外源性H2O2对大鼠纯化视网膜神经节细胞存活及轴突生长的影响

目的研究外源性H2O2对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存活和轴突生长状况的影响及其与神经微丝蛋白NF-H表达变化的关系,探讨H2O2的氧化应激引起RGCs损伤的机制。方法纯化培养SD乳鼠RGCs,应用不同浓度H2O2(250、500μmol/L)分别作用4、8、24、32h后测定存活、有突起的视网膜神经节细胞数及其最长突起长度。采用免疫组织化学染色加图像分析系统检测H2O2对RGCs表达神经微丝蛋白NF-H的影响。结果纯化培养的SD大鼠RGCs纯度可达96.24%。H2O2以浓度和时间依赖的方式影响纯化培养的RGCs存活数,500μmol/L的H2O2在32h可以导致RGCs存活数下降约50%。同时,500μmol/L H2O2孵育后RGCs细胞轴突长度与对照组比较明显减短,差异有统计学意义(P<0.01),且减短程度随时间延长而增大;NF-H表达差异也有统计学意义(P<0.01),且NF-H在RGCs中分布紊乱。结论 H2O2的氧化应激损伤能够以时间和浓度依赖的方式影响纯化培养的RGCs存活,可影响RGCs轴突生长,这可能与其下调RGCs中神经微丝蛋白的表达有关。     

家兔视神经压迫性损伤后视网膜及视神经动态病理改变的实验研究

①目的 探讨视神经持续钳夹伤后视神经和视网膜的病理改变及其与时间的关系。②方法 实验用家兔，暴露家兔视神经球后段，用夹力为5mmH2O的无创血管夹持续钳夹视神经，与术后不同时间点取材进行病理学观察。③结果 ①钳夹4小时，神经软膜及实质水肿，束间膜血管周围间隙增宽；钳夹16小时，鞘膜下血肿，神经实质内灶性出血，视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)形态改变不明显；钳夹24小时，神经脱髓鞘改变，神经轴束间空泡样改变，局灶性坏死，RGCs核固缩和细胞数量减少；钳夹48小时，轴心部出现梗死灶，开始有胶质细胞增生，RGCs数量明显减少，核固缩细胞增多；钳夹72小时，轴心部梗死灶扩大，RGCs数量继续减少，稀疏排列。②RGCs数量于钳夹4、16、24、48、72小时分别比正常对照组低1．61％、2．74％、6．32％、10．28％、13.30％。③视网膜神经节细胞在24小时内出现凋亡。④结论 本实验模型可造成明确的视神经和视网膜损伤，较贴近于临床视神经管内持续高压状态。视网膜和视神经损伤的严重程度与时间呈相关性。推荐临床视神经损伤确诊后，如需手术减压应在24小时内实施效果较佳。     

白细胞介素-4和白细胞介素-12对纯化培养小鼠视网膜神经节细胞存活的影响

目的观察白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)对于纯化培养条件下视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)生存率的影响,进一步探讨自身免疫调节紊乱与视网膜神经节细胞损害之间的关系。方法应用抗小鼠Thy1.2抗体粘附两步纯化法,得到纯化的小鼠视网膜神经节细胞。Thy1.2单克隆抗体联合神经微管蛋白-2多克隆抗体对RGCs进行免疫细胞化学双标记法鉴定RGCs纯度。TUNEL染色法检测凋亡细胞、通过细胞形态学观察计数细胞。实验分为两个阶段,首先观察IL-4和IL-12对RGCs的直接影响;然后观察在NMDA兴奋性毒性作用下IL-4和IL-12对于RGCs的影响。结果正常培养条件下,除10 U/mLIL-4外,IL-4和IL-12其余浓度组的RGC存活率均较对照组降低(P<0.0083);当有NMDA存在时,1、10、100 U/mL的IL-4和IL-12浓度组的RGCs存活率分别为79.2%、87.2%、69.5%及77.5%、76.4%和73.7%,均较单纯NMDA处理组的RGCs存活率62.25%明显提...     

