自然流产与绒毛中维甲酸X受体α基因突变关系的研究

目的 :探讨人类自然流产与绒毛中维甲酸X受体α(RXRα)基因突变的关系。方法 :用PCR SSCP 银染法和DNA测序法检测了自然流产 5 0例和正常早孕要求人工流产4 0例的胚胎绒毛组织中RXRα基因的外显子 2～ 10的突变。结果 :4 9例患者和正常对照组绒毛组织中RXRα基因的各个外显子在PCR SSCP 银染检测中均未显示异常。 1例患者SSCP 银染中显示异常的第 9外显子序列经DNA测序后未发现突变。结论 :目前尚不能认为人类自然流产与绒毛中RXRα基因突变有关     

复发性自然流产患者绒毛RXRα的表达

目的:探讨复发性自然流产患者绒毛RXRα表达水平及其对胚胎生长的调控作用。方法:用RT-PCR方法检测23例自然复发性流产患者和33例正常早孕者离体绒毛RXRα mRNA表达水平。结果:1)复发性自然流产组及正常妊娠组离体绒毛中均表达RXRα mRNA,其水平分别为0.306±0.358和0.578士0.300,两组相比有统计学差异(P<0.05)。2)自然流产组绒毛中RXRα mRNA表达水平与胚胎死亡时大小呈正相关(r=0.405,P<0.05)。3)自然流产患者血清中狼疮样抗凝因子(ACL)增高组与ACL正常组RXRα mRNA表达水平分别为0.37±0.35和0.39±0.37,两组相比无统计学差异(P>0.05)。4)复发性自然流产患者血清中血小板聚集度(PagT)增高组与PagT正常组RXR α mRNA表达水平分别为0.38±0.36和0.40±0.35,两组相比无统计学差异(P>0.05)。结论.RXRα基因表达水平降低可能是复发性自然流产的发病机理之一。     

原因不明复发性流产患者蜕膜组织中转录因子GATA-3及T-bet mRNA表达的研究

目的 探讨转录因子GATA-3、T-bet在原因不明复发性流产发病中的作用.方法 采用原位杂交方法,检测20例原因不明复发性流产患者(流产组)和20例正常妊娠妇女(正常妊娠组)蜕膜组织中1型辅助性T细胞(Th1)特异性转录因子T-bet和2型辅助性T细胞(Th2)特异性转录因子GATA-3的mRNA表达水平.结果 (1)GATA-3:蜕膜组织中每高倍视野平均GATA-3阳性细胞数流产组为(25±16)个,正常妊娠组为(38±16)个,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(2)T-bet:蜕膜组织中每高倍视野平均T-bet阳性细胞数流产组为(59±17)个,正常妊娠组为(46±18)个,两组比较,差异也有统计学意义(P＜0.05).(3)两组妇女蜕膜组织中GATA-3 mRNA与T-betmRNA的表达水平呈负相关关系(r=-0.55,P＜0.01).结论 原因不明复发性流产患者蜕膜组织中T-bet表达占优势,GATA-3的表达受抑制,可能诱导了母胎界面Th1/Th2平衡向Th1偏移,从而使胚胎遭受免疫攻击而发生流产.     

