利用siRNA沉默VEGF对膀胱癌生长的影响

目的研究VEGF特异性RNA干扰对膀胱癌细胞体内外增殖的影响。方法针对VEGF构建siRNA真核表达载体Psilencer^TM -VEGF-siRNA，并转染至膀胱癌细胞T24。RT-PCR观察VEGF的基因沉默效果；MTT比色分析检测细胞体外增殖能力；流式细胞计数检测细胞的凋亡。同时，通过裸鼠移植瘤模型观察VEGF基因沉默效果及对膀胱癌体内治疗的效果。结果转染siVEGF后膀胱癌细胞的VEG基因的表达显著被抑制（最高抑制率达79％）。与对照组比较，转染siVEGF组T24细胞的增殖活性明显低于转染阴性对照质粒组和空白对照组（P〈0．01）；流式细胞计数结果显示细胞发生凋亡。裸鼠体内致瘤实验显示，转染siVEGF组T24细胞在裸鼠体内增殖显著降低，肿瘤生长减慢。结论siVEGF能够有效的抑制膀胱癌中VEGF的表达，从而有效抑制膀胱癌细胞的生长。     

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤（MM）基因治疗的可行性。将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIRES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF，酶切、测序鉴定。用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266，G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR、Westernblot法分别检测阳性克隆中VEGFmRNA和蛋白的表达；利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化；利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成。结果表明：获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF；VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达，转染重组质粒的U266细胞VEGFmRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少，细胞的增殖受到抑制，凋亡增加。转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少。结论：VEGF反义RNA可以下调VEGF表达，从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖，增加其凋亡并抑制血管形成。     

siRNA下调VEGF基因沉默对人舌癌细胞株Tca8113的生物学作用

目的利用siRNA干扰技术特异性抑制人舌癌细胞株Tca8113的VEGF基因表达,旨在对口腔舌鳞状细胞癌抗血管生成的基因治疗提供理论依据。方法体外构建两对针对VEGF基因的siRNA重组质粒,利用脂质体转染法导入Tca8113细胞内,MTT法观察转染后的Tca8113细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率的改变,RT-PCR技术和western Blot法检测VEGF蛋白表达量。结果本研究设计的两个靶位点siRNA能有效抑制Tca8113细胞增殖,流式细胞术结果显示G0/G1期细胞阻滞,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,细胞凋亡率增高。VEGF基因蛋白表达率降低,与对照组相比,差异有统计学意义P0.01。结论体外构建siRNA可特异有效的下调VEGF基因蛋白表达。瞬时转染siRNA可不同程度的抑制Tca8113细胞增殖和诱导凋亡。为口腔舌鳞状细胞癌抗血管生成基因治疗提供理论依据。     

siRNA抑制人胶质瘤细胞MDM2的表达及细胞增殖

目的研究siRNA对人胶质瘤U251细胞MDM2基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法体外合成2对针对MDM2基因的siRNA,经脂质体转染导入U251细胞;用半定量RT-PCR检测siRNA MDM2对MDM2基因表达的抑制作用;并用MTT法检测siRNA MDM2对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染siRNA MDM2的细胞的MDM2基因表达分别下调到对照组的31.61%和40.18%;转染阴性对照质粒的MDM2基因没有明显改变。MTT结果表明转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,与对照组比差异具有显著性（P〈0.5）;同时细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,转染siRNA MDM2-1,2的凋亡率分别为49.9%和40.0%,转染阴性对照质粒和对照组未检测出明显的增殖抑制和凋亡改变。结论 siRNA MDM2可以有效抑制U251细胞株中MDM2的表达,并抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

UbcH10基因沉默对多发性骨髓瘤U-1996细胞增殖和凋亡的作用研究

目的采用脂质体法转染siRNA的方法沉默多发性骨髓瘤U-1996细胞中的UbcH10基因,研究基因沉默后U-1996细胞增殖活性及凋亡等生物学特性的变化情况。方法根据UbcH10基因信息,设计针对UbcH10基因编码序列(CDS)区的siRNA序列。通过脂质体法转染相关siRNA序列至多发性骨髓瘤U-1996细胞。在转染siRNA后48h,采用实时定量聚合酶链反应及蛋白免疫印迹法检测U-1996细胞中UbcH10基因的mRNA和其蛋白水平。选取未转染siRNA序列的空白组和转染阴性siRNA序列组作为试验对照,采用CCK-8法检测转染siRNA序列后24、48、72hU-1996细胞的增殖情况,采用流式细胞术检测48h后U-1996细胞的凋亡情况。结果通过脂质体法成功转染构建siRNA序列至U-1996细胞。转染后的U-1996细胞中UbcH10基因的mRNA及蛋白表达情况较转染前均明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。和对照组相比,沉默UbcH10基因后U-1996细胞的增殖活性下降,差异有统计学意义(P0.05),细胞凋亡率上升,差异也有统计学意义(P0.05)。结论干扰UbcH10基因表达可显著抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖活性并增加细胞凋亡。     

