人口腔黏膜上皮细胞的培养

目的:培养人口腔黏膜上皮细胞,建立稳定的人正常口腔黏膜角化细胞体外培养体系,为进一步采用组织工程技术构建口腔黏膜组织奠定基础。方法:取3个月唇裂患儿手术多余口腔黏膜,经Dispase及胰蛋白酶消化获取细胞,采用无血清角化细胞培养液进行原代培养,并进行形态学观察和角蛋白免疫组化染色等细胞定性研究。结果:在0.25×10~2个细胞的低密度接种下,经过20天培养,获得了完全融合成片的口腔黏膜原代细胞,细胞呈铺路石样生长,经鉴定为单一的口腔黏膜上皮细胞。结论:正常口腔黏膜组织经Dispase及胰蛋白酶消化,应用无血清培养液进行培养,可成功培养出人正常口腔黏膜上皮原代细胞。     

口腔黏膜上皮细胞体外培养的研究

目的 建立一种新的口腔黏膜上皮细胞体外培养模型。方法 结合组织块法和酶消化法，先用分离酶消化获取单纯的口腔黏膜上皮组织，再将组织块种植于培养皿，经原代培养和传代培养，光镜观察培养细胞。酶消化后组织块行既染色，观察分离酶作用部位。培养细胞行抗角蛋白抗体免疫组化染色。结果 分离酶作用于基底膜。可以完整地将上皮细胞与固有层分离，细胞培养过程中未见成纤维细胞生长，抗角蛋白抗体染色阳性。结论 该培养方法可获取纯净的人口腔黏膜上皮细胞，建立符合临床研究所需要的口腔黏膜上皮细胞体外培养模型。     

口腔黏膜上皮细胞的培养条件

目的：研究不同培养条件下口腔黏膜上皮细胞的生长情况,了解不同添加成分对上皮细胞生长和分化的影响,从而探索一条简便有效的培养口腔黏膜上皮细胞的方法。方法：选取健康成年人拔除第三磨牙时切除的牙龈黏膜,在超净台内用眼科剪、镊尽可能去除上皮下结缔组织,滴加Dispase,4℃冷消化16～18h,取上皮皮片用眼科剪剪成约1mm^3大小,随机分成12组,分别接种于25mm培养瓶中,每瓶加入培养液1ml(MCDB153),放入37℃,体积分数为5％CO2细胞培养箱中培养。12组培养液中分别加入不同浓度的胎牛血清、表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素和转铁蛋白,观察细胞生长情况。选取能够正常增殖的细胞进行传代培养,并于传代后的第2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d纪录细胞总数。结果：低血清加入各种生长因子的培养液中上皮细胞生长良好,光镜下观察为典型的“铺路石”状,传代后经免疫组化证实是上皮细胞,而高血清培养液中由于成纤维细胞的生长导致无法传代。结论：MCDB153培养液中加入胰岛素、氢化可的松、表皮生长因子和霍乱毒素所构成的培养液,是一种有效的口腔黏膜上皮细胞培养液。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究

目的:建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性。方法:采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率,MTT比色法测定细胞生长曲线。结果:两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似,消化法培养的细胞代数维持低于组织块法;对数生长期时,组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛(P<0.05);在16 h后,消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法(P<0.05)。结论:选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞,且具有经济实用性;角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究

目的：建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法，并观察其体外生长的生物学特性。方法：采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养，分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率，MTT比色法测定细胞生长曲线。结果：两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似，消化法培养的细胞代数维持低于组织块法；对数生长期时，组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛（P〈0．05）；在16h后，消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法（P〈0．05）。结论：选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞，且具有经济实用性；角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。     

