Survivin特异性siRNA增强人胰癌细胞株Panc-1对顺铂的敏感性

目的 探讨Survivin 特异性siRNA对人胰癌细胞株Panc-1顺铂敏感性的影响.方法 体外将Survivin特异性siRNA表达载体pSurvivin-siRNA转染人胰癌细胞株Panc-1,应用RT-PCR、蛋白印迹法(Western blot) 检测转染siRNA后Panc-1细胞Survivin基因和蛋白的表达变化,应用MTT法检测干扰Survivin后Panc-1细胞对顺铂敏感性的变化.结果 转染Survivin特异性siRNA后,Panc-1细胞Survivin基因和蛋白的表达水平明显下降;顺铂对Panc-1细胞的半数抑制量从(11.992 7±1.147 0)μg/ml下降到(1.238 2±0.085 7)μg/ml,Panc-1细胞对顺铂的敏感性增加了9.69倍.结论 Survivin特异性siRNA抑制Survivin表达,能增加人胰癌细胞株Panc-1对顺铂的敏感性.     

Survivin-siRNA对骨肉瘤MG-63细胞药物敏感性的研究

目的研究特异性Survivin-siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞后对骨肉瘤细胞药物敏感性的影响。方法应用两种特异性Survivin-siRNA（Survivin-siRNA,Survivin—siRNA,）转染骨肉瘤MG-63细胞,RT—PCR检测MG-63细胞Survivin-mRNA表达,流式细胞术检测MG-63细胞的凋亡,MTT法检测顺铂、多柔比星对转染前后MG-63细胞的半数抑制浓度（IC50）。结果特异性Survivin-siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞24h后SurvivinmRNA表达水平明显抑制;流式细胞术显示转染Survivin-siRNA的MG-63细胞48h后凋亡率明显高于非特异性siRNA组和空白对照组（F=17．32,P〈0．01）;特异性Survivin—siRNA增强了MG-63细胞对多柔比星的敏感性5倍,增强了MG-63细胞对顺铂的敏感性9倍。结论化学合成的Survivin—siRNA能有效抑制Survivin基因在骨肉瘤MG-63细胞中的表达,并提高MG-63细胞对多柔比星、顺铂的敏感性。     

HER-2 siRNA对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:观察表皮生长因子受体2(HER-2)siRNA转染SKOV-3细胞抑制HER-2表达后对卵巢癌细胞耐药性的影响.方法:体外转录合成HER-2序列特异性双链RNA(dsRNA),转染SKOV-3细胞株中,RT-PCR方法检测转染前后HER-2基因的mRNA的表达,MTT法检测顺铂对转染前后卵巢癌细胞的生长抑制率.结果:HER-2siRNA转染72 h后,对SKOV-3细胞HER-2 mRNA表达明显抑制.在不同浓度顺铂(0.05～50μg/ml)的作用下,转染HER-2 siRNA与转染非特异性siRNA、空白对照组相比,差异有十分显著性意义(P＜0.01).细胞对顺铂的敏感性约提高10倍.结论:体外转录合成的siRNA能有效抑制SKOV-3细胞中HER-2的表达,提高细胞对顺铂的敏感性,RNA干扰技术为卵巢癌的治疗提供了一种新策略.     

抑制NFBD1的表达对鼻咽癌化疗敏感性的影响

目的:研究抑制NFBD1表达后,对鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞化疗敏感性的影响。方法:将NFBD1 siRNA导入NPC细胞系,采用RT-PCR和蛋白质印记法检测siRNA对NPC细胞NFBD1表达的抑制效果;NFBD1 siRNA转染后,MTT法分析NPC细胞对化疗药物敏感性的影响。结果:NFBD1 siRNA转染NPC细胞后,能高效、特异地在mRNA水平及蛋白质水平抑制NFBD1的表达;MTT结果分析表明,NFBD1 siRNA转染后,能显著提高NPC细胞系对化疗药物的敏感性。结论:NFBD1 siRNA转染后抑制NPC NFBD1表达,可显著提高其对化疗药物顺铂的敏感性。     

抑制NFBD1的表达对鼻咽癌化疗敏感性的影响

目的：研究抑制NFBD1表达后,对鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）细胞化疗敏感性的影响。方法：将NFBD1 siRNA导入NPC细胞系,采用RT-PCR和蛋白质印记法检测siRNA对NPC细胞NFBD1表达的抑制效果;NFBD1 siRNA转染后,MTT法分析NPC细胞对化疗药物敏感性的影响。结果：NFBD1 siRNA转染NPC细胞后,能高效、特异地在mRNA水平及蛋白质水平抑制NFBD1的表达;MTT结果分析表明,NFBD1 siRNA转染后,能显著提高NPC细胞系对化疗药物的敏感性。结论：NFBD1 siRNA转染后抑制NPC NFBD1表达,可显著提高其对化疗药物顺铂的敏感性。     

