小剂量顺铂联合5-氟尿嘧啶对胃癌细胞增殖抑制及其机制的研究

目的:探讨小剂量顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)在体外联合用药对SGC-7901胃癌细胞及胃癌耐药细胞株 SGC-7901/5-FU细胞增殖及其相关基因表达的影响.方法:采用MTT法观察在小剂量DDP、5-FU联合用药前后SGC-7901与SGC-7901/5-FU存活率的差异,同时应用免疫组化方法检测SGC-7901与SGC-7901/5-FU中p53、Fas/Fas L基因的表达情况.结果:DDP与5-FU均有抑制肿瘤细胞增殖作用,且有浓度相关性;尤以DDP联合5-FU后对细胞存活率的影响明显高于两种药物的单独使用(P＜0.01),小剂量DDP联合应用5-FU时效果最明显,但对SGC-7901/5-FU细胞增殖抑制作用明显小于SHC-7901;小剂量联合DDP+5-FU,p53、Fas L 基因表达的阳性率显著高于单纯的5-FU组或DDP组 (P＜0.01),而Fas基因表达则相反.结论:小剂量DDP联合5-FU对胃癌细胞具有明显抑制作用,对耐药株也有一定抑制作用,但效果弱于非耐药株.p53、Fas/Fas L基因对胃癌细胞的增殖活性有重要作用,在小剂量DDP联合5-FU比各单药应用组基因的改变更明显(P＜0.01).     

Ad-PTEN体外对SGC-7901胃癌细胞生长的抑制作用

目的：探讨腺病毒介导的PTEN基因表达体外对SGC-7901胃癌细胞生长抑制作用及其分子机制。方法：将携有PTEN基因的复制缺陷型腺病毒载体（Ad-PTEN）感染SGC-7901胃癌细胞,用RT-PCR法检测Ad-PTEN在细胞中的表达,光学显微镜及荧光显微镜下观察Ad-PTEN感染细胞前后形态的变化,MTT法检测Ad-PTEN对SGC-7901胃癌细胞生长的抑制作用,用流式细胞术（FCM）检测SGC-7901胃癌细胞凋亡率。RT-PCR分析Bax、Bcl-2、p53、Survivin细胞凋亡相关基因的表达。结果：Ad-PTEN基因组感染SGC-7901胃癌细胞后,RT-PCR结果显示PTEN目的基因能在SGC-7901胃癌细胞中转录,其表达可明显抑制该胃癌细胞的生长,并诱导细胞凋亡。其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值、p53基因表达上调、Survivin下调有关。结论：重组腺病毒Ad-PTEN具有抑制SGC-7901胃癌细胞生长和诱导细胞凋亡的作用。     

腺病毒介导的ING4联合化疗药物增强对胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用

目的:探讨腺病毒介导的ING4基因(Ad-ING4)与化疗药物联合应用增强对胃癌细胞株SGC-7901增殖的抑制效果.方法:用Ad-ING4感染胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR法检测ING4基因在胃癌细胞中的转录,用Ad-ING4分别联合化疗药物氟尿嘧啶(fluorouracil 5-FU)和顺铂(cisplatin DDP)处理培养的胃癌细胞株SGC-7901,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡率.结果:Ad-ING4感染SGC-7901细胞后,RT-PCR结果提示有目的基因的转录.MTT 结果显示,100 MOI Ad-ING4与25μg /ml 5-FU联合应用后120小时,SGC-7901细胞增殖抑制率达(94±0.50)%,显著高于单用Ad-ING4组的(65.05±2.03)%和 5-FU组的(62.54±0.73)%(均P<0.05); 100 MOI Ad-ING4与6.25μg /ml DDP联合应用后120小时,SGC-7901细胞增殖抑制率达(97.54±0.54)%,显著高于单用Ad-ING4组的(65.05±2.03)%和DDP组的(55.14±1.21)%(均 P<0.05).流式细胞术检测结果显示,Ad-ING4与5-FU或DDP联合应用明显导致细胞S期减少、G2/M期阻滞;Ad-ING4联合5-FU组细胞凋亡率为(16.2±1.18) %,显著高于单用Ad-ING4组的(8.17±0.85)% 和5-FU组的(7.4±0.89) %(均 P<0.05);Ad-ING4联合DDP组细胞凋亡率为(14.17±1.77)%,显著高于单用Ad-ING4组的(8.17±0.85)%和DDP组的(5.93±0.87)% (均P<0.05).结论:Ad-ING4与5-FU或DDP联合应用能显著提高对胃癌细胞株SGC-7901增殖的抑制作用.     

