SEPT9基因甲基化在直结肠癌早期诊断中应用的临床意义

目的 集中探讨SEPT9基因甲基化对于直结肠癌早期诊断中的临床应用意义。方法 随机选取2015年3～12月因患结直肠癌于笔者医院普外科进行手术治疗的患者100例,从术中切取的癌灶、其癌旁组织和术前粪便样本中提取DNA,应用多重置换扩增（MDA）结合巢式甲基化特异性PCR扩增技术（nMPS）检测患者术前粪便样本中SEPT9基因的甲基化水平,同时比较粪便同癌灶组织中SEPT9基因甲基化在诊断结直肠癌中的敏感度及特异性。结果 针对100例患者的癌灶组织的SEPT9基因的分析的过程中,基因甲基化的发生率为84.0%;在针对癌旁组织的SEPT9基因的过程中,基因甲基化的发生率为8.0%。患者癌灶及癌旁组织SEPT9基因甲基化发生率的比较差异有统计学意义（P<0.01）;临床分期为Ⅰ、Ⅱ期的结直肠癌患者,采用SEPT9基因甲基化诊断的准确率为87.5%;临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的结直肠癌患者,采用SEPT9基因甲基化诊断的准确率为80.0%。针对不同的临床分期,采用SEPT9基因甲基化诊断结直肠癌的准确率差异无统计学意义（P>0.05）。结论 因粪便中SEPT9基因甲基化检测在结直肠癌患者中的特异性和敏感度较高,可在临床中应用于直结肠癌的早期诊断。     

血浆游离DNA SEPT9甲基化与结直肠癌不同病理类型的相关性

目的研究血浆游离DNA中SEPT9甲基化在结直肠癌(CRC)不同组织病理学类型、不同大体形态分型中的检出水平及临床意义。方法选取北京市肛肠医院术前检测SEPT9甲基化,术后进行病理学分析的大肠良恶性肿瘤209例,包括结直肠癌182例,腺瘤及神经内分泌瘤27例,统计SEPT9甲基化在结直肠癌不同组织学类型、不同大体形态分型的阳性检出率。结果SEPT9在不同组织学类型:腺癌(非特殊性)、腺癌(特殊型,如印戒细胞癌)、鳞癌、腺瘤、肠道其他肿瘤(主要为神经内分泌瘤、平滑肌瘤、间质瘤)中的阳性检出率分别为66.7%、63.6%、33.3%、4.5%和0;在不同大体形态分型:隆起型、溃疡型、隆起溃疡型中的阳性检出率分别为35.3%、50.0%和67.0%。结论SEPT9在不同组织学类型中阳性检出率不同,可能与大肠癌的发病机制及发病阶段有关。SEPT9在隆起型、溃疡型、溃疡隆起型肿瘤中阳性检出率依次升高,可能与肿瘤随着肿瘤进展,逐渐增大有关。     

血浆甲基化SEPT9 DNA用于筛查无症状结直肠癌

美国学者Church等对精确检测血浆中甲基化SEPT9 DNA(mSEPT9)筛查人群中结直肠患者的方法进行了前瞻性的评价.该研究选取年龄≥50岁、无临床症状的人群进行结肠镜筛查,检查前留取血浆样本,由3个设盲的独立实验室采用RT-PCR分析所有检出的结直肠癌患者和随机分层的其他筛查者血浆的DNA,并对总体的灵敏度和特异性进行标准化.研究结果显示:对53例结直肠癌和1 457例无结直肠癌的研究对象,该方法的标准化灵敏度为48.2％(95％可信区间32.4％～63.6％,粗略灵敏度为50.9％);对于Ⅰ～Ⅳ期结直肠癌患者分别为35.0％、63.0％、46.0％和77.4％.     