Survivin基因沉默抑制胃癌MGC-803细胞增殖并增强其对塞来昔布的敏感性

目的研究Survivin基因沉默对人胃癌MGC-803细胞增殖和对化疗药物塞来昔布敏感性的影响。方法设计合成Survivin的siRNA序列,LipofectamineTM2000转染入MGC-803细胞。采用RT-PCR和Western blotting检测Survivin在干扰后mRNA和蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期。通过MTT法和细胞克隆形成试验法察Survivin基因沉默后MGC-803细胞对塞来昔布的敏感性。结果 Survivin基因沉默48 h后,MGC-803细胞的Survivin基因和蛋白表达明显降低(P<0.05)。细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少(P<0.05)。Survivin基因沉默组细胞对塞来昔布的敏感性显著性增强(P<0.05)。结论 Survivin特异性siRNA能显著沉默MGC-803细胞Survivin基因,抑制细胞增殖,并增强MGC-803细胞对塞来昔布的敏感性。     

长链非编码RNA-p21调控微小RNA-9/去乙酰化酶1信号通路逆转结直肠癌细胞奥沙利铂耐药性

  目的  探讨长链非编码RNA（LncRNA）-p21调控微小RNA-9（miR-9）/去乙酰化酶1（SIRT1）信号通路逆转结直肠癌（CRC）奥沙利铂相关的细胞自噬及耐药性的分子机制。  方法  采用qPCR方法LncRNA-p21的表达检测,Westbloting blotting法检测细胞自噬相关蛋白（微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ（（LC3-I）、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ））,自噬底物 （P62）、去乙酰化酶1（Sirtuin-1,SIRT1）、miR-9 的表达水平;克隆形成实验检测细胞活性。  结果  （1）LncRNA-p21 在奥沙利铂耐药的结直肠肿瘤细胞 HCT116,SW620 中高表达,差异有统计学意义（P < 0.001）;（2）敲降 LncRNA-p21 可抑制细胞自噬,改善 HCT116 细胞对奥沙利铂的化疗敏感性;（3）敲降 LncRNA-p21 后 miR-9 表达上调,而miR-9 过表达可增强 HCT116 细胞对奥沙利铂的化疗敏感性,差异有统计学意义（P < 0.001）;（4）同时,SIRT1 的表达受到 LncRNA-p21 和 miR-9 的调控。  结论  结直肠肿瘤对于化疗药奥沙利铂抵抗可能由LncRNA-p21诱导细胞自噬增强而引起,其过程可能通过 LncRNA-p21调控miR-9/SIRT1信号通路而实现。     

RNAi抑制大肠癌HCT116细胞株VEGF-mRNA表达的实验研究

目的研究载体介导的RNAi(RNA interference) 技术对大肠癌细胞株HCT116中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA表达的抑制作用.方法依据Tuschl等设计siRNA 的原则,以VEGF为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体Pavu6 27中构建重组体 (Pavu6 27-VEGF siRNA).DOTAP脂质体法转染重组体至大肠癌HCT116细胞株,经G418筛选,以空质粒(Pavu6 27)转染为对照;半定量RT-PCR法观察HCT116细胞中VEGF-mRNA表达改变.结果①成功构建发卡样VEGF siRNA(small interfere RNA)真核表达载体(Pavu6 27-VEGF siRNA);② Pavu6 27-VEGF siRNA转染HCT116细胞后,VEGF-mRNA表达较空载体Pavu6 27转染的对照组显著下降.结论成功构建载体介导的VEGF靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制HCT116细胞中VEGF-mRNA表达,为下一步利用RNAi技术抑制肿瘤血管形成以及局部侵袭和远处转移提供研究基础.     

