含hIL-24重组腺病毒载体(Ad-mda-7/hIL-24)的构建及其对喉癌细胞Hep2增殖的影响

目的构建含有人白细胞介素24(hIL-24)的腺病毒表达载体(Ad-mda-7/hIL-24),观察其对喉癌细胞Hep2增殖的影响。方法提取IL-24cDNA克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,采用pAdEasy系统进行细菌内同源重组得到含目的基因的腺病毒载体,脂质体转染293A细胞进行包装并扩增病毒。PCR和Western blot方法鉴定重组腺病毒,四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察其对Hep2增殖的影响。结果成功构建Ad-mda-7/hIL-24,滴度达107pfu/mL,MTT检测表明Ad-mda-7/hIL-24可明显抑制Hep2细胞生长。结论构建有较强感染能力的Ad-mda-7/hIL-24,并能显著抑制Hep2细胞增殖,为研究其作用机制及将其用于喉癌的基因治疗提供了实验和理论依据。     

靶向性抗肿瘤融合基因RGD-IL-24重组腺病毒的构建及鉴定

目的：构建靶向性抗肿瘤融合基因RGD-IL-24的重组腺病毒载体,转染乳腺癌MCF-7细胞观察其感染,并对其体外抗肿瘤效应和肿瘤靶向性进行初步研究。方法：利用PCR技术将GRGDS序列融合至IL-24的N端,克隆至pAdTrack-CMV质粒上。经PmeI线性化后与腺病毒骨架pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒载体pAdEasy/RGD-IL-24。重组腺病毒载体经PacI线性化后转染293细胞,包装出重组腺病毒Ad.RGD-IL-24。PCR方法鉴定重组腺病毒,TCID50测定病毒滴度,MTT法和形态学分析Ad.RGD-IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性,细胞黏附实验评价其肿瘤靶向性。结果：成功构建腺病毒载体,腺病毒滴度达1.3×109pfu/mL。Ad.RGD-IL-24诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡,显著抑制其生长,并具有肿瘤靶向性。结论：成功构建了有较强感染能力和肿瘤靶向性的重组RGD-IL-24腺病毒载体。     

重组携带hIL-10基因的腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建携带人白细胞介素10(hIL-10)基因的腺病毒载体,体外细胞学鉴定其介导的基因表达.方法 以pORF-hIL10质粒为模板,PCR扩增hIL-10基因,获得hIL10 cDNA片段,酶切并插入线性化pUC19质粒,命名为pUC19-hIL10.再酶切pUC19-hIL10,插入pDC315-EGFP,置换EGFP序列,构建pDC315-hIL10.将质粒pDC315-hIL10和pDC315-EGFP分别共转染至293细胞,产生复制缺陷型重组腺病毒.pDC315-hIL10和pDC315-EGFP分别感染大鼠肝细胞,免疫学方法鉴定目的基因的表达.结果 经PCR扩增、鉴定,证明已正确构建重组腺病毒Ad5-hIL10和Ad5-EGFP.pDC315-EGFP能够在大鼠肝细胞介导EGFP的表达,使细胞呈绿色荧光反应;pDC315-hIL10能够在大鼠肝细胞介导hIL-10的表达.结论 成功构建了重组腺病毒质粒Ad5-hIL10和Ad5-EGFP,可用于IL-10基因对肝细胞损伤的保护作用的进一步研究.     

多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定

目的构建多药耐药(multidrug resistance,MDR)基因-腺病毒重组表达载体。方法将MDR1基因插入到腺病毒载体,用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞,制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。结果构建的MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生,病毒滴度达109PFU/ml,此病毒感染靶细胞后,在靶细胞中有MDR1基因的表达。结论成功构建了MDR1-腺病毒重组表达载体。     