人巨细胞病毒感染妊娠早期绒毛组织中即刻早期基因与晚期基因的表达及形态学变化的体外研究

目的 观察妊娠早期绒毛组织感染人巨细胞病毒（hCMV）后,即刻早期基因与晚期基因的表达及绒毛组织形态学变化。方法 采用绒毛组织体外培养技术,建立体外hCMV感染妊娠早期绒毛模型;采用间接免疫荧光法和原位杂交法,检测不同hCMV浓度、不同感染时间,即刻早期蛋白（IEP）72-IEP86和晚期基因（LG）mRNA的表达;同时应用透射电镜观察妊娠早期绒毛组织的形态学变化。结果 （1）以浓度为100半数致细胞病变滴度（TCID50）、200TCID50及300TCID50的hCMV感染绒毛组织后,细胞滋养细胞、合体滋养细胞及间质细胞均可见IEP72一IEP86表达。（2）100TCID50 hCMV感染后,绒毛组织无LGmRNA表达;200 TCID50及300 TCID50 hCMV感染第0～2天后,合体滋养细胞及间质细胞LGmRNA均呈阳性表达,细胞滋养细胞LGmRNA呈强阳性表达。（3）妊娠早期绒毛组织与经hCMV感染后的妊娠早期绒毛组织,共同于体外连续培养10d,妊娠早期绒毛组织保持了正常的形态学特征;不同浓度hCMV感染后的妊娠早期绒毛组织的形态均发生了不同程度的变化,合体滋养细胞表面微绒毛水肿、粗面内质网扩张,细胞滋养细胞多见,溶酶体增生及毛细血管腔扩张。结论 （1）hCMV感染妊娠早期绒毛组织的早期,hCMV可在绒毛组织细胞中完整复制,IEP72-IEP86可长期存在于感染后的绒毛组织中。（2）hCMV感染妊娠早期绒毛组织,可引起绒毛组织细胞的超微结构变化。     

早期自然流产患者绒毛Notch受体mRNA和蛋白表达及与妊娠关系的初步探讨

目的:初步探讨早期自然流产患者绒毛Notch受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)mRNA及蛋白表达及对滋养细胞的调控作用。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术和免疫印迹法检测6例自然难免流产患者和12例正常早期妊娠妇女绒毛Notch1、Notch2、Notch3、Notch4的mRNA和蛋白的表达水平。结果:(1)自然流产组绒毛Notch1和Notch3 mRNA表达水平高于正常早期妊娠组(P<0.05);(2)Western-blot检测显示早期自然流产患者绒毛中Notch1、Notch2、Notch3受体蛋白的表达水平高于正常早期妊娠组(P<0.05)。结论:Notch受体蛋白在早期自然流产患者绒毛中表达上调,可能与自然流产的发病原因有关。     

早期自然流产绒毛组织SNP-array遗传学诊断研究

目的:初步探讨单核苷酸多态性阵列(SNP-array)在早期流产绒毛遗传学诊断中的临床应用价值。方法:选取临床诊断为早期自然流产的82例患者,刮宫术后获取绒毛组织,行常规绒毛细胞培养G显带核型分析,并同时提取绒毛组织DNA进行SNP-array检测,比较两者的检测结果。结果:常规绒毛细胞培养G显带核型诊断成功率87.8%(72/82),SNP-array诊断成功率为100%(82/82)。G显带分析获得结果 72例,核型正常35例,核型异常37例,异常率51.4%(37/72)。82例SNP-array分析结果中,核型正常30例,核型异常52例,异常率63.4%(52/82)。G显带分析失败的10例标本中,SNP-array检出6例异常;G显带与SNP-array结果不符的12例中,包括2例全基因组单亲二倍体(uniparental disomy,UPD),2例是部分染色体UPD。结论:SNP-array技术具有高准确性、高通量、快速检测等优点,在自然流产绒毛遗传学分析中具有较强的临床应用价值。     