SiRNA-Survivin增强鼻咽癌细胞对放射敏感性的实验研究

目的 研究Survivin表达抑制对鼻咽癌放射敏感性的影响,探讨Survivin基因为靶的分子干预在鼻咽癌放疗中作用.方法 采用脂质体将Survivin特异性siRNA转染鼻咽癌5-8F细胞系,半定量RT-PCK、流式细胞仪检测Survivin基因表达;Survivin特异性siKNA转染5-8F细胞,培养24 h后,用6 GY的放射线处理细胞,继续培养24h后,收集细胞.流式细胞仪、镜下计数检测细胞增殖、凋亡与细胞周期.结果 Survivin特异性的siRNA能有效地阻断5-8F细胞系中Survivin基因表达.特异性SiRNA加放射组,细胞抑制率 (33.7±1.5%) 显著高于特异性SiRNA组[ (23.8±4.3) %,(P<0.05) ]和随机序列的siRNA加放射组[ (15.5±1.7) %,(P<0.01) ].特异性SiPNA加放射组,细胞凋亡率 (24.67±0.50) 显著高于特异性SiRNA组[ (20.30±0.44) ,(P<0.05) 1和随机序列的siRNA加放射组[ (6.58±0.38) ,(P<0.01) ].特异性siRNA加放射组,S/G_1比率 (2.76±0.186) 显著高于特异性siRNA组[ (1.91±0.067) ,(P<0.01) ]与随机序列的siRNA加放射组[ (0.585±0.066) ,(P<0.01) ].结论 有效干预Survivin基因表达能提高鼻咽癌细胞的放射敏感性,增强鼻咽癌的放疗效果.     

沉默孕烷X受体增强结肠癌LS174T细胞对奥沙利铂敏感性的影响

目的观察沉默孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)表达对结肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响,初步探讨其可能机制。方法构建PXR基因的siRNA质粒表达载体,转染结肠癌LS17T细胞,并建立稳定表达细胞,用RT-PCR和Western blot方法检测特异性蛋白1(specificity protein 1,SP1)和多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance-asso-ciate protein 3,MRP3)表达,MTT方法检测奥沙利铂化疗敏感性。结果成功建立PXR敲低细胞克隆PXRi 1#、PXRi 2#;在PXRi 1#和PXRi 2#细胞克隆中,MRP3 mRNA及蛋白表达明显下降,SP1表达也下降;与PXRi control相比,细胞克隆PXRi 1#、PXRi 2#奥沙利铂的IC50值均显著降低[(4.83±0.22)、(4.75±0.19)vs(9.44±0.37),P<0.05]。结论 PXR表达沉默可增强结肠癌LS174T细胞对奥沙利铂化疗敏感性,这可能与PXR沉默后,SP1、MRP3表达下调相关。     

Down-regulation of p110β expression increases chemosensitivity of colon cancer cell lines to oxaliplatin

This study examined the synergetic effect of class ?A Phosphoinositide 3-kinases cata-lytic subunit p110β knockdown in conjunction with oxaliplatin treatment on colon cancer cells. Down-regulation of p110β by siRNA interference and oxaliplatin treatment were applied in colon cancer cell lines HT29, SW620 and HCT116. MTT assay was used to measure the inhibitory effect of p110β knockdown on the proliferation of colon cancer cell lines. SubG1 assay and Annexin-Ⅴ FITC/PI double-labeling cytometry were applied to detect cell apoptosis. And cell cycle was evalu-ated by using PI staining and flow cytometry. The expression of caspase 3, cleaved PARP, p-Akt, T-Akt and p110β was determined by western blotting. The results suggested that down-regulation of p110β expression by siRNA obviously reduced cell number via accumulation in G0-G1 phase of the cell cycle in the absence of notablely increased apoptosis in colon cancer cell lines HT29 and SW620 (S phase arrest in HCT116). Moreover, inhibition of p110β expression increased oxaliplatin-induced cell apoptosis and cell cycle arrest in HT29, HCT116 and SW620 cell lines. In addition, increases of cleaved caspase-3 and cleaved PARP induced by oxaliplatin treatment were determined by im-munoblotting in p110β knockdown group compared with normal control group and wild-type group. It is concluded that down-regulated expression of p110β could inhibit colon cancer cells proliferation and result in increased chemosensitivity of colorectal cancer cells to oxaliplatin through augmentation of oxaliplatin-induced cell apoptosis and cell cycle arrest.     