人SET基因重组腺病毒载体在小鼠颗粒细胞的表达

目的 以原代培养的小鼠卵巢颗粒细胞为模型,观察人SET基因重组腺病毒载体在卵巢颗粒细胞的感染效率和基因表达效果.方法 分离并培养小鼠颗粒细胞.扩增人SET基因重组腺病毒载体AdCMV-SET和对照重组腺病毒载体AdCMV,感染原代培养的小鼠颗粒细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)检测感染效率;qRT-PCR方法检测SET mRNA表达;Western blot方法检测SET蛋白的表达水平.结果 获得的重组腺病毒载体体外感染小鼠颗粒细胞,24 h观察到GFP表达.与AdCMV感染组相比,AdCMV-SET感染组SET mRNA表达水平显著增高(P＜0.05).与空白对照组(Mock)及感染AdCMV组相比,AdCMV-SET感染组SET蛋白水平显著增高(P＜0.05).结论 构建的人SET基因重组腺病毒载体能高效感染小鼠颗粒细胞、并有效表达,对细胞活率无影响.     

人血红素氧合酶-1重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建人血红素氧合酶-1(hHO-1)重组腺病毒,用以对供体器官的预处理。方法将人hHO-1cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pSGCMV,得到重组质粒pSGCMV-hHO-1。采用位点特异性重组系统(Cre/Loxp)将pSGCMV-hHO-1与腺病毒骨架载体pBHGloxP△E3通过lipofectamine2000共转染至293细胞,生成带有hHO-1基因的重组腺病毒载体Ad-hHO-1。重组腺病毒质粒在293细胞中扩增,CsCl梯度离心纯化。结果经酶切鉴定和测序证实载体构建的正确性,病毒滴度为2.0×1010pfu/ml。结论成功构建带有hHO-1cDNA的重组腺病毒,用以器官移植时缺血再灌注损伤的基因治疗。     

携带人肝细胞生长因子基因重组腺病毒的构建与制备

构建一种携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(AdHGF),并对其进行扩增、纯化与质量检测。首先构建携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒pXCJL1CMV/pAHGF,然后用LipofectAMIN介导该质粒和含有E1、E3区及包装信号区缺失的复制缺陷型5型腺病毒基因组的质粒GT4050共转染293细胞,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺病毒(AdHGF)。并以噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒,PCR法鉴定阳性重组腺病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,快速CPE分析、噬斑分析法测定病毒感染滴度(pfu/ml)。采用敏感细胞病变法检测有复制能力的腺病毒。结果成功构建了重组腺病毒AdHGF,制备的病毒纯度好、滴度高,其效价比小于1∶100,并且未检测到有复制能力的腺病毒存在。研究构建制备的重组腺病毒AdHGF具有潜在的实际应用价值。     

携带hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体构建

目的 探讨构建携带hIG-Ⅰ基因腺病毒载体的可行性.方法 从pcDNA 3.1-hIGF-Ⅰ质粒中克隆出hIGF-Ⅰ基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdshuttle-CMV,获得重组质粒pAdshuttle-CMV-hIGF-Ⅰ,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-IGF-Ⅰ.鉴定后,将pAdeasy-1-IGF-Ⅰ转染人胚肾细胞(Ad293细胞),获得含hIGF-Ⅰ基因的重组腺病毒(rAd-hIGF-Ⅰ).再鉴定后,Ad293细胞反复感染冻融扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度.将病毒颗粒感染绿猴肾成纤维细胞(COS-7细胞),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR分析hIGF-Ⅰ基因在mRNA水平的表达,Western blot分析hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达.结果 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,转染COS-7细胞后发现绿色荧光蛋白表达,同时RT-PCR扩增出318 bp的目的 条带,Western blot得到7.6kDa大小的同的蛋白,证明了腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ能成功转染COS-7细胞,hIGF-Ⅰ基因能在其中成功表达.结论 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,并且证实其能对COS-7细胞进行有效转染,为组织工程软骨的进一步改良提供了高效的基因载体.     