藓化饮对体外培养的人口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响

目的 探讨藓化饮对体外培养的人口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响.方法 DispaseⅡ及胰酶消化法原代培养人口腔黏膜上皮细胞,传代后HE染色,光镜下进行形态学观察.免疫组织化学抗角蛋白抗体染色,进行来源鉴定.取第二代培养细胞,随机分为4个实验组和1个对照组.制备藓化饮药液,实验组分别加入经无血清培基稀释为104、105、5×105、106μg/L 4个浓度梯度的藓化饮液继续培养;对照组只加无血清培基继续培养.甲基噻唑基四唑法测定培养细胞的增殖活性.结果 原代培养的人口腔黏膜上皮细胞呈扁平椭圆形或多角形,胞核清晰.细胞抗角蛋白抗体染色阳性.藓化饮在105μg/L浓度下增殖活性吸光度值明显高于其他浓度组和对照组(P＜0.05).而在104μg/L、5×105μg/L、106μg/L浓度下增殖活性吸光度值虽高于对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 使用无血清培养基可成功进行人口腔黏膜上皮细胞原代培养及传代培养.藓化饮在浓度为105μg/L下能明显增强体外培养的人口腔黏膜上皮细胞的增殖活性.     

改良的兔口腔黏膜上皮体外培养方法

目的 分析兔口腔黏膜上皮细胞(OMECs)体外培养影响因素,观察OMECs细胞生物学变化的特点并寻找促进体外增殖OMECs的方法.方法 比较不同的表面消毒方法、不同的DispaseⅡ配制、不同的培养基、不同的钙离子浓度的K-SFM对OMECs体外增殖的影响.结果 OMECs用2%碘酊表面消毒比使用1%聚维碘酮消毒能明显...     

人口腔黏膜上皮细胞的培养及其在PLGA膜上生长的初步实验

目的 :探讨人口腔黏膜上皮细胞的原代培养和体外生长方法。方法 :采用美国DispaseⅡ试剂获取人体正常口腔黏膜上皮的原代细胞 ,将其种植在PLGA膜上 ,通过光学显微镜形态学检查、扫描电镜和免疫组织化学进行细胞定性。结果 :采用DispaseⅡ可成功地分离出口腔黏膜上皮层和上皮下层 ,通过进一步处理后可获取口腔黏膜上皮细胞的原代细胞 ,将其植入PLAG膜上 ,细胞获得很快生长 ,5d时细胞出现分化 ,8d时可以长到 5层左右。结论 :本方法可较好地获取口腔黏膜原代细胞 ,获取的口腔黏膜原代上皮细胞种植在PLAG膜上可获得良好的生长。     

兔口腔黏膜上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究

目的研究羊膜作为载体种植兔口腔黏膜上皮细胞的可行性及生物学特征，探索眼表重建良好和来源丰富的移植材料和方法。方法将兔口腔黏膜上皮细胞种植于去上皮羊膜基底膜进行体外培养扩增。倒置显微镜观察细胞在羊膜上的动态生长过程，将培养获得的复合上皮片作常规病理切片HE染色和透射电镜观察。采用AE5单克隆抗体鉴定培养组织中有无角蛋白3表达。结果免口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜基底膜面能黏附生长并增殖，体外培养3周左右即可在羊膜上汇合成片并分层。形成的复合组织由羊膜基底膜和较扁平的2～3层上皮细胞组成，基底层细胞与羊膜之间有半桥粒连接，细胞之间可见桥粒连接，细胞表达角蛋白3。结论兔口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜上体外培养扩增能获得类似于角膜上皮的复层组织，为解决眼表重建供体来源不足的现状带来了新的希望。     

兔眼晶体上皮细胞的体外培养

目的 :探索体外培养兔眼晶体上皮细胞的方法 ,为进一步研究晶体后囊混浊的发病机理及预防提供实验依据。方法 :取新西兰白色家兔晶体上皮细胞进行原代培养 ,细胞融合后用胰蛋白酶进行消化传代。结果 :原代培养48～ 72h后 ,可见晶体上皮细胞长出 ,以后细胞呈贴壁单层 ,铺砌型向外生长。传代后 6～ 8h细胞贴壁生长。结论 :体外培养可获得生长形态及特征稳定的晶体上皮细胞。     