脑源性神经营养因子对视网膜作用的研究进展

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养因子(neurotrophic fac-tors,NTFs)家族成员之一,广泛分布于人体各种组织细胞中,具有重要的生物学特性,其在眼科方面的作用也在深入研究。本文就BDNF对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)、视网膜光感受器细胞(retinal photoreceptor cells,RPCs)及视网膜血管内皮细胞(retinal endothelial cells,RECs)等的作用进行综述。     

α-crystallin与多种细胞作用的免疫荧光观察

目的 在α-crystallin(α晶体蛋白)对RGCs保护性作用研究并进行定位研究的基础上,对α-crystallin与其他细胞之间的作用相比较,以期揭示α-crystallin与RGCs作用的本质.方法 原代培养大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)、大鼠巨噬细胞、大鼠心肌细胞以及传代培养的ECV细胞株、293细胞细胞株、猪视网膜色素上皮细胞(RPE).应用免疫荧光结合激光共聚焦技术观察α-crystallin与多种细胞的作用.结果 免疫荧光结合激光共聚焦发现α晶体蛋白在3种细胞中有阳性免疫沉积物出现在细胞膜上,其对照组阴性;3种细胞见实验组和对照组均有阳性免疫沉积物出现在细胞浆、细胞核中.结论 α晶体蛋白不是特异性与RGCs发生作用,它是广泛存在的生物学效应物质.α晶体蛋白具有sHSP的抗应激损伤特性,对于不表达内源性α晶体蛋白的同时又是抗损伤能力较弱的RGCs,可通过增加外源性α晶体蛋白达到有效保护RGCs的目的 .     

视网膜神经节细胞的损伤机制

视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的进行性死亡是许多视网膜和视神经疾病发展到最后的必经之路。RGCs的死亡存在两种方式：细胞坏死和细胞凋亡。两者是相互重叠的死亡过程。RGCs损伤既可引起细胞坏死，又可引起细胞凋亡。近年来，随着对细胞凋亡研究的深入，人们对RGCs损伤机制的认识也有一定程度的提高。目前认为     

大鼠视神经挫伤后视网膜神经节细胞形态改变及GFAP表达的变化

目的 研究大鼠视神经夹挫伤后视网膜神经节细胞（RGCs）形态学及其神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）表达的变化。方法 采用大鼠球后视神经钳夹伤模型，动物分别于损伤后1、3、5、7、9、14、21d处死，苏木精-伊红染色观察视神经组织及RGCs的动态变化，免疫组化方法检测视网膜组织GFAP的表达水平。结果 视神经损伤后，RGCs数目明显下降，14d内降低速度较快，14d后下降速度减慢；与正常大鼠视网膜相比，GFAP表达明显增加，伤后7d达峰值，14d时降至正常水平。结论 视神经损伤后RGCs数量减少是其视功能下降的病理基础之一，视网膜Muller细胞GFAP表达增加是Muller细胞损伤修复的一种表现。     

压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞中神经微丝的影响

目的 研究压力对体外培养的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中神经微丝的影响,探讨高眼压性青光眼中细胞骨架蛋白的表达变化.方法 建立体外加压培养纯化的Sprague-Dawley(SD)乳鼠视网膜神经节细胞模型,采用抗大鼠Thy1.1单克隆抗体免疫荧光细胞化学染色法鉴定RGCs的纯度.将纯化培养的SD乳鼠RGCs分别在0、20、40、60及80 mmHg的压力下培养.免疫组织化学方法检测神经微丝蛋白-H(NF-H)的表达,并用图像分析系统对各组NF-H表达进行分析测定.结果 ①纯化后的视网膜神经节细胞纯度为96%.②压力为20 mmHg时,实验组RGCs中NF-H表达与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),且NF-H在视网膜神经节细胞中的分布相对均一;压力为40、60及80 mmHg时,实验组RGCs中NF-H表达与对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.01),且NF-H在视网膜神经节细胞中分布紊乱.结论 纯化的RGCs可以在体外存活并生长,一定的压力(≥40 mmHg)可影响RGCs中细胞骨架蛋白的表达.     