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr／abl融合基因的小干扰RNA(siRNA)，并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株，以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照；同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照，流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率；实时定量RT—PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白V(Annexin V)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70％；化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达；特异性siRNA可以抑制细胞增殖，转染24h细胞增殖抑制率达47％，48h达56％；特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15．05％．48h组为19．47％，与对照组(1．00％)比较明显提高。结论在细胞水平上，化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因的表达，为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。     

STAT3-siRNA诱导前列腺癌细胞凋亡机制的探讨

目的 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达诱导人前列腺癌细胞凋亡的机制。方法 针对人STAT3mRNA序列设计合成编码干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pSilencer 2.1-U6-STAT3-siRNA重组质粒,转染人前列腺癌细胞株PC3,采用Western blot、Northern blot观察STAT3基因表达抑制后Bcl-2,C-Myc与Cyclin D1表达的变化,并用流式细胞技术及吖啶橙染色方法观察细胞凋亡。结果成功构建pSilencer 2.1-U6-STAT3-siRNA重组质粒,并成功转染PC3细胞;Northern blot及Western blot结果 证实重组质粒在mRNA及蛋白水平均显著抑制STAT3基因表达,抑制率分别为60%及75%,并证实随着STAT3表达的抑制Bcl-2,C-Myc及Cyclin D1的表达明显下调。FCM及吖啶橙染色结果表明上述重组质粒可诱导PC3细胞凋亡。结论 STAT3-siRNA可抑制STAT3在人前列腺癌细胞的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。其机制与STAT3抑制Bcl-2,C-Myc及Cyclin D1表达有关。     

siRNA对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制

为了探索CML的治疗新思路研究了siRNA(small interfering RNA)对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制作用。制备特异性对应bcr-abl融合基因的siRNA，转染K562细胞株，采用RT-PCR法测定bcr-abl融合基因mRNA的表达。结果表明：siRNA对bcr-abl基因表达的抑制作用随浓度的增加而增强，0.2ug siRNA能使bcr-abl融合基因mRNA的表达在24和48小时分别降低至对照组的19.9％和26.6％，但72小时时恢复到原水平，同时转染siRNA后细胞生长受到抑制。结论：siRNA可以有效的抑制K562细胞株中bcr-abl融合基因的表达。     

短发夹RNA诱导survivin基因缄默对Jurkat细胞凋亡和增殖的影响

目的研究应用载体表达短发夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术抑制人 T 淋巴细胞白血病细胞株 Jurkat 细胞 survivin 基因的表达,探讨 survivin 基因表达缄默对 Jurkat 细胞凋亡和增殖的影响。方法构建针对 survivin 基因的 shRNA 重组质粒并转染至 Jurkat 细胞,分别用多重 PCR和 Western blot 法检测瞬时转染和稳定转染细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白表达水平的变化;流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞凋亡指数的变化,绘制细胞生长曲线,探讨 survivin shRNA 转染对细胞生长和增殖的影响。结果多重 PCR 结果示与无功能(对照组)shRNA 处理组和磷酸盐缓冲液处理组比较,survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞 surivivin 基因 mRNA 表达均显著下降,抑制率分别为66.675% 和60.69%(P<0.05);Western blot 结果显示 survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞survivin 蛋白表达水平亦显著降低,抑制率分别为63.41% 和60.18%(P<0.05)。流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞的凋亡率显著增加,分别为(22.41±2.83)% 和(20.73±2.56)%(与对照组比较,P均<0.05),细胞倍增时间显著延长。生长曲线显示稳定转染细胞的生长显著减慢。结论shRNA 重组质粒介导的 RNA 干扰能明显抑制 Jurkat 细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白产物的表达,诱导细胞凋亡和生长抑制。     

