UMR106细胞膜钾离子通道的记录及鉴定方法研究

目的：建立一种研究大鼠成骨肉瘤细胞（UMR106）钾离子通道的方法。方法：采用膜片钳技术，在细胞贴附方式下用内面向外的方法记录。并用TTX、CdCl^2分别阻断电压依赖性钠通道和钙通道。结果：首次在URM106细胞上记录到一种电导为8.79ps电压依赖性钾通道的通道电流。并观察了开放时间、关闭时间以及开放概率随电压的变化。结论：通过使用钾通道阻断剂证实本方法记录的是一种电压依赖性内向整流型钾通道。     

肾上腺髓质瘤无性繁殖细胞膜上的异常整流钾通道

作者用斑片钳技术,在传代培养的大鼠肾上腺髓质瘤无性繁殖细胞(PC12 cell)膜上记录电压依赖性钾离子通道活动。观察到两种超极化时激活的内向离子流,电导为30～60皮西门(PS)及大于100 pS。电导大的通道活动常呈大的闪动样关闭及簇状猝发。电导30～60 pS的钾通道具有如下特征:①明显的电压依赖性。在膜超极化到阈电位水平(30 mV)时,通道开放。同一电压下,单通道电流幅度基本一致,呈正态分布。不同钳位电压下,随着超极化程度增大,电流幅度渐增大。②平均开放时间和开放概率随超极化程度增大而增大,关闭时间则随之而减小。③I-V曲线上显示翻转电位接近K~ 的平衡电位。④钾通道阻断剂TEA能阻断该通道。     

人外周血淋巴细胞膜电压依赖性钾通道特性分析及试分型

目的 :研究人淋巴细胞膜电压依赖性钾〔K(v)〕通道的特性 ,为某些疾病状态下该通道特性变化提供对照。并试观察该通道是否存在不同亚型。方法 :膜片钳全细胞电流记录方法。结果 :在记录到的 39个细胞中 ,K(v)通道的激活电压为 - (40 .3± 2 .5) m V,在重复去极化状态下通道无失活 ,复极过程中通道的关闭时间为 (116 .3± 8.2 ) ms,且通道电流可被 10 mmol/ L的四乙基铵 (TEA)所阻断。结论 :人外周淋巴细胞膜可能仅具有一种〔K(v)〕通道 ,其特性与鼠 n型〔K(v)〕通道基本一致。     

动脉平滑肌细胞膜片制作及其大电导钙激活钾通道的特性

目的: 探讨人体小动脉平滑肌细胞膜片制作方法,观察其上大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activatedpotassium channels,BK_Ca)的特性。方法: 将新鲜分离出的人肠系膜动脉,分离出平滑肌层,经酶解得单个平滑肌细胞。取平滑肌细胞置于含对称性高钾(K+140 mmol/L)浴液中,用膜片钳技术记录其单通道电流,输入计算机进行数据采集与分析。观察动脉平滑肌细胞三种膜片的制作过程和BK_Ca的特性。结果: 在肠系膜动脉平滑肌细胞膜上分别形成了细胞贴附式、内面向外式、全细胞记录三种膜片。用膜片钳技术观察到急性酶分离的人体肠系膜动脉平滑肌细胞上BK_Ca通道具有钙敏感性:表现为胞内游离钙离子浓度增加,通道开放事件数目增加;电压依赖性:表现为随着膜电位的增加,通道开放事件数逐渐增加;电导值大:本实验的电导值为198.6±38.09 pS;应用TEA+为50 mmol/L时通道活动完全阻断。结论: 人体肠系膜动脉平滑肌细胞上BK_Ca通道具有钙敏感性、电压依赖性、大电导、TEA+敏感特性。     

肾上腺髓质瘤无性繁殖细胞的延时整流单钾离子通道

用片膜钳技术,在大鼠肾上腺髓质瘤无性繁殖细胞(PC12细胞)膜记录电压依赖性单钾离子通道活动:在细胞贴附式下去极化电流可激活一个电导为35～55皮西门(pS)的外向钾离子单通道。通道开放呈爆发型和快速闪动型,平均开放时间在0.5～20ms范围,其潜伏期随去极化程度增大而略变小。由撕开的膜片测得的翻转电位表明此通道选择性地让钾离于通过。通道在低钙(10 nmol/L自由钙离子)溶液中开放,增高胞浆侧钙离于浓度对通道开放无明显影响。20mmol/L四乙铵(TEA)可阻断该通道。在200ms的去极化脉冲中通道开放时间所占比例随去极化程度增大而增大,每20～30mV电位可使开放比率增高e(2.73)倍。在7～25秒长的去极化维持电位中,通道进入然后退出一个长时间的失活状态。以上结果表明,这类通道属于延时整流型钾通道。     