应用甲基化识别定量检测胎儿DNA

目的建立一种应用表观遗传学方法定量检测孕妇血浆中游离胎儿DNA的方法。方法 48例正常孕妇为观察组,10例非孕健康妇女为对照组,抽取外周血10 mL,应用甲基化标志物T-box3基因,经DNA分离、甲基化敏感限制性内切酶消除样本中母源性(非甲基化)DNA。未分解的胎儿DNA在合成寡核苷酸的存在下行竞争性聚合酶链反应扩增,再用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱定量检测分析胎儿DNA。结果观察组血浆游离胎儿DNA平均为(148.0±63.5)×103拷贝数.L-1,胎儿DNA占标本中总游离DNA的比例为12%;对照组血浆甲基化DNA平均为(6.0±4.5)×103拷贝数.L-1;2组血标本中甲基化DNA拷贝数差异有统计学意义(P<0.05)。本检测方法的敏感性和特异性分别为99%和100%。结论应用甲基化识别可以对母血中分离出的胎儿DNA进行检测并定量分析,有助于扩大无创伤性产前诊断的临床应用范围。     

SEPT9基因甲基化检测联合CA199和CEA在结直肠癌诊断中的应用价值

目的 探讨SEPT9基因甲基化(mSEPT9)联合糖类抗原19-9(CA199)、癌胚抗原(CEA)在结直肠癌诊断中的应用价值.方法 选取2019年6月至2020年6月于本院肛肠科住院患者200例的血液样本,其中70例结直肠癌患者血液样本作为A组,130例结直肠腺瘤患者血液样本作为B组;同期收集本院体检中心100名健康...     

粪便多基因联合检测在结直肠癌早期筛查中的应用

目的 研究联合检测粪便中sFRP2、Vimentin和HPP1基因甲基化状态在结直肠癌早期筛查中的应用。 方法 将杭州市第三人民医院2017年10月—2019年10月期间收治的结直肠癌患者60例为结直肠癌组,由腺瘤性息肉患者60例及正常健康人30例组成非结直肠癌组(90例),收集清晨粪便标本,提取粪便DNA,并进行亚硫酸氢盐修饰处理,采用甲基化特异性PCR检测sFRP2、Vimentin和HPP1基因甲基化状态,分析其与结直肠癌临床病理特征的关系,比较3个基因联合检测诊断敏感度及特异度。 结果 在结直肠癌患者中,检测sFRP2、Vimentin和HPP1单基因甲基化敏感度分别为46.7%、43.3%、53.3%,特异度分别为73.3%、75.6%、76.7%;联合组以3个基因中任1个基因甲基化表达阳性判为阳性,联合检测诊断结直肠癌的敏感度为83.3%,特异度为46.7%,敏感度均高于sFRP2、Vimentin和HPP1单基因甲基化检测。3个基因甲基化状态与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移及TNM分期均无关(均P>0.05)。 结论 在结直肠癌患者粪便DNA中sFRP2、Vimentin和HPP1基因异常甲基化发生率明显高于非结直肠癌患者,联合检测粪便多基因筛查结直肠癌优于单基因检测,在结直肠癌早期筛查应用中具有重要意义。      

结直肠癌患者血清游离DNA的表达及意义

目的:建立基于ALU序列的实时荧光定量PCR(ALU-q PCR)检测游离DNA浓度的方法,并探讨结直肠癌患者血清游离DNA定量检测的临床意义。方法:随机采集结直肠癌104例、结直肠息肉63例和正常人110例血清标本,采用ALU-q PCR方法定量检测血清ALU115表达水平;用化学发光方法检测肿瘤标志物CEA的水平。结果:(1)结直肠癌患者血清ALU115浓度中位数为1046.0 ng/m L,显著高于结直肠息肉组423.3 ng/m L和对照组385.4 ng/m L,差异有统计学意义(P均<0.001),结直肠息肉组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)结直肠癌血清ALU115和CEA联合检测灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别是82.69%、99.09%、91.12%、98.85%和85.82%,两者联合检测提高结直肠癌诊断率。结论:基于ALU序列的实时荧光定量PCR是一种快速简便、灵敏度高及特异性好的检测方法。血清cf-DNA浓度对结直肠癌辅助诊断有一定的价值。     