青光眼视网膜神经节细胞保护性治疗进展

视网膜神经节细胞(RGCs)的过度凋亡是青光眼病理改变的基础,探讨RGCs的保护性治疗,减慢或防止其凋亡,保持其生理功能,已被公认为是防治青光眼视神经损害的研究方向。该文目前青光眼RGCs保护性治疗在补充神经营养因子及平衡营养因子前体、基因治疗、免疫相关治疗、兴奋性氨基酸拮抗剂治疗等方面的最新研究进展予以综述。     

CNTF对视神经损伤后视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的：研究睫状神经营养因子（CNTF）对视神经损伤后视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡的影响。方法：采用中号显微血管夹建立视神经中度损伤模型后,取左眼作为治疗组,在即时、1、37、d时分别向玻璃体腔内注入2μl（1μg/μl）CNTF溶液;取右眼作为实验对照组,同治疗组在每个时间点向玻璃体腔内注入2μl双蒸水。于伤后1、3、71、4 d时分别做HE染色、原位末端标记法（TUNEL）检测。结果：光镜下观察治疗组细胞形态明显好于实验对照组。TUNEL显示凋亡RGCs数随视神经损伤时间延长而变化（P〈0.05）。伤后1 d,治疗组和实验对照组凋亡RGCs数两组间相比较无统计学意义（P〉0.05）。伤后3、7、14 d时治疗组的凋亡RGCs数明显比实验对照组少（P〈0.05）。结论：玻璃体腔内注射外源性CNTF可以减少RGCs的凋亡,对视神经中度损伤后RGCs具有明显保护作用。     

Long Evans大鼠视网膜神经节细胞电生理学发育特性研究

目的 研究Lnng Evans大鼠不同发育阶段视网膜神经节细胞(Retinal Ganglion Cells，RGCs)电生理学特性，认识视觉发育过程中视网膜神经元成熟的细胞内机制。方法 取出生后3～31d Lnng Evans大鼠，制备视网膜片，寻找RGCs行膜片钳全细胞记录，给予不同强度去极化脉冲，诱发动作电位。结果 33只Long Evans大鼠共获得94个RGCs，按动作电位类型RGCs分为单锋型、瞬变型和持续型，在视觉发育不同阶段，3种类型的RCCs所占比例不同，在电生理特性上有显著差异。结论 在视觉发育过程中，RGCs的电学特性逐渐成熟，动作电位的幅度、频率存在差异，提示不同类型的RGCs在编码及传递时间、空间视觉信息中具有不同作用。     

Culture of rat retinal ganglion cells

This study aimed to modify the mixed and purified culture of rat retinal ganglion cells(RGCs) in vitro.The retinae of 1-3 day old Sprague-Dawley(SD) rats were separated bluntly into two layers:inner layer and outer layer,under a surgical microscope.Retinal cells isolated from different layers(inner layer,outer layer and whole retinal tissue) by using enzyme dissociation method were cultured in F12/DMEM medium containing 15% FBS.After 3-day culture,the RGCs in the retinal cells obtained from mixed culture of inner,outer,and whole retinal tissue were identified by immunocytochemical staining of Thy-1.1,and the rate of RGCs to retinal cells(RGCs%) was calculated.Two monoclonal antibodies,anti-macrophages/granulocytes(OX-41) against rat macrophage and antibody against rat Thy-1.1(OX-7),were used to purify RGCs by either a conventional or modified two-stepped immunopanning procedure(purification in situ).Purified RGCs were seeded at different cell density and cultured in F12/DMEM medium containing 15% FBS.Immunocytochemical staining for Thy-1.1,MTT,and PI-Hoechst33342 fluorescence imaging were used to identify the purity and the viability of RGCs in purified culture of RGCs.The results showed:(1) Immunocytochemistry of different retinal tissue layers culture revealed that the RGCs% was(19.9±1.2)%,(0.5±0.2)%,and(6.2±1.7)% respectively in the mixed culture of inner,outer,and whole retinal tissue,with differences being significant(P<0.05);(2) fluorescent double staining of Hoechst33342 and PI indicated that with the same RGCs%,RGCs obtained from purification in situ grew well with more neurite outgrowth than those by the conventional two-stepped immunopanning method;(3) the viability of purified RGCs seeded at high density was in-creased and the cells developed complex intercellular networks.The viability of RGCs was declined with the decreasing seeding density,and most cells presented round or oval in shape with thin neurites.It was concluded that:(1) RGCs% in the inner layer retina was higher than that in the outer layer retina;(2) RGCs obtained by in situ purification had more neurite outgrowth and lower mortality than those by conventional two-stepped immunopanning procedure;(3) the viability of purified RGCs could be increased by increasing cell seeding density to some extent.     