大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌大电导钙激活钾通道的特性

目的探讨肠系膜细动脉血管平滑肌细胞膜上大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)的电生理特性及其与张力调节的可能机制。方法木瓜酶、胶原酶两步消化法急性分离大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞,膜片钳的内面向外式记录法记录BKCa。结果(1)在浴槽液和电极液均为高钾的条件下,BKCa通道的单通道电导为(221±6)pS,反转电位为-0.12 mV;(2)BKCa通道的电流幅度无细胞内钙依赖性,而开放概率(NPo)则同时具有电压依赖性和细胞内钙依赖性。在细胞内钙浓度为0.1 μmol/L时, 使NPo增加e倍的电压增加为(13±1)mV, 达到最大开放概率一半的电压(V1/2)为(22±2)mV;(3)在细胞内钙浓度为1 μmol/L时,可记录到通道长时间的关闭和失活现象,这种现象称为钙依赖性失活。结论肠系膜细动脉血管平滑肌细胞膜上的BKCa具有大电导、高钾选择性、强电压依赖性和高度的细胞内钙敏感性。BKCa高度的钙敏感性可能与血管平滑肌病理情况下的代偿调节有关。     

人外周血淋巴细胞电压依赖性钾通道

目的:观察人外周血淋巴细胞膜上电压依赖性钾通道的特性.方法:膜片钳记录方法.结果:观察到该通道的最小激活电压为-38.6士2.1 mV.复极过程中通道关闭常数为109.25±8.5 ms,并可被10 mmol/L的TEA所阻断.结论:人外周血淋巴细胞膜上存在着电压依赖性钾电流,其特性与神经和肌肉细胞膜上的延迟整流性钾电流相类似.     

肠系膜细动脉平滑肌细胞的分离及其ATP敏感钾通道特性

旨在探索一种分离细动脉平滑肌的方法，并研究其ATP敏感钾通道（KATP）的特性。采用链酶蛋白酶E消化及机械分离的方法分离细胞，以膜片钳技术之细胞贴附式和内面向外式记录KATP通过电流。该平滑肌的分离方法简单；细动脉平滑肌KATP通道在高钾平衡液中电导为（111．0±6.5）pS，门控动力学表现明显的ATP和电压依赖性，通道开放概率低，提示其对缺血、缺氧、酸中毒等病理条件下细动脉张力和组织血流分布的调节具有潜在的作用。     

木黄酮对小鼠胰岛β细胞上电压依赖性钾电流的影响

目的:研究酪氨酸激酶抑制剂木黄铜活性对胰岛β细胞中电压依赖性钾电流的影响,探讨酪氨酸激酶在胰岛β细胞中的作用.方法:原代培养小鼠胰岛β细胞,经0.1mmol/L酪氨酸激酶抑制剂木黄酮急性处理处理或者慢性处理12h后,运用全细胞电流记录的方法观察电压依赖性钾电流的改变.结果:木黄酮急性处理可显著抑制小鼠胰岛β细胞的电压依赖性钾电流.木黄酮处理12h后,小鼠胰岛β细胞的电压依赖性钾电流较对照组明显减小,降低为对照组的59.3%8.5%(P<0.01,n=6).结论:木黄酮抑制小鼠胰岛β细胞中电压依赖性钾电流,提示酪氨酸激酶活性抑制在胰岛β细胞功能损害中具有重要作用.     

缺氧缺糖对大鼠大脑皮层神经元电压依赖性钾通道的影响

目的：研究在缺氧缺糖状态下，大鼠大脑皮层神经元膜电压依赖性钾通道的开关动力学变化。方法：急性分离大鼠大脑皮层神经元和细胞贴附膜片钳技术。结果：与对照组相比，在缺氧缺糖状态下，电压依赖性钾通道开放时间常数τ１和τ２分别由对照组的０．４２９ｍｓ和８．２０９ｍｓ增加至１．８５５ｍｓ和１７．４６４ｍｓ（Ｐ＜０．０１），关闭时间常数τ和通道的电流幅度无明显变化。结论：缺氧缺糖可导致大鼠皮层神经元电压依赖性钾通道开放显著增加，对胞外钾离子聚集起重要作用，从而提高细胞的兴奋性，参与神经元的损伤。     