血浆SFRP1和Septin9基因甲基化检测对结直肠癌诊断的临床价值

探讨SFRP1和Septin9基因甲基化对结直肠癌的诊断价值,收集结肠镜检查和组织病理学确诊为结直肠癌的患者47例,非结直肠癌的对照组33例;测定两组外周血浆中SFRP1和Septin9基因的甲基化状态,并且进行粪隐血检测。结果显示,SFRP1和Septin9基因甲基化诊断结直肠癌的敏感度为80.0%,特异度为95.3%,粪便免疫学检测的敏感度为86.3%,特异度为54.3%,两者结合后敏感度为97.6%,特异度为96.8%,且明显高于单独检测。故SFRP1和Septin9基因甲基化联合粪免疫学检查可提高结直肠癌诊断的敏感度和特异度,而且具有无创、采样简单、依从性强、实验方法稳定等特点,适宜于临床推广使用。     

肝癌患者血浆RASSF1A异常甲基化检测的意义

目的:采用甲基化特异性PCR法(MSP)检测41例原发性肝癌(HCC)患者血浆中游离Ras相关结构域家族蛋白1A(RASSF1A)异常高甲基化情况,探讨血浆RASSF1A检测在肝癌诊断中的意义. 方法:收集患者血浆,提取游离DNA,亚硫酸氢钠修饰并纯化,以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR. 结果: 41例患者血浆中有17例RASSF1A呈现异常高甲基化(41.5%),对照血浆均为阴性. 患者一般情况、临床病理资料等与血浆中RASSF1A异常高甲基化检测结果无关(P＞0.05);在10例AFP阴性的HCC患者中,有7例结果为阳性. 结论:血浆RASSF1A甲基化检测对肝癌的早期诊断及筛选有重要意义,并有助于判断预后.     

结直肠癌ZIC1和KLOTHO基因启动子甲基化检测的临床价值初探

目的:观测ZIC1和KLOTHO基因在结直肠癌组织中的表达情况,探讨检测ZIC1和KLOTHO基因启动子甲基化在结直肠癌临床诊断中的价值.方法:选取25对(包括癌和癌旁组织)结直肠癌患者手术标本组织,通过实时荧光定量RT-PCR检测ZIC1和KLOTHO mRNA在结直肠癌和癌旁相对正常组织中的表达;通过甲基化特异性PCR(MSP)检测结直肠癌和癌旁相对正常组织中ZIC1和KLOTHO基因启动子甲基化阳性率,并分析其与结直肠癌患者临床病理资料(年龄,性别,分化程度和TNM分期)的关系.结杲:ZIC1和KLOTHO mRNA在结直肠癌组织中表达较正常组织明显下调(P均<0.0001);在25例结直肠癌患者癌组织中,ZIC1甲基化阳性率为80%,KLOTHO甲基化阳性率为76%,联合检测ZIC1和KLOTHO甲基化阳性率为64%.结论:ZIC1和KLOTHO基因在结直肠癌中表达下调,肿瘤组织基因启动子甲基化高频率发生,联合检测ZIC1和KLOTHO基因甲基化有助于结直肠癌的诊断.     

