人原发性肝癌中p16基因缺失突变研究

目的　探讨 p16基因缺失和突变在人原发性肝癌分子发病机理中所起的作用。方法　采用多重PCR和 PCR- SSCP对 31例人原发性肝癌、31例癌旁肝硬化组织以及 8例正常人白细胞中 p16基因第一 ,二外显子和部分第一 ,二内含子缺失和突变进行了研究。结果　在 31例人原发性肝癌中发现 4例 p16基因第一外显子和部分第一内含子区域缺失 ,缺失率为 13% ,第二外显子和部分第二内含子区域未见缺失 ;SSCP分析发现在肝癌和癌旁肝硬化组织中 p16基因第一内含子及其下游第二外显子 18bp区域存在三种单链构象 ,第一外显子、大部分第二外显子以及部分第二内含子未见异常的 SSCP区带 ,而在正常人白细胞中有两种单链构象。结论　在人原发性肝癌中 p16基因缺失频率较低 ,罕见突变     

人原发性肝癌中p15基因第二外显子突变研究

为探讨ｐ１５抑癌基因在人原发性肝癌分子发病机理中所起的作用，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ对３５例人原发性肝癌、３５例癌旁肝硬化组织以及１０例正常人白细胞中ｐ１５基因第二外显子的突变进行了初步研究。结果显示：除１例癌旁肝硬化组织中发现迁移率异常的ＳＳＣＰ区带外，其余肝癌及癌旁组织未见异常ＳＳＣＰ区带。对该例异常ＳＳＣＰ区带ＤＮＡ进行克隆和序列分析，显示为３４５ｂｐ野生型的ｐ１５基因第二外显子序列。由此提示：人原发性肝癌中ｐ１５基因第二外显子突变发生率很低或没有突变。     

人原发性肝癌中p15基因第二外显子突变研究

为探讨Ｐ１５抑癌基因在人原发性肝癌分子发病机理中所起的作用。采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ对３５例人原发性肝癌、３５例癌旁肝硬化组织以及１０例正常人白细胞中Ｐ１５基因第二外显子的突变进行了初步研究。     

原发性肝细胞癌中p16、p15、p53基因缺失、突变以及HBV DNA在肝细胞癌中整合的研究

目的构建人p16基因第二外显子cDNA克隆,制备其cDNA探针，建立p16基因第二外显子PCR-Southern Blot分析方法。研究原发性肝细胞癌(HCC)p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子纯合性缺失，p53基因第七外显子纯合性缺失、点突变以及HBV 前C区、S区、X区在HCC中整合情况。方法用RT-PCR获得p16基因第二外显子cDNA，将其插入质粒pGEM-T中，构建为重组质粒pGEM-pl6。经蓝白选择、限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列分析筛选获得重组质粒的阳性克隆，插入片段经限制性内切酶酶切、纯化后，用随机引物法标记地高辛，以此为探针，用Southern Blot方法分析p16第二外显子PCR产物。应用PCR、PCR-SSCP和PCR-RFLP等方法，对临床38例HCC手术后标本中的p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子、p53基因第七外显子纯合性缺失和点突变进行分析。应用PCR和3' 末端碱基特异性PCR分析肝细胞癌基因组HBV前C区野生型和突变型、PCR分析S区和X区整合的情况。同时检测了血清中HBV 前C区的阳性率。结果重组质粒的限制性内切酶酶切图谱分析表明其酶切位点与原设计相符，插入片段大小为307bp，与引物区间大小一致；地高辛标记探针可与p16 PCR产物杂交。发现在这38例HCC患者中，p16基因第二外显子的缺失率为34.2%，p16基因第一外显子和p15基因第二外显子未发现缺失；未发现p53基因第七外显子纯合性缺失，但4例存在p53基因249密码子点突变，且均为杂合型突变，突变率为10.53%。HBV前C区野生型阳性率为42.1%, 其中10例伴有突变型阳性(26.3%)。HBV X区阳性率为44.7%，HBV S区阳性率为50%。患者血清中，HBV 前C区野生型阳性率为15.8%, 突变型阳性率为18.4%。结论所获重组质粒为pGEM-pl6设计构建，并成功地获得p16第二外显子的cDNA探针和建立了p16 Southern Blot分析方法。所获结果提示在肝细胞癌中p16基因第二外显子的纯合性缺失是p16基因失活的一个重要方式，而纯合性缺失不是p15基因在肝细胞癌中的失活方式，但并不排除存在其它失活方式。p53基因第七外显子的杂合性突变提示有肿瘤遗传倾向。未发现纯合性点突变提示在肝细胞癌发生机制中p53基因第七外显子的点突变并不占据主导地位。HBV DNA 在原发性肝细胞癌基因组中可能存在整合,并在HCC发生过程中起一定作用。     