三氧化二砷联合5-FU体外抗人胃癌细胞SGC-7901作用及机制的研究

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）与5-氟尿嘧啶（5-FU）联合应用体外抗人胃癌细胞株SGC-7901的作用及其机制。方法：用不同浓度的As2O3（终浓度依次为0．1，0．5，1．0μmol／L）和（或）5-FU（终浓度50mg／L）处理SGC-7901细胞后．采用流式细胞术观察细胞凋亡和细胞周期变化：免疫细胞化学法（PV法）观察凋亡相关基因Bcl-2表达的变化。结果：与As2O3或5-FU单药作用相比，As2O3与5-FU联合应用可显著提高诱导胃癌细胞凋亡率（q=63．9608，166．1758，51．3343，P〈0．01），与空白组相比，联合用药后S期细胞所占比例下降（q=16．0743，10．8805，12．1482，P〈0．01），G0／G1期细胞比例上升（q=8．7188，9．3309，9．8534，P〈0．01），癌细胞Bcl-2基因表达明显下降（q=10.2801，17．8456，19．0086，P〈0．01）。结论：As2O3与5-FU联合应用具有协同抗胃癌作用，其机制可能与细胞周期阻滞、增强诱导胃癌细胞凋亡以及调控凋亡相关基因的表达有关。     

重组人p53腺病毒联合奥沙利铂对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制作用

目的观察外源p53基因在胃癌细胞SGC-7901内的表达及其对胃癌SGC-7901细胞生长的影响、对胃癌细胞化疗敏感度的作用及机制。方法用重组人p53腺病毒注射液（rAd-p53）及奥沙利铂（OXA）单独及联合作用于胃癌细胞株SGC-7901不同时间后,CCT-8法检测其对体外培养SGC-7901细胞的抑制率,免疫组织化学SP法检测p53蛋白的表达情况,流式细胞仪（FCM）分析其细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达情况。 结果rAd-p53及OXA单独作用SGC-7901细胞时,随药物浓度及作用时间的增加,细胞的生长抑制率逐渐增高;两者联合作用48h,其在较低浓度时即可显著抑制细胞生长（P<005）;OXA（6.25 μg/ml）与rAd-p53(5×107、5×108、5×109vp/ml)联合作用48h后,胃癌细胞caspase-3蛋白的含量较对照组升高,但p53蛋白无明显升高。结论OXA和 rAd-p53单药可抑制胃癌细胞的生长, 两者联合对胃癌细胞的抑制作用明显增强; rAd-p53有增强OXA化疗敏感度的作用,其机制与通过线粒体途径激活下游的 caspase-3诱导细胞凋亡有关。     

中药左金丸逆转胃癌顺铂耐药的作用机制

目的:探讨左金丸逆转胃癌顺铂耐药的作用机制。方法:体外实验采用人胃癌细胞株SGC-7901及人胃癌顺铂耐药细胞株SGC-7901/DDP,CCK-8法检测细胞增殖率;免疫蛋白印迹法和实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测左金丸干预后各组基因蛋白表达量;同时构建RTKN基因慢病毒载体转染的胃癌细胞系并验证,结合CCK-8法、qRT-PCR和Western blot法检测RTKN基因干扰对胃癌细胞顺铂耐药性的影响。裸鼠体内实验将RTKN干扰的SGC-7901/DDP细胞移植到裸鼠皮下,分别给予左金丸干预4周后,记录移植瘤大小,绘制肿瘤生长曲线,Western blot检测RTKN、p53、Ace-p53、HDAC1蛋白的表达量。结果:SGC-7901/DDP细胞中的RTKN表达量显著高于SGC-7901细胞,沉默RTKN显著降低SGC-7901/DDP细胞的耐药性;左金丸可显著降低SGC-7901/DDP细胞的耐药性,但沉默RTKN后其对SGC-7901/DDP细胞的耐药性及对裸鼠皮下移植瘤体积无明显影响,提示降低RTKN表达后,左金丸的抗肿瘤作用被抑制。结论:RTKN通过p53脱乙酰...     