siRNA抑制人肝癌细胞MDM2表达及细胞增殖的研究

目的探讨siRNA对人肝癌HepG2细胞MDM2基因表达的抑制作用及对增殖的影响。方法体外合成针对MDM2基因的siRNA质粒,转染HepG2细胞株;应用RT-PCR和western blot方法检测siRNA对MDM2和P53基因和蛋白表达的影响,并用MTT法检测siRNA对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期。结果和空白组比转染siMDM2-1,2的HepG2细胞的MDM2基因和蛋白表达减低,而P53基因和蛋白表达增加。阴性对照质粒组的基因表达未见明显改变。转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,转染siMDM2-1,2和阴性对照质粒后的抑制率分别是46.3%、56.1%和3%。和对照组比较,转染siMDM2-1,2的hepG2细胞的细胞周期发生明显改变,而转染对照质粒的hepG细胞周期未发生明显变化。结论 siRNA MDM2可以有效抑制HepG2细胞株中MDM2的表达,促进P53的表达,同时可以使细胞周期发生变化,这可能是其抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一。     

导入针对survivin基因的siRNA对大肠癌Lovo细胞凋亡和增殖的影响

目的：向大肠癌离体LOVO细胞中导入针对survivin基因的siRNA，并研究其对LOVO细胞凋亡的影响。方法：设计2条特异性针对survivin基因的siRNA，并体外转录法合成，利用脂质体导入LOVO细胞并检测转染后细胞的凋亡和增殖情况。结果：RTPCR检测survivin mRNA表达水平发现两RNA干扰组细胞内survivin mRNA表达量明显低于正常LOVO细胞；细胞凋亡检测结果发现两干扰组细胞凋亡率分别为21、5％和26、28％明显高于正常Lovo细胞；细胞增殖结果显示：两干扰组细胞增殖能力比正常Lovo细胞减弱。结论：针对survivin基因的siRNA能有效降低目的基因的mRNA表达，抑制LOVO细胞生长，细胞凋亡率明显增高。为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据。     

人端粒酶逆转录酶基因沉默对肺腺癌细胞侵袭、增殖、凋亡的影响

目的:探讨靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(siRNA)转染对肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响。方法:构建靶向hTERT的siRNA表达质粒转染A549细胞,通过Western blot检测蛋白的表达水平,确定有效后,通过Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定转染后肿瘤细胞的细胞周期和凋亡率。结果:成功构建靶向hTERT的siRNA表达质粒。实验组siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱(P<0.01),生长抑制率明显高于阴性对照组(P<0.01),且表现出时间依赖性。流式细胞术测定显示,实验组siRNA转染48h后,肿瘤细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论:靶向hTERT的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导细胞凋亡的发生。     

siRNA抑制Wnt-1基因对人肺腺癌细胞株A2的影响

目的：研究siRNA对人肺腺癌细胞株A2中Wnt-1基因表达对细胞生物学行为的影响。方法：将siRNA用脂质体转染A2细胞,RT-PCR测定Wnt-1 mRNA表达变化;Western blotting测定Wnt-1蛋白表达的变化;流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响。结果：与对照组相比,传染siRNA后,实验组靶基因mRNA表达和蛋白表达均有明显降低,细胞凋亡增加。结论：Wnt-1特异性siRNA能有效干扰A2细胞内其相应基因的表达,而靶基因表达受到抑制后细胞凋亡增加。     

小干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的影响

目的构建Survivin基因特异性小干扰RNA(siRNA),检测siRNA-Survivin对Survivin基因表达的抑制,在人肝癌细胞株HepG2中研究survivin和survivin siRNA对细胞凋亡的影响。方法设计survivin siRNA序列,构建靶向Survivin siRNA真核载体。利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,通过相差显微镜下观察、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察转染后survivin的表达,以及HepG2细胞的凋亡。结果成功构建了survivin siRNA表达载体,并且si-survivin对survivin有明显抑制效应,可显著抑制HepG2细胞的发生凋亡。转染Survivin-siRNA细胞活性受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,DNA电泳出现典型的凋亡"梯状"带。RT-PCR结果显示细胞转染24 h、48 h和72 h后HepG2 Survivin mRNA分别减少了56%、78%和50%,而siR-NA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论转染的Survivin-siRNA可特异性抑制肝癌细胞株HepG2凋亡抑制基因的表达,从而为肿瘤的基因治疗提供新的实验基础。     