66例鼻咽癌石蜡包埋标本p16基因第二外显子的检测

目的 研究鼻咽癌p16基因第二外显子的状态。方法 采用多重PCR分析法，单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）法分别对66例鼻咽癌石蜡包埋标本与相应的癌旁组织中p16基因突变情况进行检测。结果 66例肿瘤标本中，发现24例p16基因缺失，点突变未检出，而相应的癌旁组织未检出缺失。结论 p16基因在鼻咽癌中存在高频率的缺失，其改变在鼻咽癌发病过程中具有一定的作用。     

人肝癌组织中nm23-H1基因突变的检测及意义

目的观察肿瘤转移抑制基因nm23-H1在人原发性肝细胞癌中的突变情况,探讨nm23-H1基因突变与肝癌发生、发展及转移的关系。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术（PCR-SSCP）,对16例肝癌组织、12例癌旁组织和4例正常肝组织的nm23-H1基因的第1、2、4外显子突变情况突变进行检测。结果肝癌组织中有1例nm23-H1基因第1外显子纯合缺失;肝癌组织中1例第1外显子、1例第2外显子,癌旁组织中2例第2外显子有单链DNA泳动变位。结论nm23-H1基因突变在肝癌组织中发生率低。     

膀胱移性细胞癌p16基因缺失、突变、甲基化及其蛋白表达的研究

目的对25例膀胱移性细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,简称膀胱癌)患者的p16基因第一、第二外显子纯合性缺失,第二外显子的点突变,第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况及p16蛋白表达进行检测,探讨p16基因在膀胱癌中失活的方式及p16蛋白表达与膀胱癌之间的关系. 方法取患者膀胱癌组织,用酚/氯仿法提取癌组织基因组DNA,设计p16基因第一、二外显子引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、PCR-单链构象多态性 (PCR-single strand conformational polymorphism, PCR-SSCP)、甲基化敏感限制性内切酶-PCR分析方法,对25例膀胱癌患者的癌组织基因组DNA的p16基因第一、二外显子的纯合性缺失、第二外显子点突变及第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况进行分析.应用S-P免疫组织化学方法检测25例膀胱癌和6例正常膀胱黏膜组织中p16基因的表达情况,并分析其意义. 结果在这25例膀胱癌患者中,发现p16基因第二外显子缺失者有4例,第一外显子和第二外显子共同缺失者有1例,第一外显子缺失者1例,p16基因的缺失率为24%(6/25);未发现p16基因第二外显子的点突变; p16基因第一外显子区5＇CpG岛的甲基化率为69.6%(16/23).p16基因表达在膀胱癌组织中阳性率为52%(13/25),6例正常膀胱黏膜组织中均阳性,两者比较差异有显著性(P<0.01).随病理分级、临床分期的上升和预后的不良,p16基因的阳性表达率有下降趋势,但差异无显著性(P＞0.05).结论 p16基因的失活方式主要有三种:纯合性缺失、点突变和5＇CpG岛的甲基化,但外显子2的纯合性缺失在安徽区域发生的膀胱癌中可能不是一个较频繁发生的"事件";通过p16基因第一外显子区5＇CpG岛异常甲基化失活可能是膀胱癌p16基因失活的主要机制.在这25例膀胱癌患者中,未发现p16基因的点突变,但仍不能排除这种失活机制,我们将通过扩大样本,进一步研究p16基因的点突变情况.p16基因表达产物与膀胱癌的发生发展及预后可能有关系,也有待于扩大例数进一步研究.p16基因表达产物可作为诊断膀胱癌的指标之一.     