5-氟尿嘧啶联合干扰素α对胃癌细胞的影响

目的：探讨化疗药物与细胞因子联合应用对肿瘤细胞增殖的影响。方法：首先MTT法测出不同浓度干扰素α（IFN）和5-氟尿嘧啶（5-FU）对胃癌细胞的抑制率，根据公式求出5-FU的半抑制浓度，然后用此浓度的5-FU与不同浓度的干扰素α配伍作用于胃癌细胞，用MTT法检测抑制率。用免疫细胞化学方法检测干扰素α、5-FU和干扰素α＋5-FU作用组的p53、p27、PCNA、Fas—L蛋白的表达情况。结果：MTT检测结果未发现干扰素α明显抑制肿瘤细胞增殖作用；5-Fu有抑制肿瘤增殖作用，且有浓度相关性；与5-FU作用组相比干扰素α＋5-Fu作用组的抑制率大于单纯5-FU组，且与配伍的干扰素浓度呈正相关性。之后的免疫组化试验发现IFNα＋5FU组p53、p27、Fas—L蛋白表达的阳性率高于单纯的5-FU组的阳性率，更明显高于IFN组的阳性率，而PCNA蛋白则相反。结论：5-FU对SGC7901胃癌细胞有明显的抗增殖作用，IFNα未见明显的抗增殖作用，但这两药物联合应用时，IFNα明显增强5-Fu的抗增殖作用；联合用药组的凋亡相关蛋白表达阳性率与5-FU组明显不同，IFNα增强5-Fu的抗肿瘤增殖作用可能是由凋亡途径参与作用的。     

Ad-PTEN体外对SGC-7901胃癌细胞生长的抑制作用

目的:探讨腺病毒介导的PTEN基因表达体外对SGC-7901胃癌细胞生长抑制作用及其分子机制。方法:将携有PTEN基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-PTEN)感染SGC-7901胃癌细胞,用RT-PCR法检测Ad-PTEN在细胞中的表达,光学显微镜及荧光显微镜下观察Ad-PTEN感染细胞前后形态的变化,MTT法检测Ad-PTEN对SGC-7901胃癌细胞生长的抑制作用,用流式细胞术(FCM)检测SGC-7901胃癌细胞凋亡率。RT-PCR分析Bax、Bcl-2、p53、Survivin细胞凋亡相关基因的表达。结果:Ad-PTEN基因组感染SGC-7901胃癌细胞后,RT-PCR结果显示PTEN目的基因能在SGC-7901胃癌细胞中转录,其表达可明显抑制该胃癌细胞的生长,并诱导细胞凋亡。其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值、p53基因表达上调、Survivin下调有关。结论:重组腺病毒Ad-PTEN具有抑制SGC-7901胃癌细胞生长和诱导细胞凋亡的作用。     

rAd-p53联合顺铂对胃癌细胞生长及 KAI1／CD82蛋白表达的影响

目的：观察rAd-p53、顺铂（ DDP）单独及联合作用于人胃癌SGC7901细胞后,对肿瘤细胞增殖凋亡情况、KAI1／CD82蛋白表达情况的影响。方法 rAd-p53、DDP单独及联合作用于胃癌SGC7901细胞株24、48、72 h后,CCK-8法测定SGC7901细胞体外增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫组化法检测KAI1／CD82蛋白表达情况。结果rAd-p53、DDP单独及联合作用于SGC7901细胞后,细胞增殖被抑制,并呈剂量和时间依赖性,且两药联合组细胞增殖抑制率明显高于单用组,与阴性对照组相比差异均有统计学意义（ P＜0．05）;rAd-p53、DDP单独及两药联合作用SGC7901细胞48h后,细胞凋亡率为36．94％±0．78％、28．79％±2．37％,69．26％±0．63％;rAd-p53、DDP单独及两药联合均可上调KAI1／CD82蛋白表达,且两药联合组更明显。结论 rAd-p53、DDP单独及两药联合均可抑制胃癌SGC7901细胞的生长,诱导其凋亡,二者联合对胃癌细胞的抑制作用增强,rAd-p53可能通过上调KAI1／CD82的表达诱导SGC7901细胞凋亡,同时增强DDP的抗肿瘤作用。     

稳定转染Bcl-2 shRNA对胃癌细胞SGC-7901化疗敏感性的影响

目的:探讨稳定转染靶向Bcl-2基因的短发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞株SGC-7901化疗敏感性的影响.方法:筛选出稳定转染Bcl-2 shRNA质粒的胃癌SGC-7901细胞株,将其与不同浓度的氟尿嘧啶(5-FU)或顺铂(DDP)作用,未转染的细胞作为对照.RT-PCR法检测稳定转染前后SGC-7901细胞Bcl-2 mRNA的表达水平,MTT法检测5-FU或DDP的IC50,流式细胞仪分析细胞的凋亡率.结果:稳定转染shRNA的胃癌SGC-7901细胞Bcl-2 mRNA的表达明显下降;shRNA联合5-FU的IC50为(14.36±1.63)mg/L,对照组为(35.62±1.95)mg/L,t=2.57,P＜0.05;shRNA联合DDP的半数抑制浓度(IC50)为(2.53±0.46)mg/L,对照组为(6.89±0.52)mg/L,t=2.52,P＜0.05;流式细胞术检测显示,shRNA联合化疗明显提高SGC-7901细胞的凋亡率,t=2.60,P＜0.05.结论:稳定转染Bcl-2 shRNA的胃癌SGC-7901细胞株,其Bcl-2 mRNA的表达能够在较长时间内受到抑制,并提高对化疗药物5-FU及DDP的敏感性.     