端粒酶活性与膀胱癌T24细胞生长

目的 :研究端粒酶逆转录酶基因 (h TERT)反义寡核苷酸 (ASODN)对膀胱癌 T2 4细胞生长的影响。方法 :用脂质体介导技术 ,将 h TERT基因 ASODN转染入膀胱癌 T2 4细胞中应用端粒酶 PCR- EL ISA法检测端粒酶活性变化 ,MTT法测定细胞生长变化 ,并用流式细胞术观察其对 T2 4细胞周期的影响。结果 :h TERT基因 ASODN能显著地抑膀胱癌 T2 4细胞端粒酶活性 ,癌细胞生长增殖受限 ,同时抑制具有序列特异性和剂量依赖性 ,并出现细胞凋亡现象 ,其凋亡率 (15 .8% )明显高于 SODN转染组 (0 )和空白对照组 (1.9% ,P<0 .0 5 )。结论 :h TERT基因 ASODN能特异性抑制膀胱癌 T2 4细胞端粒酶活性和生长 ,促进其细胞凋亡。     

一定浓度下三氧化二砷对T细胞淋巴瘤Hut-78细胞株增殖的影响

背景：近年来有将三氧化二砷试用于T细胞肿瘤的有效报道,但未见其治疗机制的相关研究。目的：检测三氧化二砷对人皮肤T细胞淋巴瘤Hut-78细胞的抑制增殖、诱导凋亡及细胞周期的影响。方法：分别采用MTT、PI单标记流式细胞术和TUNEL法检测2,5,10μmol/L的三氧化二砷干预24,48,72h,对人皮肤T细胞淋巴瘤Hut-78细胞株抑制增殖、诱导凋亡和细胞周期的影响,及其凋亡相关基因bcl-2及血管内皮细胞生长因子基因表达的变化。结果与结论：在一定的浓度范围内,三氧化二砷对Hut-78细胞存在增殖抑制作用,其增殖抑制作用在一定程度上可能与下调血管内皮细胞生长因子基因的表达有关,同时还存在一定的细胞毒作用;三氧化二砷可诱导Hut-78细胞发生凋亡,凋亡机制主要发生在G2～M期,其凋亡作用可能与下调bcl-2基因表达有关。三氧化二砷对Hut-78细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用呈时间剂量依赖性。     

利用siRNA靶向沉默Jeko-1细胞survivin mRNA基因的实验研究

本研究旨在探讨Survivin基因在淋巴瘤细胞中的生物学作用,为将来以Survivin为靶点治疗套细胞淋巴瘤提供实验室证据。体外化学合成针对survivin mRNA基因的siRNA片段,通过DMRIE-C转染Jeko-1细胞,以无关siRNA、未转染的细胞为对照,采用RT-PCR和Western blot方法检测siRNA的抑制效果,利用流式细胞术检测细胞的凋亡率,用CCK-8法检测转染24、48、72 h对细胞增殖的影响。结果表明,与未转染的空白组相比,siRNA转染Jeko-1细胞后24、48、72 h survivin mRNA的相对表达量分别为0.49±0.03、0.38±0.02和0.17±0.02;细胞增殖抑制率分别为(31.2±2.1)%、(43.3±3.4)%和(52.6±2.5)%;细胞凋亡率分别为(6.3±0.5)%、(13.5±1.1)%和(23.6±1.6)%;survivin蛋白表达水平逐步减低。结论:靶向survivin的siRNA能在体外特异性下调目的基因survivin mRNA和蛋白的表达,表现出抑制Jeko-1细胞增殖和促使其凋亡的生物学效应,survivin基因有望成为淋巴瘤治疗的一个药物靶点。     

沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病KG-1细胞凋亡的影响

摘要本研究旨在探讨沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病细胞株KG-1增殖和凋亡的影响。将SUV39HIsiRNA经Lipofectamine…2000转染至KG-1细胞,应用MTS法检测细胞增殖率,观察sUV39111siRNA对KG-1细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞凋亡;Westernblot检测SUV39H1siRNA作用后P15和凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达。结果表明,沉默SUV39H1基因可抑制细胞增殖,SUV39H1siRNA浓度为30、60、120、240nmol／L作用48h后,KG-1细胞的增殖率分别为（76．43±1．98）％、（51．31±1．84）％、（37．31±1．61）％、（18．94±3．22）％,差异具有统计学显著意义（P〈0．05）;SUV39HIsiRNA可上调P15基因的表达;SUV39H1siRNA可诱导细胞凋亡,30、60、120nmoL／LSUV39H1siRNA作用48h后,KG-1细胞凋亡率分别为（40．2±5．1）％、（56．8±4．8）％、（71．6±5．6）％,差异有统计学显著意义（P〈0．05）;抗凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达减少。结论：SUV39H1siRNA能抑制KG-1细胞的增殖并诱导其凋亡,有望成为白血病治疗的-个新的靶点。