原发性膀胱移行细胞癌中p16基因状态的研究

目的：研究原发性膀胱移行细胞癌中p16基因的状态。方法：采用多重PCR分析法、SSCP分析法及以PCR为基础的甲基化分析法，分别对40例原发性膀胱移行细胞癌及其相应的癌旁组织中，p16基因的缺失、突变及甲基化情况进行了检测。结果：40例肿瘤标本中，发现7例（17．5％）p16基因缺失，3例（7．5%）发生了突变，9例（22．5％）有甲基化存在。全部相应的癌旁组织中均未发现有p16基因缺失、突变或甲基化存在。结论：p16基因的异常改变在原发性膀胱移行细胞癌的发生与发展中可能起重要作用。     

原发性肝细胞癌中p16和cyclinD1蛋白表达及p16突变研究

目的：研究p16和cyclinD1蛋白表达及p16基因第2外显子突变与原发性肝细胞癌（HCC）发生的关系。方法：利用SP免疫组织化学方法与多聚酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）分析技术分别检测44例HCC及癌旁肝组织p16和cyclinD1蛋白表达和12例新鲜手术肝癌组织的p16基因突变。结果：HCC中p16蛋白阳性率和阳性信号强度明显低于癌旁肝组织（P＜0．01）,而cyclinD1蛋白阳性率和阳性信号强度明显高于癌旁肝组织,12例新鲜HCC标本中p16基因第2 子突变率为16．7％（2／12）,癌旁组织未发现p16基因第2外显子突变;有p16基因突变的HCCp16蛋白表达呈阴性。结论：P16蛋白失活或／和缺乏可能是肝细胞增殖失控的重要因素之一;HCC存在P16基因第2外显子突变,但不是频发事件;在HCC形成过程中,P16基因异常与cyclinD1过度表达可能存在协同作用。     

p16蛋白及其基因在原发性肝细胞癌中的表达缺失及意义

目的:通过p16蛋白及其基因在原发性肝细胞癌中的表达缺失研究,探讨p16基因与肝癌的关系.方法:收集我院原发性肝癌32例,用免疫组织化学SP法、聚合酶链式反应(PCR)方法分别检测肝癌及癌旁组织中p16蛋白的表达及其基因的缺失情况.结果:32例肝癌中,p16蛋白表达缺失率为2.5%(20/32),癌旁组织中p16蛋白表达缺失率为3.13%(1/32),两者差异有显著意义(P<0.01).P16蛋白的表达与肝癌分化程度关系密切(P<0.01).P16基因在癌组织中的缺失率25%(8/32,均为p16蛋白表达缺失者),在癌旁组织为3.13%(1/32),相差显著(P<0.05).结论:p16基因缺失与肝癌发生关系密切,提示p16蛋白可能是预测患者预后的一个指标,但仍需进一步确证.     

p16蛋白及其基因在原发性肝细胞癌中的表达缺失性研究

目的通过p16蛋白及其基因在原发性肝细胞癌中的表达缺失研究,探讨p16基因与肝癌的关系.方法收集我院原发性肝癌32例,用免疫组织化学SP法、聚合酶链式反应(PCR)方法分别检测肝癌及癌旁组织中p16蛋白的表达及其基因的缺失情况.结果32例肝癌中,p16蛋白阴性表达率为62.5%(20/32),癌旁组织中p16蛋白阴性表达率为3.13%(1/32),两者差异有显著意义(P＜0.01).p16蛋白的表达与肝癌分化程度关系密切(P＜0.05),而与癌灶体积、甲胎球蛋白(AFP)值的差异无显著意义(P＞0.05).p16基因在癌组织中的缺失率25%(8/32),在癌旁组织为3.13%(1/32),相差显著(P＜0.05).p16基因缺失与肝癌分化程度、癌灶体积、AFP值无关(P＞0.05).结论p16基因缺失与肝癌发生关系密切,提示p16蛋白可能是预测病人预后的一个指标,但仍需进一步确证.     

鼻咽癌p16基因表达与突变的对比研究及意义

目的探讨p16蛋白表达与p16基因突变在鼻咽癌发生中的作用,以确定两者之间的联系及意义.方法运用免疫组化二步法检测鼻咽癌中p16蛋白表达状况;采用多重PCR法检测鼻咽癌中p16基因第二外显子可能的缺失突变.结果p16蛋白表达缺失率鼻咽癌组中55.3%(26/47),慢性鼻咽炎8%(2/25),鼻咽癌组中p16蛋白表达缺失率高于慢性鼻咽炎组(P＜0.001);p16基因第二外显子缺失突变鼻咽癌组中纯合缺失突变率34%,而相应的癌旁组织未检出(P＜0.001);鼻咽癌p16蛋白表达缺失率高于p16基因外显子2缺失率.结论鼻咽癌的发生不仅与p16基因表达缺失和突变密切相关,而且p16蛋白表达下调可能是鼻咽癌发生发展的主要原因.     