GDDR 对 5 - FU 诱导下胃癌细胞凋亡的影响

目的：通过5-Fu诱导人胃癌细胞系SGC-7901凋亡,研究GDDR在胃癌细胞凋亡中的作用。方法：利用已构建成功的SGC-7901-GDDR和SGC-7901-pcDNA3．1稳定转染细胞系,在5-Fu诱导下促进其凋亡发生,流式细胞术和Westernblot检测以上两种细胞系中凋亡发生率和Caspase-3表达及活化程度。结果：未加药组中SGC-7901-GDDR和SGC-7901-pcDNA3．1凋亡发生率无统计学意义,且两者均未观察到活化型Caspase-3表达。加药组中SGC-7901-GDDR凋亡发生率显著高于SGC-7901-pcDNA3．1,且活化型Caspase-3表达前者显著高于后者,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论：GDDR可通过上调活化型Caspase-3的表达促进SGC-7901细胞凋亡,提示凋亡可能也是GDDR抑癌途径之-,并因此可能在胃肠道肿瘤治疗中发挥作用。     

重楼复方与氟尿嘧啶对胃癌细胞的体外协同作用研究

目的：探讨重楼复方（ChongLouFuFang,CLFF）与5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）对胃癌细胞有无体外协同作用及CLFF对胸苷酸合成酶（thymidylatesynthase,TS）基因表达和细胞凋亡的影响。方法：MTT法检测细胞增殖能力;基于中位效应原则的联合指数法评估CLFF与5一FU对胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823的相互作用;Annexin-V—FITC和PT双染色法检测细胞凋亡率;荧光定量RT-PCR法测定佟和B-actinmRNA表达。结果：CLFF在两株细胞中与5一FU均产生较好的协同细胞毒性,两药合用亦以协同方式诱导肿瘤细胞凋亡;CLFF作用24h后,SGC-7901和BGC-823细胞中TsmRNA表达水平分别为对照组的（0．30±0．03）倍和（0．46±0．03）倍,用药前后两株细胞中TSmRNA表达水平具有统计学差异。结论：CLFF与5-Fu有较好的协同抗肿瘤作用,可能与二者协同诱导肿瘤细胞凋亡以及CLFF可下凋胸苷酸合成酶基因表达有关。     

Silencing MRP4 by small interfering RNA reverses acquired DDP resistance of gastric cancer cell

A cisplatin (DDP) resistant cell line (SGC7901/DDP) from a Chinese gastric cancer cell line (SGC7901) was established by step-increasing DDP treatment, and the resultant cell line showed an over 21.9-fold increased resistance to DDP. To identify the mechanism of DDP resistance, the differential gene expression panel was examined by Affymetrix microarray. Among the identified differential genes, 681 genes expression were increased and 1139 genes were decreased. To confirm these gene changes furtherly, one of the upregulated gene, MRP4 was identified with increased mRNA and protein level of SGC7901/DDP by RT-PCR and Western-blot analysis compared with its parental cell line. By using the small interfering RNA (RNAi) to decrease the MRP4 expression, the DDP resistance phenotype of SGC7901/DDP was reversed. These data suggest that MRP4 is a DDP resistance candidate gene of SGC7901 gastric cancer cell line.     