MMP-24基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建基质金属蛋白酶-24(matrix metalloproteinase-24,MMP-24)小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达质粒,以研究其对人卵巢浆液性囊腺癌细胞MMP-24基因表达的沉默效果,为探讨肿瘤的基因治疗奠定基础。方法:根据Gen-bank数据库提供的MMP-24基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)结构的DNA序列,克隆到空载体pIU6-B中,构建重组质粒,并进行酶切和PCR鉴定以及测序分析。结果:酶切和PCR鉴定以及测序证实重组质粒构建成功。结论:利用RNA干扰技术可成功构建siRNA表达载体,为进一步探索卵巢癌基因治疗奠定了基础。     

含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒,并在肺腺癌细胞A549中验证其复制能力和溶瘤特性。方法:建立重叠延伸PCR方法,用该方法制备的E1A-IRES片段插入AdEasy载体构建含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒rAdE1A-CDglyTK。并用该病毒与复制缺陷型重组腺病毒rAd-CDglyTK分别感染肿瘤细胞A549,从荧光蛋白表达、细胞病变及病毒增殖等方面进行比较,以确定其复制能力及溶瘤特性。结果:成功构建了含融合自杀基因CDglyTK的复制型重组腺病毒rAdE1A-CDglyTK,该病毒感染肿瘤细胞A549后报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达,能大量增殖并出现明显的细胞病变效应(CPE)。结论:构建的复制型重组腺病毒在肿瘤细胞内的复制能力、溶瘤特性和外源基因的表达明显优于目前广泛应用的复制缺陷型重组腺病毒。     

携带hIL-10基因的腺病毒对大鼠肝纤维化的影响

目的 探讨携带人白细胞介素10 (hIL-10)基因的腺病毒的抗炎和抗纤维化作用.方法 实验大鼠分为实验组(60只)和对照组(15只).实验组均分为3组,腹腔分别注射40％四氯化碳(CCl4)石蜡油溶液(CCl4组)、CCl4+EGFP (Ad-EGFP组)和CCl4+ hIL-10(Ad-hIL-10组).依据用药时间又分为治疗1周组、2周组、3周组和4周组.检测肝功能和肝纤维化4项指标,观察肝脏组织病理变化.采用免疫荧光双标记法和激光扫描共聚焦显微镜观察活化肝星状细胞(HSC)中hIL-10表达.结果 治疗1周组中,Ad-hIL-10组的TBil、ALT、AST降低和ALB增高比Ad-EGFP组和CCl4组明显(P＜0.05).Ad-hIL-10组的ALT、AST降低和TP、ALB升高程度:4周组＞3周组＞2周组＞1周组(P＜0.05).治疗4周组中,Ad-hIL-10组肝纤维化4项指标均低于CCl4组(P＜0.05).Ad-hIL-10组肝脏纤维化程度明显较CCl4组轻.肝脏HSC中的hIL-10表达与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达呈负相关(r=-0.812,P＜0.05).结论 携带hIL-10基因的腺病毒具有抗炎和抗纤维化的作用.其抗纤维化的机制可能与其抑制HSC的活化有关.     

以CpG为佐剂的人IL-24多克隆抗体的制备

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-24蛋白及人IL-24真核重组质粒免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-24多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-24在大肠杆菌中表达，纯化hIL-24重组蛋白，纯化后的蛋白经SDS—PAGE分析，同时提取hIL-24真核重组质粒，用以免疫新西兰兔，并以CpG为佐剂制备多克隆抗体。Western-blot鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。结果：人IL-24经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30％，纯化后的蛋白纯度高；原核表达的重组蛋白和真核重组质粒免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了抗血清效价达1：640的多克隆抗体。结论：原核表达的hIL-24蛋白和hIL-24真核重组质粒均能刺激家兔产生抗体．其多克隆抗体的效价较高。     