血浆RASSF1A甲基化检测及其在非小细胞肺癌诊断中的意义

目的:分析非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血浆游离DNA和相应的肿瘤组织中RASSF1A启动子甲基化情况,探讨检测血浆中该基因异常甲基化在NSCLC诊断中的意义。方法:应用半巢式MSP法分析了96例NSCLC、12例肺良性病变患者及20例健康人血浆游离DNA,MSP法分析了96例NSCLC患者对应的肿瘤组织DNA,检测RASSF1A的异常甲基化改变。结果:①血浆及相应的肿瘤组织RASSF1A异常甲基化检出率分别为43.75%和48.96%,血浆中该基因甲基化仅发生在相应的肿瘤组织甲基化阳性的NSCLC患者。②血浆RASSF1A异常甲基化只与肿瘤的组织学类型有关,鳞癌组(57.14%)高于腺癌组(33.33%,P<0.05)。但与患者的年龄、性别、是否吸烟,肿瘤的TNM分期、分化程度和有无淋巴结转移无关(P>0.05)。③检测RASSF1A异常甲基化用于诊断NSCLC的敏感性43.75%,特异性100%,阴性预测值41.30%,阳性预测值100%。结论:RASSF1A异常甲基化很可能是NSCLC发生过程中的早期分子事件,检测血浆游离DNA中该基因异常甲基化可能成为NSCLC早期诊断的有效方法之一。     

NDRG4基因甲基化检测在结直肠癌早期诊断中的应用研究

目的探讨NDRG4甲基化检测在结直肠癌诊断中的价值。方法从84例结直肠癌手术切除癌组织、癌旁组织及其术前粪便、尿、血中提取DNA,应用巢式甲基化特异性PCR（nested methylation specific PCR,nMSP）检测结直肠癌粪便、尿、血中NDRG4基因甲基化水平。比较结直肠癌组织和粪便、尿、血中NDRG4甲基化检测在结直肠癌诊断中的敏感性和特异性。结果在84例结直肠癌中,癌组织NDRG4检出率为81.0%,癌旁组织检出率为8.3%,敏感性为81.0%,特异性为91.7%;结直肠癌中粪便NDRG4基因甲基化的敏感性和特异性在3个微量DNA中最高,尿次之。结论结直肠癌组织NDRG4基因甲基化异常发生率高;粪便和尿中NDRG4甲基化异常可作为结直肠癌早期诊断的肿瘤标志物。     

血浆Septin9基因甲基化检测在结直肠癌不同病理特征中的表达差异研究

目的:比较血浆Septin9基因甲基化检测在结直肠癌不同病理特征中的表达差异。方法:前瞻性分析2017年6—10月湖南省人民医院胃肠外科进行手术治疗的48例结直肠癌患者,检测患者术前血浆Septin9基因甲基化情况,结合术后病理标本,比较各病理特征中甲基化阳性率的情况。结果:血清Septin9基因甲基化在不同淋巴结转移分期、病理分期中差异具有统计学意义(X~2=7.07、11.02,P均0.05)。特别是淋巴结转移分期越晚,病理分期越晚,其阳性率越高,其中N2a阳性率为84.6%,N2b阳性率更是达到了100%;Ⅲ期阳性率70.6%,Ⅳ期为83.3%。结论:中晚期结直肠癌患者血浆Septin9基因甲基化阳性率极高,对结直肠癌的诊断及筛查具有重要意义。     

结直肠癌患者血浆循环游离DNA的RAS突变与临床特征的关系

目的 探讨结直肠癌患者血浆循环游离DNA(cfDNA)与肿瘤组织DNA的RAS基因突变检测的一致性,以及与临床特征的关系.方法 收集71例结直肠癌患者的血浆及肿瘤组织标本.采用多重荧光PCR法检测血浆标本cfDNA的RAS的基因突变状态,并与肿瘤组织标本的相应基因突变状态对比分析.分析血浆RAS基因突变状态与患者临床特征的关系.结果 血浆cfDNA的RAS突变率为32.39%,组织DNA的RAS突变率为50.70%,两种标本的RAS突变检测的一致率为76.06%,血浆cfDNA与组织DNA的RAS突变检测结果一致(Kappa=0.523,P=0.000).血浆cfDNA检测的敏感性为58.33%、特异性为94.29%、阳性预测值为91.30%、阴性预测值为68.75%.血浆cfDNA的RAS突变状态与结直肠癌患者年龄、性别、分期(Ⅳa与Ⅳb)、原发肿瘤部位、肺转移、CEA水平、CA199水平等无明显相关性,而血浆cfDNA的RAS突变与结直肠癌患者肝脏转移有相关性(P=0.045),肝转移患者较未发生肝转移的患者突变率升高.结论 血浆cfDNA可以作为无法获得组织标本的结直肠癌患者的RAS基因检测的替代标本,具有临床应用价值,且结直肠癌患者肝脏转移cfDNA RAS突变率升高.     

SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测在结直肠癌早期筛查中的应用价值

目的 探讨粪便样本中硫酸类肝素蛋白多糖基因(SDC2)甲基化和组织因子途径抑制物2基因(TFPI2)甲基化联合检测在结直肠癌早期筛查中的应用价值。方法 选取106例结直肠癌患者(结直肠癌组)、75例进展期腺瘤患者(进展期腺瘤组)、35例非进展期腺瘤患者(非进展期腺瘤组)为研究对象，并以同期153例其他消化系统干扰性疾病患者、182例结肠镜检查结果为阴性者作为对照组，采用甲基化荧光定量PCR(qMSP)法对所有受试者的粪便标本进行SDC2和TFPI2基因甲基化检测。以结肠镜检查及病理检查结果为金标准，评估SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测对结直肠癌和腺瘤检测的灵敏度和特异度。结果 106例结直肠癌患者中，甲基化联合检测灵敏度为93.4%;75例进展期腺瘤患者中，甲基化联合检测灵敏度为62.7%;35例非进展期腺瘤患者中，甲基化联合检测灵敏度为34.3%; SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测对结直肠癌和腺瘤筛查的特异度为94.6%。结论 SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测对结直肠癌及其早期病变具有较高的灵敏度，同时保持较高的特异度。     

数字PCR检测血浆游离DNA方法的建立及在结直肠癌中的初步应用

目的 建立基于微滴式数字PCR（ddPCR）技术定量检测血浆游离DNA（cf-DNA）含量的方法,并探讨其在结直肠癌诊疗中的应用价值。方法 设计β-actin特异性引物和探针,建立ddPCR检测cf-DNA绝对定量方法,根据不同浓度标准品验证该检测方法的敏感度、线性以及重复性。该法检测68例结直肠癌患者、33例结直肠良性肿瘤患者及60例健康对照者血浆cf-DNA水平,化学发光法检测其血清CEA、CA19-9水平,分析血浆cf-DNA水平与临床病理参数及血清CEA、CA19-9水平的关系,并用ROC曲线评估其诊断效能。结果 本实验所建立的ddPCR方法能够检测低至10pg/μl的微量DNA模板,检测敏感度为0.29copies/μl;且在模板浓度为10pg/μl~10ng/μl的范围内线性良好（Y=-2.34+33.17X,R²=0.999）;批内CV为9.85%,批间CV为11.04%。该法检测结直肠癌组、结直肠良性肿瘤组和健康对照组血浆cf-DNA水平分别为6700（3800~9925）、3100（2300~4000）、2500（1775~4000）copies/ml,结直肠癌组血浆cf-DNA水平显著高于结直肠良性肿瘤组（P=0.000）和健康对照组（P=0.000）,而结直肠良性肿瘤组与健康对照组比较,差异无统计学意义（P=0.167）。结直肠癌患者血浆cf-DNA水平在不同年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移以及肿瘤浸润程度间比较,差异均无统计学意义（P均>0.05）,在TNM分期间差异有统计学意义（P<0.01）。结直肠癌患者血浆cf-DNA水平与CEA （r=0.210,P=0.099）和CA19-9（r=0.125,P =0.233）无相关性。ROC曲线结果显示,以5300copies/ml为cut off值,cf-DNA诊断结直肠癌ROC曲线下面积（AUC）、敏感度、特异性分别为0.931、73.3%和98.3%,高于CEA（0.762、51.7%、95.6%）和CA19-9（0.548、45.0%、82.0%）。结论 建立了一种敏感、特异的ddPCR定量检测血浆cf-DNA的方法,有助于结直肠癌的辅助诊断及预后判断。     