原代培养猪冠状动脉平滑肌的电压依赖和钙激活钾通道

目的：研究原代培养的猪冠状动脉平滑肌电压依赖性和钙激活外向钾通道的特性。方法：离子通道电流采用膜片钳技术进行记录。结果：在内面向外式膜片构型,当膜内外K^ 浓度梯度类似生理状态时,该通道单位电导值约为100pS,而当膜内外K^ 浓度为对称的140mM浓度时,该通道单位电导值约270pS。其平均电流显示该通道具时间和电压依赖性激活特性,而无任何时间和电压依赖性失活特性。另外,通道的开放时间常数和开放概率随除极及胞内Ca^2 的增加而显著增加。通过用EGTA降低胞浆内Ca^2 浓度,可使外向电流抑制。动力学分析显示通道激活时存在一种开放状态和至少两种关闭状态。四乙胺（TEA）可在胞外侧阻断该电流,但高达15mM的4－氨基吡啶（4－AP）在胞内外都对通道无影响。在全细胞构型,对细胞膜进行除极可引出宏观外向电流。随着细胞的除极,该电流的激活时间常数逐渐缩短,并显示快速激活动力学特性。结论：在原代培养的猪冠状动脉平滑肌上存在有电压依赖和Ca^2 激活的K^ 选择性离子通道。该类通道具有非常高的单位电导值,除极时快速开放,对胞内Ca^2 高度敏感,但无失活等特性。     

钾离子通道在EGF引起细胞增殖中的作用

目的 :研究表皮生长因子 (EGF)对大鼠成骨肉瘤细胞钾离子通道活动的影响 ,探讨这种钾通道活动与细胞增殖的关系。方法 :采用膜片钳技术 ,在细胞贴附方式下用内面向外的方法记录。在含有EGF(10ng/ml)的无血清培养液中培养 2 4h后记录钾通道 ,同时用3 H -TdR掺入法及流式细胞仪测定DNA合成的变化并进行细胞周期分析。结果 :含有EGF的培养液培养细胞的钾通道电流较对照实验有明显增加 ,通道开放概率也增加。同时 ,EGF加入使细胞的3 H -TdR掺入率增加 6 4 91% ;进入S期细胞增加 35 %。在EGF作用的不同时期加入钾通道阻断剂 ,可以不同程度的抑制DNA合成 ,并且阻断剂加入时间越早 ,对DNA合成的抑制越强。结论 :钾通道在细胞进入S期或在S期的活动中起重要作用。阻断钾通道可以较明显地抑制DNA合成 ,揭示出钾通道的活动与DNA合成和细胞增殖有密切关系。     

肾上腺素对大鼠心室肌细胞钙通道促进作用的单通道分析

目的：观察肾上腺素对大鼠心肌细胞钙通道作用机理。方法：使用斑片钳技术，在培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠心肌细胞上记录Ｔ、Ｌ、Ｂ三型钙通道的单通道电活动。结果：肾上腺素对心肌细胞钙通道Ｌ、Ｂ单通道开放时间延长，开放概率增加，平均关闭时间缩短（Ｐ值均小于０．０１），对流过钙通道的Ｃａ２＋流幅值无影响。肾上腺素对Ｔ型钙通道活动有促进作用趋势，但无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。结论：肾上腺素对大鼠心肌细胞的作用和已知钙通道激动剂ＢＡＹ·Ｋ８６４４作用相似，和钙通道阻滞剂异搏定作用相反     

应用膜片钳制技术对豚鼠耳蜗外毛细胞高电导钾通道电生理特性的研究

为了研究耳蜗外毛细胞的基本电生理特性，应用细胞膜片钳制技术对豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜的高电导的钾通道进行了初步研究。结果显示，其高电导钾通道有以下典型特征：①具有明显的电压依赖性。在膜去极化时，通道被激活，其去极化程度越高，通道活动越强。在非对称性钾浓度梯度下，其反转电位为－３０ｍＶ，斜率电导约１３３±３ｐＳ（ｎ＝５）；②通道活动能被特异性阻断剂四乙胺（ＴＥＡ）在较高浓度下（＞１０ｍｍｏｌ／Ｌ）阻断，ＴＥＡ的阻断效应呈浓度依赖性；③胞浆内钙浓度的增高，能显著激活该通道，增加其开放概率和平均开放时间。上述结果表明：豚鼠耳蜗外毛细胞存在着高电导的电压依赖的钙激活的钾通道。该研究为进一步开展通道活动的调控，以及药物等因素对通道活动影响的研究，提供了有价值的资料。     

ATP sensitive K+ channel may be involved in the protective effects of precon ditioning in isolated guinea pig cardiomyocytes

