siRNA抑制人胶质瘤细胞MDM2的表达及细胞增殖

目的研究siRNA对人胶质瘤U251细胞MDM2基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法体外合成2对针对MDM2基因的siRNA,经脂质体转染导入U251细胞;用半定量RT-PCR检测siRNA MDM2对MDM2基因表达的抑制作用;并用MTT法检测siRNA MDM2对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染siRNA MDM2的细胞的MDM2基因表达分别下调到对照组的31.61%和40.18%;转染阴性对照质粒的MDM2基因没有明显改变。MTT结果表明转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,与对照组比差异具有显著性（P〈0.5）;同时细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,转染siRNA MDM2-1,2的凋亡率分别为49.9%和40.0%,转染阴性对照质粒和对照组未检测出明显的增殖抑制和凋亡改变。结论 siRNA MDM2可以有效抑制U251细胞株中MDM2的表达,并抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

利用siRNA沉默VEGF对膀胱癌生长的影响

目的研究VEGF特异性RNA干扰对膀胱癌细胞体内外增殖的影响。方法针对VEGF构建siRNA真核表达载体Psilencer^TM -VEGF-siRNA，并转染至膀胱癌细胞T24。RT-PCR观察VEGF的基因沉默效果；MTT比色分析检测细胞体外增殖能力；流式细胞计数检测细胞的凋亡。同时，通过裸鼠移植瘤模型观察VEGF基因沉默效果及对膀胱癌体内治疗的效果。结果转染siVEGF后膀胱癌细胞的VEG基因的表达显著被抑制（最高抑制率达79％）。与对照组比较，转染siVEGF组T24细胞的增殖活性明显低于转染阴性对照质粒组和空白对照组（P〈0．01）；流式细胞计数结果显示细胞发生凋亡。裸鼠体内致瘤实验显示，转染siVEGF组T24细胞在裸鼠体内增殖显著降低，肿瘤生长减慢。结论siVEGF能够有效的抑制膀胱癌中VEGF的表达，从而有效抑制膀胱癌细胞的生长。     

实时荧光定量RT-PCR检测siRNA表达载体抑制人肾癌786-0细胞G250 mRNA的表达

目的评价实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测小干扰RNA（siRNA）表达载体抑制人肾癌786-0细胞G250 mRNA表达的可靠性,以建立稳定的RNAi技术。方法体外合成四条针对G250基因的siRNA,并设计阴性对照和空白对照,转染肾癌786-0细胞株;根据G250 mRNA的序列设计特异性引物,荧光染料SYBR Green Ⅰ法定量RT-PCR测定G250 mRNA的表达情况。结果四条siRNA分别使G250 mRNA表达量降低了35.56%、49.27%、45.88%、65.13%,阴性对照和空白对照组无明显变化。结论实时荧光定量RT-PCR技术可以准确地检测mRNA的表达,可以用来评价siRNA的有效性。     

肿瘤转移抑制基因nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞株的转染及表达

目的:探讨nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞株的转染及表达.方法:采用已经通过基因工程技术构建的nm23-H1基因的真核表达载体,利用电穿孔基因转染技术将nm23-H1基因导入人膀胱癌T-24细胞,利用G418筛选、免疫组织化学、流式细胞方法检测nm23-H1基因的转录和表达情况.结果:以电穿孔转染技术将nm23-H1基因转染T-24细胞后,经400ml/L的G418筛选后可形成抗性克隆;免疫组织化学和流式细胞结果显示转基因细胞中有nm23-H1蛋白的阳性高表达.结论:nm23-H1基因可被成功转染入人膀胱癌T-24细胞并能有效表达.     