绿色荧光蛋白和胰岛素基因共表达重组腺病毒载体的构建及感染人脐带问充质干细胞的实验研究

目的构建同时表达绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）基因和人胰岛素（insulin,INS）基因的重组腺病毒载体pAdxsi．EGFP—INS,并感染人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemeels,hUCMSCs）,观察其表达及诱导hUCMSCs成脂分化的作用。方法用EcoRI／XhoI将胰岛索基因从原始质粒上切下,定向插入至pShuttle—CMV—EGFP穿梭质粒,将验证正确的pShuttle—CMV—EGFP—INS中的EGFP-INS片段转移至pAdxsi载体上,构建pAdxsi—EGFP—INS重组腺病毒载体,用PacI限制性内切酶线性化后转染人胚肾细胞系HEK293细胞,扩增纯化重组腺病毒,测定病毒滴度。原代培养hUCMSCs,分别用pAdxsi—EGFP—INS（感染组）及pAdxsi—EGFP（对照组）腺病毒感染hUCMSCs,观察荧光蛋白的表达情况,成脂诱导剂诱导分化,油红O染色观察胰岛素对hUCMSCs成脂的诱导作用。结果成功构建pAdxsi—EGFP．INS重组腺病毒载体,包装、纯化后获得滴度达4×10-11 pfu／ml的重组腺病毒。分离获得hUCMSCs并传代、纯化,pAdxsi-EGFP—INS感染hUCMSCs后,EGFP—INS在胞浆及胞核表达;成脂诱导培养18d后,感染组细胞呈现出含有大量小脂滴的脂肪样细胞,而对照组细胞含有少量较大的脂滴,感染组含脂滴的脂肪样细胞数量多于对照组。结论获得的pAdxsi—EGFP-INS重组腺病毒可高效感染hUCMSCs,为进一步研究胰岛素在干细胞成脂诱导分化中的作用,追踪其在体内、体外表达情况提供了新工具。     

顺铂联合人类白细胞介素-24基因对于宫颈癌Siha细胞增殖和侵袭力的影响

目的研究人类白细胞介素(hIL)-24基因联合顺铂对人宫颈癌Siha细胞的生长抑制作用以及hIL-24基因对Siha宫颈癌细胞侵袭、迁移能力的影响。方法构建重组质粒pDC316-hIL-24,使用脂质体携带pDC316-hIL-24质粒转染Siha细胞;聚合酶链反应(PCR)法检测hIL-24基因在宫颈癌细胞中的表达情况。Siha细胞在转染hIL-24基因后,添加不同剂量的顺铂,用CCK-8试剂检测hIL-24基因联合顺铂对Siha细胞增殖抑制效果;Transwell实验检测hIL-24基因对Siha细胞迁移侵袭能力的影响。结果重组质粒pDC316-hIL-24成功转染Siha宫颈癌细胞;hIL-24联合顺铂对Siha细胞的增殖抑制作用大于单独使用顺铂或hIL-24基因组(P<0.05);Transwell实验中,hIL-24干预组肿瘤细胞的穿膜细胞数最少(P<0.05)。结论 hIL-24基因的表达可增加Siha宫颈癌细胞对顺铂的敏感性;hIL-24基因可以明显抑制Siha宫颈癌细胞的迁移侵袭能力。     

人IL-24重组蛋白免疫刺激及血管形成抑制作用

目的 探讨人重组白细胞介素-24(rhIL-24)蛋白体外免疫刺激功能和血管形成抑制作用.方法 将原核稳定表达得到的rhIL-24蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC),ELISA检测其刺激免疫细胞分泌白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及γ-干扰素(IFN-γ)的活性;利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型观察rhIL-24蛋白抑制血管形成的效应.结果 rhIL-24蛋白孵育的PMBC在不同时段分泌的IL-6、TNF-α及IFN-γ浓度与阴性对照组相比存在显著差异;rhIL-24蛋白能明显抑制CAM二级和三级血管形成,与阴性组比较,差异极显著.结论 rhIL-24蛋白具有明显的免疫刺激功能和血管形成抑制作用.     

重组腺病毒表达载体pDC316/PEDF的构建

目的：构建色素上皮衍生因子（PEDF）基因腺病毒表达载体，为老年性黄斑变性基因治疗奠定基础。方法：从大鼠视网膜组织中提取总RNA，RT—PCR扩增PEDF基因eDNA，并将回收的PEDF基因克隆入质粒pGEM—Teasy载体中，亚克隆入腺病毒表达载体质粒pDC316中，并以DNA序列分析加以证实。结果：基因测序结果表明，所克隆的PEDF基因包含了大鼠PEDF基因阅读框内的全部序列，与NCBI Sequence Viewer中公布的大鼠PEDFmRNA序列（NM-177927）完全一致。结论：PEDF基因腺病毒表达载体的成功构建，为下一步体外包装成病毒颗粒研究基因治疗脉络膜新生血管奠定了基础。