氯喹促进顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡及其机制

  目的  研究自噬对顺铂（cisplatin,DDP）诱导的胃癌SGC7901细胞凋亡的影响,并初步探讨其可能机制。  方法  DDP和（或）氯喹处理胃癌SGC7901细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,MDC染色后荧光显微镜观察自噬囊泡,West. ern Blot检测自噬和凋亡相关蛋白。  结果  5 mg/L的顺铂作用于胃癌SGC7901细胞24 h,细胞凋亡率为21.07%±2.12%,同时观测到自噬囊泡增多和LC3-Ⅱ蛋白表达升高;氯喹特异性抑制自噬活性后,提高了顺铂诱导的细胞凋亡率（30.16%±3.54%,P < 0.05）;检测到凋亡相关蛋白Caspase-3和P53表达增加,Bcl-2蛋白表达下降。  结论  自噬在顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的过程中起保护作用,氯喹抑制自噬后,可能通过激活P53蛋白及灭活Bcl-2蛋白的表达来促进细胞凋亡,联合应用顺铂和氯喹有望成为胃癌治疗的新策略。      

MicroRNA-200c Regulates the Sensitivity of Chemotherapy of Gastric Cancer SGC7901/DDP Cells by Directly Targeting RhoE

Gastric cancer remains a worldwide burden as the second leading cause of cancer-related death. Drug resistance of chemotherapy looms as a major clinical obstacle to successful treatment. Recent evidence indicated that miRNA-200c can restore the sensitivity of NSCLC cells to cisplatin and cetuximab. The expression of miRNA-200c and RhoE were investigated in gastric cancer tissues and cells (SGC7901 and SGC7901/DDP) by qRT-PCR. A luciferase reporter assay was done to understand the potential correlation between miRNA-200c and RhoE. Pre-miR-200c was transfected in SGC7901/DDP cells to confirm whether miRNA-200c could regulate RhoE expression. RhoE was knocked down to explore the role of RhoE on sensitivity of chemotherapy in gastric cancer by MTT. Western blot analysis was performed to further explore the mechanism of RhoE in regulating drug resistance. The results showed that miRNA-200c was significantly lower in cancerous tissues than those in the paired normal tissues, whereas the expression of RhoE was just the opposite. The significant difference of miRNA-200c and RhoE were observed between SGC7901 cells and SGC7901/DDP cells. miRNA-200c has target sites in the 3’-UTR of RhoE mRNA by luciferase reporter assay. Transfection of pre-miR-200c reduces RhoE expression. Meanwhile, the knockdown of RhoE enhanced the sensitivity of SGC7901/DDP cells and changed expression of some genes. These suggested that miRNA-200c regulated the sensitivity of chemotherapy to cisplatin (DDP) in gastric cancer by possibly targeting RhoE.     

miR-17-92基因簇反义寡核苷酸对胃癌细胞增殖与侵袭的抑制作用

目的：探讨miR-17-92基因簇反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC-7901的增殖及侵袭的影响。方法：合成miR-17-92基因簇中miR-17、miR-18a、miR-20a的反义寡核苷酸,通过实时荧光定量PCR验证miR-17、miR-18a、miR-20a反义寡核苷酸对SGC-7901细胞的miR-17、miR-18a、miR-20a的抑制效果,然后利用MTT、Transwell检测抑制表达后对细胞增殖及侵袭的影响。结果：miR-17、miR-18a、miR-20a的反义寡核苷酸能够抑制对应miRNA的表达,同时抑制了胃癌细胞的增殖与侵袭。结论：miR-17-92基因簇可能在胃癌发生发展中起到了癌基因的作用。     

二甲基鞘氨醇对人胃癌细胞凋亡的影响

目的：研究二甲基鞘氨醇对人胃癌细胞SGC7901凋亡的调节作用及其机制。方法：二甲基鞘氨醇是1-磷酸鞘氨醇生成的特异性抑制剂。应用二甲基鞘氨醇后,1-磷酸鞘氨醇的生成被抑制。流式细胞仪观察细胞DNA含量及细胞周期分布;用流式细胞仪检测细胞内Bcl-2和Bax的表达水平。结果：二甲基鞘氨醇抑制1-磷酸鞘氨醇生成后,①胃癌细胞显著发生凋亡。②胃癌细胞内Bcl-2／Bax表达水平的比值下降。结论：二甲基鞘氨醇在人胃癌细胞的凋亡调控中起重要作用。     

Midkine shRNA对胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究shRNA干扰midkine对胃肿瘤细胞SGC7901生物学特性的影响。方法：构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒,采用脂质体2000转染SGC7901细胞,检测细胞的增殖和克隆形成能力以及细胞凋亡情况。结果：与对照组相比,转染重质粒后1—5天,SGC7901细胞增殖明显受到抑制（P〈0．01）,细胞形成克隆数明显降低（P〈0．01）,并且有明显的亚二倍体峰出现（P〈0．05）。结论：针对midkine基因的特异性小RNA干扰质粒在体外能有效抑制人胃癌细胞SGC7901 midkine表达,细胞增殖及克隆形成能力减弱,细胞凋亡增加,为midkine基因靶向治疗提供一定的实验依据。