy-1.1(+) cells are inclined to differentiate into hepatic stem cell-like cells, with an increasing AFP expression and a decreasing albumin signal. CK18 mRNA is positive in Thy-1.1(+) cells and MSCs, negative in Thy-1.1(-) cells. It seems that CK18 has some relationship with Thy-1.1 antigen, and CK18 may be a predictive marker of hepatic differentiation capability.     

胆汁化血清对骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞定向分化的诱导

目的:寻找生物人工肝和肝细胞移植需要合适的肝细胞来源,研究不同诱导方法对骨髓间充质干细胞(MSC)在体外分化为肝细胞样细胞的影响。方法:本研究应用贴壁法对MSC进行分离和培养后,应用胆汁化血清及肝细胞生长因子不同诱导方式对之进行诱导分化,研究MSC转化为肝细胞样细胞的可能性,并进行转化的鉴定。结果:经贴壁分离和培养的MSC在5%胆汁化血清诱导作用下,21 d后可分化为形态似肝细胞样的细胞,经免疫组织化学显示,该细胞可表达细胞角蛋白18(CK18)和甲胎蛋白(AFP),且原位杂交显示,在培养的第35天,部分细胞还可合成清蛋白,与肝细胞生长因子(HGF)有着相似的诱导效果。结论:在合适的条件下,MSC可向肝细胞方向转化,且本方法操作简捷,胆汁化血清易于获得,具有潜在的应用价值。     

体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的:体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化(BMSCs)为肝样细胞,提高分化效率.方法:将第一代BMSCs随机分为诱导组和对照组.诱导组加肝细胞生长因子、成纤维生长因子、表皮生长因子、抑瘤素M等进行诱导培养,观察细胞形态,检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(A1b)、细胞角蛋白18(CK18)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和细胞色素P450 2b9(CYP2b9)的mRNA表达,A1b合成以及A1b和CK18蛋白标记细胞阳性率.结果:诱导组第3天出现多边形细胞,5—7d上皮样细胞呈岛状分布,14 d呈铺路石状.对照组细胞为长梭形.第7,14,21天,诱导组细胞AFP,A1b,CK18 mRNA和A1b蛋白检测阳性;第14,21天,细胞表达TAT和CYP2b9 mRNA.对照组除AFP mRNA呈弱阳性外,其余均为阴性.第7,14,21天,诱导组CK18阳性率分别为71.4%.75.9%,80.6%:A1b阳性率分别为75.0%,79.7%.81.1%.而对照组第7天CK18和A1b阳性率仅2.3%,1.7%,与诱导组相比有显著差异(P_(CK18)=1.97×10~(-5),P_(A11b)=3.08×10~(-6)).结论:BMSCs在体外可以被诱导分化为肝样细胞,诱导率最高可达80%以上.     

Liver-specific gene expression in mesenchymal stem cells is induced by liver cells

AIM: The origin of putative liver cells from distinct bone marrow stem cells, e.g. hematopoietic stem cells or multipotent adult progenitor cells was found in recent in vitro studies. Cell culture experiments revealed a key role of growth factors for the induction of liver-specific genes in stem cell cultures. We investigated the potential of rat mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow to differentiate into hepatocytic cells in vitro. Furthermore, we assessed the influence of cocultured liver cells on induction of liver-specific gene expression. METHODS: Mesenchymal stem cells were marked with green fluorescent protein (GFP) by retroviral gene transduction. Clonal marked MSC were either cultured under liver stimulating conditions using fibronectin-coated culture dishes and medium supplemented with SCF, HGF, EGF, and FGF-4 alone, or in presence of freshly isolated rat liver cells. Cells in cocultures were harvested and GFP+ or GFP-cells were separated using fluorescence activated cell sorting. RT-PCR analysis for the stem cell marker Thy1 and the hepatocytic markers CK-18, albumin, CK-19, and AFP was performed in the different cell populations. RESULTS: Under the specified culture conditions, rat MSC cocultured with liver cells expressed albumin-, CK-18, CK-19, and AFP-RNA over 3 weeks, whereas MSC cultured alone did not show liver specific gene expression. CONCLUSION: The results indicate that (1) rat MSC from bone marrow can differentiate towards hepatocytic lineage in vitro, and (2) that the microenvironment plays a decisive role for the induction of hepatic differentiation of rMSC.