甲状腺癌组织端粒酶激活与p16基因失活的关系

目的探讨甲状腺癌细胞增殖、分化与端粒酶激活及抑癌基因p16失活（缺失突变）之间可能存在的关系。方法应用TRAP、多重PCR、免疫组化法检测42例甲状腺癌与16例癌旁组织端粒酶活性、P16基因外显子2缺失、P16蛋白表达。结果甲状腺癌组端粒酶活性90．48％,高于癌旁组织（P〈0．01）;甲状腺癌p16基因外显子2纯合缺失率28．57％,相应癌旁组未检出（P〈0．01）;甲状腺癌P16蛋白表达缺失率40．48％,高于癌旁组（P〈0．05）;甲状腺癌P16蛋白表达缺失率高于p16基因外显子2缺失率。结论端粒酶激活与p16基因失活以及P16蛋白表达下调可能是甲状腺癌变过程中的重要分子事件,甲状腺癌中p16基因失活可能是端粒酶激活的一种途径。     

胰腺癌MTS1／p16基因纯合性缺失和突变的研究

目的：研究人胰腺癌组织及正常胰腺组织中p16基因第1外显子和第2外显子的纯合性缺失和突变情况。探讨p16基因异常与胰腺癌的关系。方法：应用聚合酶链式反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）技术检测51例胰腺癌组织中p16基因第1外显子和第2外显子的纯合性缺失和突变频率,以正常胰腺组织15例为对照。结果：全部被检胰腺癌组织中有23例发生p16基因第2外显子缺失,缺失率45％,有1例发生第1外显子的突变,未发现第1外显子缺失和第2外显子突变。正常胰腺组织中均未发生第1外显子和第2外显子的缺失及突变。结论：p16基因缺失与胰腺癌的发生关系密切,p16基因的突变可能与胰腺癌的发生关系不大。     

人原发性肝癌中p16基因表达及CpG岛甲基化状态的研究

目的：进一步探讨人原发性肝癌中p16基因mRNA转录水平变化与其基因启动子区CpG岛甲基化的关系，及其在肝癌发生中的意义。方法：采用狭缝印迹杂交检测20例人原发性肝癌及相应的癌旁、远癌组织及2例正常人肝组织中p16基因mRNA表达水平，以甲基化特异性PCR分析各组织中p16基因启动子区CpG岛的甲基化状况，并进行统计分析。结果：20例人原发性肝癌中14例（70％）p16 mRNA水平比远癌组织显著降低；13例（65％）显示p16基因启动子区CpG岛甲基化，其中84．6％（11例）伴p16 mRNA转录水平降低。结论：人原发性肝癌中存在高频率的p16基因表达失活，其主要机制可能是启动子区CpG岛甲基化抑制了基因的转录，在人原发性肝癌的发生发展中有重要作用。其临床诊断和治疗意义有待进一步深入研究。     

原发性肝细胞癌中p16和cyclin D1蛋白表达及p16突变研究

目的 :研究p1 6和cyclinD1蛋白表达及p1 6基因第 2外显子突变与原发性肝细胞癌 (HCC)发生的关系。方法 :利用SP免疫组织化学方法与多聚酶链反应———单链构象多态性 (PCR SSCP)分析技术分别检测 44例HCC及癌旁肝组织p1 6和cyclinD1蛋白表达和 1 2例新鲜手术肝癌组织的p1 6基因突变。结果 :HCC中p1 6蛋白阳性率和阳性信号强度明显低于癌旁肝组织 (P <0 .0 1 ) ,而cyclinD1蛋白阳性率和阳性信号强度明显高于癌旁肝组织。 1 2例新鲜HCC标本中p1 6基因第 2外显子突变率为 1 6 .7% (2 /1 2 ) ,癌旁组织未发现p1 6基因第 2外显子突变 ;有p1 6基因突变的HCCp1 6蛋白表达呈阴性。结论 :p1 6蛋白失活或 /和缺乏可能是肝细胞增殖失控的重要因素之一 ;HCC存在p1 6基因第 2外显子突变 ,但不是频发事件 ;在HCC形成过程中 ,p1 6基因异常与cyclinD1过度表达可能存在协同作用     