Objective To develop a cellular model of preconditioning by a brief period of hypoxia in isolated guinea pig cardiomyocytes and to determine whether or not an ATP sensiti ve K(+) (K(ATP)) channel is involved in ischemic precond itioning. Methods Single myocytes were isolated from the ventricle of adult guinea pigs.The expe rimental chamber allowed the cells to be exposed to low O(2)pressure.During h ypoxic preconditioning, the cells were equilibrated with normaxic solution for 1 0 minutes and then exposed to hypoxia for 5 minutes, followed by 10 minutes of re oxygenation.The cells were then subjected to 20-180 minutes of hypoxia and reoxygenation.Ionic currents were studied with the patch clamp technique in w hole-cell and cell-attached configurations. Results A 5-minute hypoxic preconditioning offered a significant protection from cell i n jury in subsequent hypoxia-reoxygenation.After a latency of more than 15 minu tes, hypoxia induced a time-independent outward K(+) current which could be blo cked by 5 μmol/L glibenclamide.At 10 mV, the current increased from 78 ±1 5 pA to 1581±153 pA (P&lt;0.01, n=18).However, the latency to develop K(ATP) channel currents (I(KATP)) was greatly shortened in preconditioned c ells, and the current was increased acceleratively.At 10 mV, the current more than 4 nA was recorded in preconditioning cells.In the single channel record ings, the time interval from the first channel opening to maximum opening was also markedly abbreviated in preconditioned cells.Conclusion Isolated guinea pig cardiomyocytes can be preconditioned with a brief period of hypoxia.This hypoxic preconditioning may modify the K(ATP) channel, and make the channel open more readily during the second hypoxia.     

大鼠心室肌细胞单通道钙电流的记录及其电生理学特性分析

 目的分离大鼠心室肌细胞,记录大鼠心室肌细胞的单通钙电流,并分析其基本电生理学性质。方法胶原酶法分离大鼠心室肌细胞;应用膜片钳技术细胞贴附式和内膜向外式记录L-型钙通道的电流,并用pClamp10分析软件进行分析。结果分离得到了大鼠心室肌细胞,细胞存活形态良好,呈杆状或柱状,具有清晰的横纹。记录到的L-型钙通道单通道电流,平均电流幅度为（1.13±0.01）pA,电导为19pS,平均开放时间常数为（1.35±0.03）ms,平均关闭时间常数为（46.75±10.04）ms。此外,还记录到了L-型钙通道的Run-down现象。结论本实验分离得到的大鼠心室肌细胞适用于膜片钳单通道记录模式;记录到的L-型钙通道的基本电生理学性质与文献报道相符。     

Mg~(2+)对猪冠脉平滑肌细胞钙激活钾通道的激活作用的初步研究

目的：研究Mg2+对猪冠脉平滑肌细胞钙激活钾通道的作用,以揭示Mg2+扩血管作用的电生理机制。方法：应用膜片钳制技术inside－out方式记录冠脉平滑肌上的单通道活动,经PCLAMP软件进行微机采样储存数据和数据的分析处理。结果：Mg2+对猪冠脉平滑肌钙激活钾通道具有明显激活作用：增强通道开放概率P0,增加膜片通道开放数目。结论：Mg2+对钙激活钾通道的激活作用可能为Mg2+调节心血管活动的重要机制之一。     

延迟整流性K+通道在人肝癌细胞增殖中的作用

目的：研究延迟整流性Ｋ＋通道在人肝癌细胞增殖中的作用。方法：采用膜片钳技术的全细胞记录方式记录人肝癌细胞在不同浓度ＥＧＦ中延迟整流性Ｋ＋通道的跨膜电流。利用氚标记的胸腺嘧啶核苷（３ＨＴｄＲ）掺入技术观察ＥＧＦ和Ｋ＋通道阻断剂（ＴＥＡ）对人肝癌细胞ＤＮＡ合成的影响。结果：发现表皮生长因子（ＥＧＦ）促进肝癌细胞增殖的同时使肝癌细胞膜离子通道的跨膜Ｋ＋电流增加。Ｋ＋通道阻断剂四乙胺（ＴＥＡ）能显著抑制ＥＧＦ促进ＤＮＡ合成的作用,具有明显的量效关系和时间依赖性,但对细胞的活力无明显影响。结论：人肝癌细胞的增殖活动需要延迟整流性Ｋ＋通道参与。     

R_(b1)对B型钙通道的阻滞作用及其机理的单通道分析

在Wistar大鼠单个心室肌细胞上记录了B型钙通道的单通道活动。人参二醇组皂甙单体R_(b1)250μg/ml显著抑制B型钙单通道活动,其机制在于使其开放概率减少与开放时间缩短,而对通过此通道的离子流幅度无影响。     

不同潮气量机械通气大鼠血清对血管内皮细胞钙激活钾通道的影响

目的:研究不同潮气量机械通气大鼠血清对血管内皮细胞钙激活钾通道(KCa通道)的影响.方法:健康雄性SD大鼠随机分为A组(麻醉后不做任何处)和B、C组(麻醉后行气管切开插管并分别给予不同潮气量(VT)的机械通气4h.B组VT10mL/kg,C组40 mL/kg),通气结束后取各组大鼠血清,分别刺激已培养好的人脐静脉内皮细胞(ECV304)30 min,利用细胞贴附式膜片钳观察KCa通道的变化.结果:B、C组内皮细胞KCa通道开放率明显上升,且以C组最为明显.结论:不同VT机械通气大鼠血清对ECV304 KCa通道的开放、关闭具有一定的影响.