用PCR结合甲基化特异PCR方法检测遗传性脆性X综合征

目的 建立一种快速、灵敏、廉价的实验室检测脆性X综合征(FXS)的方法.方法 检测130例样本的(CGG)n重复数.首先,PCR扩增脆性X智力低下基因Ⅰ(FMRⅠ)的(CGG)n重复序列;其次,进行甲基化特异性PCR (MS-PCR),对男性不能有效扩增和女性样本的基因组DNA进行亚硫酸氢钠脱氨基修饰,以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对(甲基化特异性引物对和非甲基化特异性引物对)扩增FMRⅠ基因的(CGG)n重复序列区,PCR产物测序.结果 所有样本的(CGG)n重复数都在13～47之间;测序结果表明FMRⅠ基因中的非甲基化的C碱基转变为T碱基,甲基化的C碱基保持不变.结论 PCR结合MS-PCR方法可以同时检测FMRⅠ基因的 (CGG)n重复数和CpG岛的甲基化情况,为临床检测FXS提供了依据.     

结直肠癌中Tiam1基因启动子区甲基化与其表达的相关性

目的分析结直肠癌中Tiam1基因启动子区甲基化情况与其蛋白表达之间的关系。方法采用亚硫酸氢盐修饰测序法(bisulfite sequencing PCR)检测2例结直肠癌细胞系、4例结直肠癌组织及其配对的正常结直肠黏膜中Tiam1基因启动子区CpG岛的甲基化情况;采用免疫组织化学S-P法检测Tiam1蛋白的表达。结果Tiam1基因启动子的CpG位点在4例结直肠癌组织、2株结直肠癌细胞中均未甲基化,而在正常结直肠黏膜中发生了甲基化;Tiam1蛋白在结直肠癌组织及细胞中表达,在正常肠黏膜组织中无表达。结论结直肠癌中Tiam1基因启动子低甲基化与其蛋白高表达间呈负相关性,Tiam1基因启动子的异常甲基化很可能在Tiam1促进结直肠癌侵袭与转移中发挥重要作用。     

乳腺癌患者肿瘤循环DNA的定量分析

目的:检测乳腺癌患者肿瘤循环DNA的含量及其p16基因5' CpG岛甲基化状态的改变. 方法:收集61例乳腺癌患者、33例乳腺良性病变患者和27例健康志愿者的血浆样本,抽提血浆循环DNA,以SYBR green I荧光染色法行DNA定量;利用半巢式甲基化特异性PCR技术,检测61例乳腺癌患者血浆循环DNA和相应癌组织p16基因5' CpG岛甲基化状态的改变. 结果:乳腺癌患者、乳腺良性病变患者、健康自愿者肿瘤循环DNA浓度分别为(65.0±45.3), (19.0±9.5)和(13.0±7.3) μg/L,乳腺癌患者血浆循环DNA浓度显著高于乳腺良性病变患者和健康自愿者,差异有统计学意义(P＜0.05). 61例乳腺癌患者血浆循环DNA和相应癌组织p16基因5' CpG岛甲基化状态的改变检出率分别为44.3%和46.2%,两者检出率无统计学差别(P＞0.05). 结论:血浆肿瘤循环DNA的定量有可能成为一种新的恶性肿瘤标志物.     

DNA甲基化在结直肠癌早期诊断中的研究进展

DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要方式,可以在不改变DNA序列的情况下调控基因的表达。在结直肠癌的发生发展过程中,DNA异常甲基化发挥着重要作用,而且该异常现象在早期肠癌患者的外周血、粪便等体液中就可检测到。因此,DNA甲基化检测有望成为结直肠癌无创早期诊断的有效手段,对临床肿瘤的防治有着重要意义。