GSTθ转染对HCT116细胞系的影响

目的观察转染了GSTθ后HCT116细胞系的生长、细胞周期的变化,以及HCT116细胞系生长对血清浓度的依赖性。方法通过脂质体Lipofectamine将质粒载体pcDNA3及pcDNA3-GSTθ分别转染HCT116细胞获得稳定转染株,通过RT-PCR检测GSTθ的表达,细胞计数绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期变化,MTT法检测细胞生长对血清浓度的依赖。结果GSTθ转染后抑制了HCT116细胞的生长,并且是通过G2/M和S期阻滞而导致的,GSTθ还增加了HCT116细胞对血清的依赖性。结论GSTθ可降低HCT116细胞的恶性程度,使其对血清及营养物质的需求增加。     

外源性Muc1、Survivin和Nanog基因启动子在结肠癌干细胞中的表达活性

目的 探讨结肠癌干细胞中不同基因启动子的活性,寻找可能用于结肠癌干细胞靶向治疗的启动子.方法 应用流式细胞仪分选人结肠癌HCT116细胞系中CD133+ CD44+标记的肿瘤干细胞.采用PCR技术获取Nanog、Muc1和Survivin基因启动子并分别克隆入pGL3-basic质粒.将含有启动子的pGL3-basic质粒和pGL3-control质粒分别与pRL-sv40共转染结肠癌细胞(HCT116、SW620、HT29)、结肠癌干细胞(CD133+ CD44+ HCT116)及人正常肝细胞(QSG7701),通过检测双荧光素酶活性以测定启动子活性.结果 pGL3-basic-Nanog、pGL3-basic-Muc1、pGL3-basic-Survivin经测序鉴定正确.HCT116细胞系中CD133+ CD44+细胞比率约占42.2％.双荧光素酶活性检测显示:在HCT116、SW620、HT29和CD133+ CD44+ HCT116细胞中,Muc1与Survivin均表现出了较强的活性,而在正常细胞QSG7701中活性较低.结论 Muc1、Survivin启动子可能是用于靶向结肠癌干细胞治疗的有效候选启动子.     

肠胃清对结肠癌细胞草酸铂药代动力学的影响

目的：研究肠胃清逆转人结肠癌耐草酸铂（oxaliplatin,L—OHP）细胞（HCT116／L—OHP）的耐L—OHP作用,并从药代动力学角度探讨其逆转耐药作用与细胞内铂含量,细胞摄入、排出L—OHP以及铜转运蛋白等的关系。方法：以四甲基偶氮唑盐比色法确定人结肠癌耐药细胞株的耐药性,明确药物血清对HCT116／L-0HP细胞耐L-OHP的逆转作用;采用原子吸收分光光度法测定细胞中铂的浓度,并检测加入药物血清后细胞内铂含量以及L—OHP摄入和排出的变化;采用蛋白质印迹法检测铜转运相关蛋白人铜转运蛋白1（humancoppertransporter1,hCTRl）、铜转运蛋白0t链（ATPaseCu”transportingalphapolypeptide,ATP7A＇）、P型铜转运ATP酶（copper—transportingP—typeadenosinetriphosphatase,ATP7B）、谷胱甘肽S一转移酶n（glutathioneS—transferase-π,GST-π）和多药耐药相关蛋白MRP2）的表达。结果：7．5％药物血清联合L—OHP对HCTll6／L—OHP细胞作用后,HCT116／L-OHP细胞对L—OHP的敏感性增加,半数抑制浓度由89μg／mL下降到32．45μg／mL,逆转指数达到2．74。HCTll6／L—OHP细胞内铂含量比HCT116细胞株降低;HCT116和HCT116／L—OHP细胞株经过7．50A中药血清联合L—OHP处理后,胞内铂-DNA含量比单独L—OHP处理细胞增加。肠胃清药物血清可剂量依赖性地增加人结肠癌细胞HCT116及HCT116／L—OHP对L—OHP的吸收,同时抑制其排出。肠胃清药物血清联合L—OHP处理后HCT116／L-0HP细胞中ATP7A、ATP7B表达量相对于单独L—OHP处理者减少,hCTR1蛋白表达增多,但对GST-π、MRP2蛋白的表达无明显影响。结论：肠胃清通过上调hCTR1蛋白的表达,下调ATP7A、ATP7B蛋白的表达,促进HCT116和HCT116／L—OHP细胞对L—OHP的摄入,抑制其对L—OHP的排出,增加细胞内铂-DNA加合物含量,从而逆转其耐药株HCT116／L—OHP对L-OHP的耐药性。     