自然流产胚胎组织中人类纺锤体有丝分裂俘获缺陷基因的表达及意义

目的 探讨自然流产胚胎组织中人类纺锤体有丝分裂俘获缺陷(hsMAD)2基因的表达,以及hsMAD2基因表达降低与染色体数目异常的相关性.方法 采集2006年3月至2007年3月重庆医科大学附属第一、第二医院妇产科自然流产患者的胚胎组织标本33份,其中流产1次者23份,流产2次及以上者10份;同时采集人工流产患者的胚胎组织标本35份.采用FQ-PCR和蛋白印迹法检测自然流产和人工流产胚胎组织中hsMAD2基因的mRNA和蛋白表达水平;原代培养人工流产胚胎组织并经染色体分析筛选出5例具有正常核型的胚胎细胞,构建hsMAD2基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,转染筛选出来的胚胎细胞以抑制其内源性hsMAD2基因的表达,将细胞分为实验1组(转染重组干扰质粒pshRNA-hsMAD2-1)、实验2组(转染pshRNA-hsMAD2-2)、实验3组(转染pshRNA-hsMAD2-3)、对照1组(未做任何处理)、对照2组(转染pTZU6+1干扰质粒空载体)、无关对照组(转染pshRNA-N1).用蛋白印迹法和定量PCR技术评价shRNA的干扰效果,四甲基偶氮唑蓝比色法测定胚胎细胞增殖抑制率,流式细胞技术检测胚胎细胞周期的分布,并计算染色体数目的 变化.结果 (1)自然流产1次者、自然流产2次及以上者、人工流产者的胚胎组织中hsMAD2基因mRNA的表达量分别为0.00879±0.00035、0.00901±0.00033、0.00941±0.00026,3者分别比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);hsMAD2蛋白的表达量分别为0.2791±0.0311、0.0431±0.0020、0.5790±0.0331,3者分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(2)shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制胚胎细胞中hsMAD2基因的表达,转染有效干扰质粒后,实验1组胚胎细胞的增殖抑制率为54%,分别与对照1组(4%)、对照2组(3%)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);G2/M期细胞比例实验1组为17.9%,与对照1组(8.2%)、对照2组(8.0%)比较均明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);实验1组染色体异常率平均值为30.0%,与对照1组(4.8%)比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 hsMAD2基因的表达下调可能是导致患者染色体数目异常、胚胎发育异常乃至自然流产发生的重要原因之一.     

cFLIP在早期自然流产绒毛组织的表达及意义

目的:检测早期正常妊娠及自然流产绒毛组织中细胞凋亡抑制蛋白cFLIPmRNA及其蛋白产物的表达,分析并探讨cFLIP与自然流产的关系。方法:应用RT-PCR法及免疫组化SP法检测cFLIP mRNA及其蛋白产物在20例自然流产患者(研究组)绒毛组织的表达,以同期正常妊娠要求人工流产20例为对照组。结果:研究组绒毛组织中cFLIP mRNA及蛋白表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:细胞凋亡抑制蛋白cFLIP参与维持正常妊娠,绒毛组织中其表达下降可能在自然流产的发生中起重要作用。     

缺氧诱导因子1α及其靶基因在子痫前期患者胎盘组织中的表达

目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及其靶基因血管内皮细胞生长因子(VEGF)、可溶性血管内皮细胞生长因子受体1(sFlt-1)基因在子痫前期患者胎盘组织中的表达。方法采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法对20例重度子痫前期患者(子痫前期组)和15例正常妊娠妇女(对照组)的胎盘组织中的HIF-1α、VEGF、sFlt-1蛋白表达进行检测;同时应用RT- PCR技术对两组孕妇胎盘组织中HIF-1α、VEGF、sFlt-1 mRNA水平进行检测,并进行相关性分析。结果(1)子痫前期组HIF-1α蛋白表达(+++)者9例(45%,9/20),sFlt-1蛋白表达(+++)者11例(55%,11/20),对照组分别为2例(13%,2/15)和3例(20%,3/15),两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0．05);子痫前期组VEGF蛋白表达(+++)者3例(15%,3/20),明显低于对照组的7例(47%,7/15),两组比较,差异有统计学意义(P＜0．01)。(2)子痫前期组HIF-1αmRNA、sFlt-1 mRNA水平分别为0．604±0．013、0．898±0．041,对照组分别为0．208±0．007、0．559±0．244,两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0．05);子痫前期组VEGF mRNA表达水平虽高于对照组,但差异无统计学意义(P＞0．05)。子痫前期组VEGF mRNA/sFlt-1 mRNA比值(0．439±0．009)低于对照组(0．824±0．011),两组比较,差异有统计学意义(P＜0．05)。(3)子痫前期组HIF-1αmRNA的表达与sFlt-1 mRNA表达呈正相关(r=0．577,P＜0．05),与VEGF mRNA/sFlt-1 mRNA比值呈负相关(r= -0．376,P＜0．05)。结论HIF-1α在子痫前期患者胎盘组织中表达水平明显升高,主要是通过调节VEGF、sFlt-1基因的转录,而影响滋养细胞的浸润和胎盘血管重铸,参与子痫前期的发病。     