兔角膜内皮细胞的原代培养

目的: 探讨兔角膜内皮细胞的培养方法。方法: 显微分离兔角膜后弹力层-内皮细胞层,采用贴壁法、贴壁消化法及两种消化法培养,观察每种方法细胞生长的特点。结果: 4种方法培养的兔角膜内皮细胞均呈单层密集生长,形态为六角形或多边形,具有活体细胞的形态特征。培养周期最短约为1周。结论: 将揭取的附有内皮细胞的后弹力层预培养1天后再进行消化培养的方法,可为实验研究提供有效的角膜内皮细胞培养方法。     

人正常上皮细胞的原代培养

传统的人正常上皮细胞原代培养方法存在培养率低、培养出的细胞活性差、操作繁琐等缺点,为了解决 这些问题,近年来国内外的众多研究者对人正常上皮细胞的原代培养过程进行了大量研究和不断改进。笔者主要综 述人正常上皮细胞分离纯化的一些方法(如组织块分离法、酶消化分离法 、机械刷取法、红细胞裂解法、Percoll分层 液密度梯度分离法等)以及培养传代中可应用到的一些方法(如无血清培养基联合低浓度血清培养基培养法、鼠尾胶 原包被法、玻璃培养瓶联合塑料培养皿培养法);其次阐述了人正常上皮细胞的生物学特性及免疫细胞化学染色法、 台盼蓝拒染法等生物学性状检测的方法,并且对培养中无菌操作、培养时和分离时细胞外环境的条件、差速贴壁的 次数、添加剂的选择与用量等影响因素作了归纳。     

小鼠肾小管上皮细胞的原代培养及生物学特性

目的探讨适用于小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)分离培养及鉴定的技术方法。方法采用机械研磨肾脏组织分离肾小管节段并结合Ⅱ型胶原酶消化分离培养法进行mRTECs原代培养,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;锥虫蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法、DNA周期检测法分别测定和观察mRTECs传代成活率、生长情况及增殖特征;免疫荧光染色法鉴定细胞。结果获得的细胞3 d后从贴壁的肾小管节段边缘长出,7 d后呈铺路石样,生长迅速可传代;传代细胞成活率达96%以上;第1代(P1)、第3代(P3)细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示P1、P3细胞生长至第3～5天光密度值变化较明显;随传代次数的增加,第5代细胞生长曲线近似平缓,光密度值无明显变化,细胞逐渐衰老;P1细胞G0/G1和(S+G2)/M分别为78.9%和21.1%,P3细胞G0/G1和(S+G2)/M分别为82.1%和17.9%;P3细胞行免疫荧光染色细胞角质蛋白-18及上皮型钙黏素显示细胞质内蛋白表达阳性,细胞阳性率均达98%。结论机械研磨并结合Ⅱ型胶原酶消化培养法能成功培养mRTECs,建立稳定、高效的细胞分离和培养技术方法,为肾脏疾病与心血管功能相关性研究提供理想的细胞来源。     

昆明小鼠胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养

目的:建立能够在体外长期培养胰腺导管上皮细胞的方法.方法:成年昆明小鼠,颈椎脱臼法处死,取胰腺组织,以Ⅴ型胶原酶消化,400目滤网过滤,分离胰腺导管上皮细胞,用添加有各种生长因子的DMEM/F12培养基培养,待细胞达到90%以上汇合时以胰酶消化传代.在不同时间点取样,于普通光镜和相差显微镜下观察细胞形态学变化;采用免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白-19(CK-19)的表达情况;并行双硫腙(DTZ)染色.结果:原代及传代培养的细胞具有上皮样细胞的典型特征,CK-19染色阳性,DTZ染色阴性,可初步鉴定为胰腺导管上皮细胞.结论:所建立的原代和传代培养方法,适宜于小鼠胰腺导管上皮细胞的体外生长.     