RNA干扰体外抑制肝癌细胞端粒逆转酶基因表达的研究

目的 利用小片段干扰RNA(siRNA)在肝癌细胞内诱导RNA干扰(RNAi)，抑制端粒逆转录酶(hTERT)基因表达，在体外进行RNAi对肝癌治疗的试验研究。方法 构建针对hTERT基因的siRNA(siRNA-hTERT)，转导入肝癌细胞7721，在瘤细胞内诱导RNAi，采用流式细胞分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、免疫组化等技术检测siRNA处理前后细胞增殖及hTERT基因表达变化。结果 siRNA-hTERT对肝癌细胞生长抑制率达37．5％；细胞周期中S期细胞明显减少，G1／G0期细胞显著增加；hTERT基因的mRNA表达由99．4％下调到53．1％，其蛋白表达由86．3％下调到46．6％。结论 RNAi在体外明显抑制了肝癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

紫草素对人绒癌耐药细胞株增殖的抑制及凋亡的作用

目的 研究紫草素对体外培养的人绒癌耐药细胞株(JAR/MTX)抑制增殖、促进凋亡及诱导细胞周期停滞的作用.方法 经不同浓度的紫草素分别作用24 h、48 h、72 h后,应用cck-8试剂盒检测其细胞毒性,应用流式细胞仪分析细胞周期分布及凋亡率变化,应用荧光显微镜观察凋亡现象.结果 当紫草素浓度从0.1875 μg/ml增加到3μg/ml时,其48h抑制率从46.48±12.0%升高到92.05±9.2%,0.75μg/ml紫草素分别作用24 h、48 h、72 h,其抑制率分别为43.94±10.1%、68.56±10.2%、84.97 ±18.63%,与对照组相比差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01),可见随着紫草素剂量的增加和作用时间的延长,对绒癌耐药细胞生长的抑制率也明显增加.当紫草素浓度从0.1875 μg/ml增加到3μg/ml时,与细胞作用48h后,凋亡率由12.13±5.67%升高到30.08±7.85%(P＜0.05或P＜0.01),随着药物浓度增加凋亡率亦增加,并可见典型的凋亡细胞核形态学变化.细胞周期分布也呈浓度依赖性改变,一方面增高C,0/G1期细胞比例(P＜0.05),另一方面降低S期和G2/M期细胞比例(P＜0.05).结论 紫草素对JAR/MTX具有明确的抗增殖、促凋亡、阻滞细胞周期进程的作用,值得进一步深入研究与探讨.     

肝癌细胞株SMMC-7721中CD147和MMP-9的表达及意义

目的研究肝癌细胞系SMMC-7721中CD147与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达及意义。方法用流式细胞仪检测正常肝细胞L-02与肝癌细胞SMMC-7221中CD147的表达；用免疫组化法检测两种细胞产生的MMP-9的表达。结果正常肝细胞L-02中CD147表达阴性，SMMC-7721中CD147表达呈强阳性（阳性率为98．1％）；MMP-9在正常肝细胞及肝癌细胞中均有表达，但在肝癌细胞中表达明显增高。结论肝癌细胞系SMMC-7721中CD147与MMP-9表达明显增高，与肝癌的侵袭转移潜能有关。     

人骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞增殖影响的体外实验

背景:许多报道指出骨髓间充质干细胞具有免疫调节作用,可治疗自身免疫性疾病.目的:体外观察人骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞增殖的影响.设计、时间及地点:对照观察性实验,于2007-01/10在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成.材料:来源于29例重型及慢性再生障碍性贫血患者的外周血.方法:取再生障碍件贫血患者骨髓血及外周血,采用percoll上密度梯度离心分离骨髓间充质干细胞,用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞,用含体积分数为0.20胎牛血清的RPMI1640培养基悬浮,将细胞悬液加入尼龙棉柱内,平置于37℃温箱中孵育1 h,用预温至37℃的上述培养液冲洗出非黏附细胞即为T淋巴细胞,洗涤后重悬于培养基中备用.将骨髓间充质干细胞以1×103/孔,1×104/孔加入到植物血凝素刺激的再生障碍性贫血患者T淋巴细胞增殖体系中,以单独培养的再生障碍性贫血患者T淋巴细胞为对照.主要观察指标:MTT还原法测定再生障碍性贫血患者T淋巴细胞的增殖.结果:与对照组比较,当骨髓间充质干细胞为1×104/孔时,对再生障碍性贫血患者T淋巴细胞增殖表达的抑制率为(42.1±11.2)%,差异有显著性意义(P<0.01),当骨髓间充质干细胞为1×103/孔时,抑制率为(9.2±3.5)%,差异无显著性意义.结论:自体骨髓间充质干细胞可抑制再生障碍性贫血患者T细胞的增殖,且这种抑制作用具有数量依赖性.     