不同分子遗传学方法用于自然流产绒毛细胞遗传分析的效果

目的 探讨多重连接探针扩增法(MLPA)+荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交(CGH)+FISH的分子遗传学方法用于自然流产绒毛细胞遗传分析的效果.方法 收集29例自然流产绒毛组织以及6例选择性终止早期妊娠妇女的绒毛组织,采用CGH+FISH、MLPA+FISH方法进行遗传学分析,并与传统的绒毛细胞培养染色体核型分析结果进行比较.结果 MLPA+FISH检测时间为40 h,CGH+FISH检测时问为120 h,绒毛细胞培养染色体核型分析时间为(240±72)h,3者分别比较,差异有统计学意义(P<0.01).CGH、MLPA、FISH和绒毛细胞培养染色体核型分析的标本成功获检率分别为97%(34/35)、100%(35/35)、100%(35/35)和91%(32/35),4者比较,差异无统计学意义(P>0.01).除去CGH获检失败的1份样本外,MLPA+FISH与CGH+FISH的分析结果一致,CGH获检失败的1例标本经MLPA+FISH检测获得了结果.CGH+FISH或MLPA+FISH检测结果与绒毛细胞培养染色体核型分析结果的不一致率分别为13%(4/31)、12%(4/32),两者比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 MLPA+FISH检测耗时短,检测成功率高;MLPA+FISH检测用于自然流产绒毛细胞遗传分析是对绒毛细胞培养染色体核型分析方法的重要补充.     

复发性流产病人绒毛组织中FK506结合蛋白52的表达及意义

目的 探讨复发性流产（RSA）病人及正常早孕妇女绒毛组织中FK506结合蛋白52（FKBP52）基因和蛋白的表达。方法　 选取2012年2月至2013年6月广西医科大学第一附属医院妇产科门诊就诊的30例RSA妊娠妇女（复发性流产组）及同期正常早孕妇女30例（对照组）,收集其新鲜绒毛组织,分别应用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学方法检测两组绒毛组织中FKBP52 基因和蛋白的表达。结果　 FKBP52在两组妇女的绒毛组织中均有表达,但与对照组相比,复发性流产组凝胶成像系统半定量分析FKBP52 mRNA（1.484 ± 0.198对1.109 ± 0.292,P<0.05）及蛋白表达（91.8 ± 5.3对68.2 ± 8.4,P<0.01）均明显降低。结论　 FKBP52的表达可能在胚胎着床和早期妊娠的维持中起重要作用,其表达降低可能与RSA的发病密切相关。     

组蛋白去乙酰化酶1蛋白在早期自然流产绒毛和蜕膜组织中的表达

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)蛋白在早期自然流产发生中的病理生理作用及临床意义。方法:应用免疫组织化学和Western blot法检测早期自然流产和早期正常妊娠者绒毛及蜕膜组织中HDAC1蛋白的表达。结果:免疫组化示:HDAC1主要定位于绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞和子宫蜕膜细胞、腺上皮细胞的胞核;早期自然流产绒毛组织中HDAC1的表达强度低于早期正常妊娠组,而蜕膜组织中,早期自然流产组织HDAC1的表达强度高于正常妊娠组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。Westernblot示:早期自然流产绒毛组织中HDAC1蛋白的相对表达量为1.38±0.63,明显低于正常妊娠组(1.92±0.82),差异有统计学意义(P<0.05);而早期自然流产蜕膜组织中HDAC1蛋白的相对表达量为1.02±0.53,明显高于正常妊娠组(0.71±0.36),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HDAC1在早期自然流产绒毛和蜕膜组织中的异常表达可能在早期自然流产的发生、发展中起重要作用。     

Expression and localization of tumor necrosis factor receptor 1 protein in the chorionic villi in early normal and spontaneous abortion