Long Evans大鼠视网膜神经节细胞培养与鉴定

目的建立Long Evans大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)体外培养的方法,为RGCs的体外实验研究奠定基础.方法出生后1～3 d的Long Evans大鼠视网膜神经上皮层,胰蛋白酶 透明质酸酶消化制成单细胞悬液,用DMEM培养液进行培养,观察细胞生长规律,图像分析系统分析有突起的RGCs数目、胞体面积和最长的突起长度,Thy1.1单克隆抗体和微管相差蛋白2多克隆抗体荧光双标法鉴定RGCs.结果 Long Evans大鼠RGCs体外培养存活4 d;荧光双标显示RGCs纯度为80%～90%.结论在普通培养基中Long Evans大鼠RGCs体外培养能获成功.胰蛋白酶 透明质酸酶联合消化较单独用胰蛋白酶消化效果好.     

大鼠发育过程中视网膜神经节细胞的膜学特性

目的 研究出生后不同发育阶段Wistar大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的膜学特性，包括被动膜学特性和去极化脉冲诱发的动作电位(AIction potential，AP)，并分析其与年龄的关系。方法 应用视网膜切片膜片钳全细胞记录技术，获得7～30dWistar大鼠视网膜神经节细胞的膜片钳全细胞记录。结果 ①记录了112个视网膜神经节细胞；②随着发育，RGCs的膜学特性发生显著变化，兴奋性增加，睁眼前组与睁眼后组间有显著性差异；③去极化脉冲诱发其产生的动作电位有3种形式：单峰型、瞬变型、持续型。随着视觉发育，单峰型逐渐减少，持续型逐渐增加，细胞成熟时未见到单峰型，只见到瞬变型和持续型。随着发育，RGCs的电生理特性发生显著变化。结论 ①睁眼后形觉刺激促进RGCs膜学特性的成熟；②随着发育，RGCs的AP类型发生显著变化，单峰型是RGCs发育过程中的一种前期状态，最终分化为瞬变型和持续型RGCs。     

荧光金逆行标记评价视神经切断后视网膜节细胞存活率

目的：利用荧光金逆行标记评价视神经切断后视网膜节细胞（RGCs）的存活率。方法：将SD大鼠20只随机均分为4组，正常对照组和视神经切断后5d、7d和1dd组。用荧光金逆行标记和定量解剖学技术观察正常对照组和视神经切断后5d、7d和14d组RGCs的密度。结果：正常对照组RGCs呈放射状分布，边界清晰，可见明显细胞突起，无渗漏现象；视神经切断组RGCs随时间延长而减少，细胞分布不均匀，并且可见吞噬死亡细胞碎片和从死亡细胞渗漏的荧光金的小胶质细胞。正常对照组左眼与右眼RGCs密度差异无统计学意义（P〉0．05）；视神经切断后RGCs进行性减少，切断后5d、7d和14d组左眼RGCs密度均明显低于正常对照组（P〈0．01），视神经切断后5d、7d和14d存活率分别为53％、38％和13％。结论：荧光金逆行标记是评价视神经切断后RGCs存活率有效的方法。     