去甲斑蝥素通过下调VE-Cadherin和MMP-2/9活性抑制结肠癌血管拟态形成的体外研究

目的:探讨去甲斑蝥素(NCTD)对结肠癌中血管生成拟态(VM)形成的作用及其可能的机制。方法:采用MTT法检测结肠癌细胞HCT116对NCTD的敏感性,筛选无毒剂量;在三维培养基础上观察NCTD作用后VM的形成情况;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测在NCTD干预后细胞内血管内皮钙黏蛋白(VE-Cadherin,VE-Cd)的mRNA表达水平;Western Blot检测NCTD作用后VE-Cd蛋白表达水平;采用明胶酶谱法检测NCTD对三维培养的HCT116细胞MMP-2和MMP-9活性的影响。结果:三维培养下无毒剂量的NCTD能有效地抑制VM形成;VE-Cd mRNA表达在药物作用后出现明显下调;而HCT116细胞的胞浆和胞膜中VE-Cd蛋白均呈下调趋势,胞膜中VE-Cd蛋白下调更明显;三维培养的HCT116细胞MMP-2和MMP-9活性随着NCTD药物浓度的增加而逐渐降低。结论:体外实验研究中,NCTD可以有效抑制结肠癌VM的形成,其机制可能与下调VE-Cd表达和降低MMP-2、MMP-9的活性有关。     

昆明山海棠总生物碱对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究昆明山海棠总生物碱(total alkaloids of tripterygium hypoglaucum hutch,THHta)对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用MTT法检测THHta对HCT116细胞增殖的抑制作用;用倒置及荧光显微镜观察THHta作用后HCT116细胞形态的变化;流式细胞术检测THHta对HCT116细胞周期及凋亡的影响,Western bolt检测凋亡相关caspase-3及PARP蛋白表达.结果 THHLa能显著抑制HCT116细胞增殖,抑制率与剂量和时间呈依赖关系.THHta作用HCT116细胞48、72 h的IC_(50)值小于20 μg/ml.THHta(10μg/ml)能诱导HCT116细胞G_0/G_1期比例增加及细胞凋亡,caspase-3活化及PARP蛋白剪切显著增强.结论 THHta能显著抑制HCT116细胞增殖,并可诱导HCT116细胞G_0/G_1期阻滞及细胞凋亡.     

靶向CK2α基因的siRNA对结肠癌HCT116细胞生长抑制作用及其机制

目的：探讨RNA干扰酪蛋白激酶2（CK2α）基因表达后对HCT116细胞生长的抑制作用并阐明其作用机制。方法：针对CK2α的mRNA序列设计CK2α-siRNA序列,将体外培养的HCT116细胞分为正常对照组(未转染)、阴性对照组(转染siRNA)和CK2α-siRNA组(转染CK2α-siRNA),应用Lipofectamine 2000进行转染,利用Western blotting 法检测CK2α、cyclin H、P53和P21蛋白表达水平;应用MTT法检测各组HCT116细胞增殖;采用流式细胞术检测细胞周期时相的分布。结果：与阴性对照组比较,CK2α-siRNA组CK2α和细胞周期蛋白cyclin H的表达水平明显降低（P<0.01）,P53蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,P21蛋白表达水平则明显升高（
P<0.01）;MTT检测,与阴性对照组比较,转染48和72 h,CK2α-siRNA组细胞存活率明显降低（P<0.01）;流式细胞术分析,与阴性对照组比较,CK2α-siRNA组S期细胞所占比例逐渐减少（P<0.01）,G1期细胞则明显增加（P<0.01）,细胞滞留在G1期。结论：RNA干扰CK2α表达能够抑制HCT116细胞增殖,发生G1期阻滞;其机制可能与RNA干扰CK2α表达后cyclin H表达下调及P53活性恢复有关。     

华蟾素抑制结肠癌细胞增殖转移的实验研究

目的:观察华蟾素对结肠癌细胞HCT116细胞增殖、迁移的影响,探讨其可能的作用机制。方法:常规体外培养结肠癌细胞HCT116细胞系,采用CCK-8法检测不同浓度华蟾素作用不同时间对HCT116细胞增殖的抑制作用,细胞划痕实验和Transwell小室法检测华蟾素对细胞迁移能力的影响,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、钙黏蛋白(E-Cadherin)的表达水平。结果:CCK-8法检测结果表明,华蟾素对HCT116细胞的生长有明显抑制作用,其抑制作用随药物浓度和作用时间的增加而增强(P0.05);细胞划痕实验和Transwell小室法结果显示,随华蟾素药物浓度的增加,HCT116细胞迁移能力下降(P0.05);Western blot结果表明,华蟾素能够明显抑制HCT116细胞MMP-9的蛋白表达并上调E-Cadherin的蛋白表达(P0.01),但对MMP-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。结论:华蟾素能够抑制人结肠癌细胞的增殖和转移,其机制可能与其抑制MMP-9和上调E-Cadherin的蛋白表达有关。