BACKGROUND: Increasing tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) expression is found to be positively associated with spontaneous abortion. TNFalpha acts through the binding of two types of transmembrane receptors called TNFR1 and TNFR2. Here we compare membrane TNFR1 (mTNFR1) protein expression on chorionic villi in women with spontaneous abortion (SA) and viable pregnancy. METHODS: In a prospective study, 31 women with SA and 30 with a viable pregnancy were studied. Chorionic villous membrane TNFR1 was detected by confocal laser scanning microscopy and immunohistochemistry. RESULTS: The mTNFR1 protein is expressed in villous stromal, vessel endothelial, syncytiotrophoblast, and cytotrophoblast cells in early pregnancy. The intensity of mTNFR1 fluorescence (mean+/-S.D.) in villous stromal cells was higher in the abortion groups than in the control group (35.99+/-6.35 versus 32.64+/-5.01; p<0.05). In the abortion groups, villous cytotrophoblast cells were intensely positive for mTNFR1, whereas mTNFR1 staining of vessel endothelial and syncytiotrophoblast cells was significantly lower (p<0.001). CONCLUSION: Abundant mTNFR1 expression in the cytotrophoblast cells in women with SA may mediate TNFalpha to induce programmed cell death in the mTNFR1-expressing cytotrophoblasts to limit their growth. The over-expressing mTNFR1 in villous stromal cells, mediating TNFalpha effects, may cause pathological changes or tissue damage in chorionic villi locally in nonviable pregnancies.     

原因不明复发性流产患者母-胎界面T淋巴细胞受体β链可变区基因的表达水平和频率

目的 通过分析母-胎界面T淋巴细胞受体(TCR)β链可变区(BV)基因的表达水平和频率,探索T淋巴细胞参与原因不明复发性流产(RSA)发生的作用机制.方法 采集18例原因不明RSA患者(研究组)和4l例正常早孕人工流产妇女(对照组)的蜕膜组织,基因组扫描方法 检测两组患者蜕膜内TCR BV基因的表达,分析TCR BV基因表达水平和频率的分布与原因不明RSA的关系.结果 (1)研究组患者蜕膜组织中TCR BV基因的表达水平,BV19为0.029±0.031,高于对照组(0.013±0.010),而BV5.2的表达水平(0.040±0.035)低于对照组(0.067±0.052),两组间分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).其余各家族的表达水平两组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).(2)研究组TCR BV家族中表达频率最高的前4位为BV2、BV6、BV7和BV3,其表达频率分别为66.7%、66.7%、66.7%和61.1%,均超过了50%.研究组中,BV15、BV19和BV20的表达频率分别为33.3%、38.9%和33.3%,均高于对照组(分别为7.3%、14.6%和7.3%);BV4和BV7的表达频率分别为33.3%和66.7%,均低于对照组(分别为65.9%和92.7%),两组间分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).其余各家族的表达频率两组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 原因不明RSA患者蜕膜组织内的TCR BV家族表达存在差异,表达频率变化显著的TCR BV家族可能导致免疫有关的流产发生的易感性.     

Expression of FK506-binding protein 52 (FKBP52) in chorionic villi with early recurrent spontaneous abortion

Objective: To investigate the mRNA and protein expression of FK506-binding protein 52 (FKBP52) in the chorionic villi of patients with recurrent spontaneous abortion (RSA) and normal women during early pregnancy.

Methods: Fresh chorionic villus tissues were collected from 60 subjects. A total of 30 patients with a history of RSA were enrolled into the RSA group and 30 normal pregnant women were enrolled into the control group. The FKBP52 mRNA expression levels in chorionic villi of the RSA patients and healthy controls were measured via semiquantitative RT-PCR. The protein distribution and expression levels of FKBP52 in chorionic villi were analyzed through immunohistochemistry (IHC). The correlation between FKBP52 expression and RSA was analyzed.

Results: We demonstrated that FKBP52 mRNA is expressed in chorionic villi samples of normal pregnancy and RSA. RSA patients exhibited significantly lower FKBP52 gene expression levels compared with those in normal pregnancies (p?<?0.05). FKBP52 immunoreactivity in chorionic villi was mainly observed in trophoblast cell cytoplasm. The FKBP52 protein expression levels in the chorionic villi of RSA patients was significantly lower than in normal women during pregnancy (p?<?0.05).

Conclusions: FKBP52 protein levels were decreased in the chorionic villi of RSA patients, which indicate that the decrease in FKBP52 may be associated with RSA. The low FKBP52 mRNA expression level, which is consistent with the IHC result, may affect embryonic development and even lead to abortion. FKBP52 may be involved in the pathogenesis of RSA and new therapies that increase the FKBP52 expression may help treat RSA.