视神经损伤后JNK3、APP蛋白的表达变化对视网膜神经节细胞存活的影响

目的 探讨视神经损伤后小鼠视网膜神经节细胞 (RGCs) 中JNK3、APP蛋白的表达变化及其对RGCs存活的影响.方法 取成年APP野生型小鼠, 采用钳夹法建立视神经损伤模型, 应用免疫组织化学、Western blot法检测造模后视网膜神经节细胞中JNK3、APP蛋白的定位和定量表达变化, 比较损伤7 d后APP基因敲除组及其同窝野生型小鼠RGCs的存活数变化.结果 视神经损伤后, 视网膜神经节细胞中JNK3定位于细胞浆, p-JNK则从细胞浆进入到细胞核中表达, APP定位于细胞膜、p-APP在轴突及细胞浆中均表达.同时, Western结果表明上述4种蛋白表达量在损伤1 d组比假手术组均升高 (P<0.01) .与APP野生型小鼠视网膜神经节细胞存活数 (127.7±7.0) 相比, APP基因敲除组小鼠视网膜神经节细胞存活数 (147±7.0) 明显增多 (P<0.05) .结论 视神经损伤后, JNK3、APP蛋白的表达增多在视网膜神经节细胞的存活中发挥了一定的作用.     

银杏叶提取物对豚鼠视神经横断伤后视网膜神经节细胞结构及功能的保护作用

目的： 探讨腹腔注射银杏叶提取物（Ginkgo biboba extract,EGb 761）对豚鼠视神经横断伤后视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell, RGC）形态及功能的保护作用。 方法： 75只白化豚鼠随机等分为正常对照组、假手术组、模型组、生理盐水组和EGb 761组。分离暴露豚鼠的右眼视神经并于球后1.0 mm处进行横断造模,正常对照组不作任何处理,假手术组仅分离暴露视神经。生理盐水组和EGb 761组分别于实验开始前1周每日腹腔注射1次相应体积生理盐水和EGb 761（100 mg/kg）,术后继续给药4周。术后第4天,各组随机处死3只豚鼠,采用脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end-labeling, TUNEL）法检测RGC凋亡;分别于术后第14和28天进行图形视网膜电图（pattern electoretinogram, PERG）检查;摘取眼球作组织病理学检查并计数视网膜垂直经线RGC数目。 结果： 术后第4天,正常对照组、假手术组和EGb 761组均未见TUNEL阳性RGC,模型组和生理盐水组均见有TUNEL阳性RGC。术后第14和28天,模型组和生理盐水组RGC数目均少于正常对照组和假手术组（P〈0.05）,EGb 761组少于正常对照组和假手术组（P〈0.05）,但显著多于模型组和生理盐水组（P〈0.05）;术后第14和28天,EGb 761组PERG的N95振幅较模型组和生理盐水组高（P〈0.05）,与模型组和假手术组相近（P〉0.05）。RGC数目与N95振幅呈正相关（r=0.859, P=0.001 5）。 结论： 腹腔注射银杏叶提取物EGb 761能抑制豚鼠视神经横断后的RGC凋亡,对RGC的结构和功能具有保护作用。     

红参对糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞生长因子表达及神经节细胞凋亡的影响

目的:通过观察糖尿病(DM)大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡及血管内皮细胞生长因子(VEGF)在视网膜表达的变化.探讨红参对RGCs凋亡及VEGF表达的影响以及后两者之间的关系.方法:链脲佐菌素诱导实验性DM大鼠模型.造模成功的DM大鼠随机分为模型组(n=10)和治疗组(n=10),并与末造模的正常组大鼠进行比较.治疗组以红参粉末灌胃给药,1次/d.TUNEL法检测RGCs凋亡并计数RGCs凋亡数量.LSAB法检测VEGF在视网膜的表达.图像分析仪检测免疫组化的显色强度,定量分析.结果:与正常组相比,DM大鼠RGCs凋亡数量显著增加(P<0.01);与模型组相比,治疗组RGCs凋亡数量显著减少(P<0.05).与正常组相比,DM大鼠视网膜VEGF的表达增强:与模型组相比,LSAB法标记染色的VEGF在治疗组表达减弱.结论:红参能抑制DM大鼠视网膜VEGF的表达,减少DM大鼠RGCs的凋亡,DM大鼠RGCs凋亡数量与VEGF在视网膜表达呈正相关.