人正常鼻黏膜及鼻息肉黏膜上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 探讨人正常鼻黏膜及鼻息肉黏膜上皮细胞的原代培养及鉴定,以备后续对其生物学特性研究之用.方法 取2006年～2007年行鼻窦内窥镜下摘除的鼻息肉及行鼻中隔手术切除的正常下鼻甲各 5 例.标本放入4℃无菌的 PBS(配有双抗)溶液中,在超净台中反复冲洗、浸泡,剪成米粒大后转入培养瓶中,用0.1%胶原酶Ⅳ消化过夜.次日取出,轻轻吹打,加入含10%胎牛血清的 DMEM/F12(1:1)培养液,置 37℃饱和湿度 CO2细胞培养箱中培养.采用ABC 贴壁法去除鼻黏膜上皮细胞中的成纤维细胞和红细胞.倒置相差显微镜下观察细胞形态、增殖及生长状况、有无污染.流式细胞仪检测细胞纯度.结果 鼻黏膜上皮细胞生长良好,可见 4 种细胞:纤毛柱状上皮细胞、无纤毛柱状上皮细胞、杯状细胞、基底细胞.透射电镜下鼻息肉黏膜上皮细胞膜表面纤毛较正常鼻黏膜上皮细胞的纤毛数减少,纤毛倒伏,胞质内有空泡形成.经流式细胞仪检测鉴定上皮细胞占 90.1%.结论 此方法培养的鼻黏膜上皮细胞纯度高,是一种较好的获得原代鼻黏膜上皮细胞的方法.     

模拟缺血/再灌注诱导人离体胃黏膜上皮细胞的凋亡

目的模拟缺血/再灌注诱导人离体的胃黏膜上皮细胞损伤模型,观察再灌注不同时间点胃黏膜上皮细胞凋亡情况并分析其规律。方法采用人胃黏膜上皮细胞株进行体外培养并传代,细胞以缺氧（5%CO2、1%O2、94%N2）＋无糖KR液模拟缺血、缺氧,复氧、复糖模拟再灌注诱导胃黏膜上皮细胞凋亡,用流式细胞仪、Ho-echst33258染色法观察正常对照组及模拟损伤组于模拟缺血1 h,再灌注3、6、12 h细胞凋亡的情况及变化规律。结果①胃黏膜上皮细胞12～24 h贴壁,24 h后有少量上皮样细胞从周边爬出,48 h后细胞呈指数样生长,72 h后细胞已基本能达到融合。②模拟胃缺血/再灌注后细胞凋亡率于缺血1 h、再灌注6 h时出现高峰,且与正常对照组相比差异有统计学意义（P〈0.01）。经Hoechst33258染色,荧光显微镜下观察可见细胞于缺血1 h、再灌注6h时产生典型的凋亡形态学变化如核浓染、核碎裂、边集等。结论成功模拟了缺血/再灌注诱导人离体的胃黏膜上皮细胞损伤模型;该损伤模型可引起胃黏膜上皮细胞的凋亡,且在缺血1 h、再灌注6 h时为高峰。     

哈萨克族食管正常上皮细胞的原代培养方法

目的：培养哈萨克族（哈族）成人食管正常上皮细胞,建立能够在体外长期培养的哈族食管上皮细胞系,为上皮细胞的体外研究提供实验材料。方法取哈萨克族食管癌患者正常食管上皮,用0．25％中性蛋白酶（DispaseⅡ）和0．05％胰蛋白酶/0．03％ EDTA 联合消化获取哈族食管上皮细胞,使用 EpiCM-2无血清培养基培养,通过细胞形态学和角蛋白免疫组织化学法鉴定培养的食管正常上皮细胞的来源。结果首次培养的原代哈萨克族正常食管上皮细胞经8～10 d 后可融合成片,融合率为80％～90％,细胞呈“铺路石”样生长,细胞角蛋白表达阳性,可连续传代,传代的细胞经3～5 d 可达到80％～90％融合。结论建立的体外分离培养哈族成人食管正常上皮细胞的方法方便可行。     

人子宫内膜腺上皮细胞的体外分离培养及纯化

[目的]优化子宫内膜腺上皮细胞的分离培养及纯化技术,以获得经济、数量多、活性好、纯度高的子宫内膜腺上皮细胞,为子宫内膜异位症的研究提供可靠的体外模型。[方法]采用复合酶重复消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法处理。[结果]经诊断性刮宫获取的19例标本中,18例腺上皮细胞培养成活,1例失败;腺上皮细胞纯度高达94.2%。[结论]复合酶多次消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法培养子宫内膜腺上皮细胞,可以获得经济、数量多、活性好、纯度高的细胞。