原发性非小细胞肺癌中p16/MTS1基因外显子纯合性缺失的研究及临床意义

目的 检测原子性非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)手术标本p16基因（Multiple Tumor Suppressor Gene,MTS1)第一、二外显子纯合性缺失并探讨其与肿瘤细胞分化程度、组织类型、转移和预后的关系。方法 收集我院1999年1月－12月原发性支气管肺癌且手术病理证实为非小细胞肺癌32例。提取DNA,建立PCR方法分析p16基因第一、二外显子纯合性缺失,用Southern Blotting方法对p16第二外显子的PCR产物进行鉴定。结果 32例NSCLC患者中9例发生p16基因第二外显子的缺失,缺失率为28％（9／32）,p16第一外显子未发现缺失。结论 在原发性非小细胞肺癌中,p16基因第二外显子的纯合性缺失是p16基因失活的一个重要方式,且影响肺癌细胞其他生物学行为。     

垂体腺瘤组织P16蛋白表达缺失及原因分析

目的：探讨垂体腺瘤组织中p16的表达及表达缺失的原因。方法：取尸体解剖正常垂体标本6例,临床病理证实的垂体腺瘤标本40例,采用蛋白杂交技术检测P16蛋白的表达;核酸杂交分析p16基因的纯和性缺失;单链构象多态性分析筛选p16基因突变;甲基化分析检测无纯和性缺失和突变的30例肿瘤组织p16基因启动子的甲基化状态。结果：40例垂体腺瘤组织中P16蛋白表达缺失。核酸杂交40例标本10例出现p16基因的纯和性缺失,该10例MRI表现为侵袭性垂体腺瘤。单链构像多态性分析,30例无p16纯合性缺失标本血与肿瘤DNA配对扩增电泳筛选p16第一和第二外显子碱基突变,未发现p16的主要编码区第一、第二外显子存在突变。对无p16纯合性缺失和突变的30例进行甲基化分析发现p16基因启动子存在甲基化。结论：垂体腺瘤的发生与p16的表达缺失有关,其缺失的原因包括p16基因的纯和性缺失的启动子的甲基化,p16基因的纯和性缺失是侵袭性垂体腺瘤的分子标志之一。     

垂体腺瘤组织P16蛋白表达缺失及原因分析

目的 :探讨垂体腺瘤组织中p16的表达及表达缺失的原因。方法 :取尸体解剖正常垂体标本 6例 ,临床病理证实的垂体腺瘤标本 40例 ,采用蛋白杂交技术检测P16蛋白的表达 ;核酸杂交分析p16基因的纯和性缺失 ;单链构象多态性分析筛选p16基因突变 ;甲基化分析检测无纯和性缺失和突变的 30例肿瘤组织p16基因启动子的甲基化状态。结果 :40例垂体腺瘤组织中P16蛋白表达缺失。核酸杂交 40例标本 10例出现p16基因的纯和性缺失 ,该 10例MRI表现为侵袭性垂体腺瘤。单链构像多态性分析 ,30例无p16纯合性缺失标本血与肿瘤DNA配对扩增电泳筛选p16第一和第二外显子碱基突变 ,未发现p16的主要编码区第一、第二外显子存在突变。对无p16纯合性缺失和突变的 30例进行甲基化分析发现p16基因启动子存在甲基化。结论 :垂体腺瘤的发生与p16的表达缺失有关 ,其缺失的原因包括p16基因的纯和性缺失和启动子的甲基化 ,p16基因的纯和性缺失是侵袭性垂体腺瘤的分子标志之一。     

p16 nm23在原发性肝癌中的表达及临床意义

目的：探讨抑癌基因p16和抗癌基因nm23在原发性肝癌癌组织中的表达及其与预后的关系。方法：应用免疫化方法对31例原发性肝癌p16,nm23基因表达进行监测。结果:p16表达阳性率在原发性肝癌组为3．2％，明显低于CPH，CAH，LC组，nm23基因在肝癌癌旁组织表达阳性率为74．3％，远高于CPHJ，CAH，LC组。经统计学处理，差异具有显著意义。结论：p16,nm23基因的表达有助于了解肝癌的生物学行为及预后的判断。