脂肪组织释放细胞因子脂联素的球状结构域对人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长抑制及诱导凋亡的效应

目的：脂联素作为一种脂肪组织释放的细胞因子,具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化等生物学功能,脂联素球状结构域（gapM1）为其重要的功能结构域。最近研究发现,脂联素对恶性肿瘤细胞有一定的抑制作用。实验拟进一步讨论gapM1对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长抑制作用及诱导凋亡作用。方法：实验于2005-03/2006-03在复旦大学上海医学院病理实验室完成。①实验材料：gapM1购自R＆D公司。②实验过程：选用人乳腺癌MDA-MB-231细胞进行体外培养,不同剂量的gapM1（0,0.5,2,8mg/L）处理细胞48h后,显微镜进行形态学观察。③评估：采用BrdU掺入法检测细胞增殖情况;采用TdT介导的dUTP末端标记法原位观察癌细胞凋亡,并计算平均凋亡指数;流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率。结果：①倒置显微镜观察结果：不同剂量的gapM1作用MDA-MB-231细胞后,未见明显的细胞形态学改变,但细胞收缩、脱落,细胞增殖明显受到抑制,且随浓度的增大,细胞数量减少。②BrdU掺入法检测结果：不同剂量的gapM1对细胞生长均有一定的抑制作用,且同一处理时相点各组间比较差异均有显著性（P〈0.05）。③TUNEL法检测结果：不同剂量的gapM1作用于MDA-MB-231细胞48h,0.5,2,8mg/L组细胞的凋亡率高于0mg/L组（P〈0.05）。④流式细胞仪分析结果：gapM1作用MDA-MB-231细胞48h,G0～G1期细胞增多,S期细胞显著减少,细胞周期分布特点与药物浓度有关,随浓度增大,变化更加明显。同时可观察到细胞凋亡峰,细胞凋亡率也呈剂量依赖趋势。结论：gapM1对人乳腺癌MDA-MB-231细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。     

人脐血间充质干细胞培养及对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响

目的:研究发现间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,体外能够抑制混合淋巴细胞培养或有丝分裂原刺激中的T淋巴细胞增殖.实验观察体外分离培养的脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的抑制效果.方法:实验于2004-10/2006-06在解放军兰州军区兰州总医院完成.①对象:足月正常分娩产妇脐血及健康志愿者外周血分别由解放军兰州军区兰州总医院妇产科、血液科提供,产妇与志愿者对实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:Percoll法分离脐血单个核细胞,贴壁纯化,达80%～90%融合时胰蛋白酶消化,按2.0×108L-1密度传代,取第4-5代细胞用于实验.密度梯度法分离外周血单个核细胞,以含体积分数为0.2胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×109 L-1时加入尼龙棉柱内,用培养基冲出非黏附细胞即为T淋巴细胞.脐血间充质干细胞分为2×108,1×108,0.5×108 L-1组,各100 μL接种于96孔培养板,加入2×108 L-1 T淋巴细胞悬液100 μL,再给予植物血凝素刺激T淋巴细胞转化.以T淋巴细胞 植物血凝素为阳性对照.③实验评估:观察体外培养的脐血间充质干细胞形态,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达.MTT法测定脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响.结果:①形态特征与表面抗原表达:原代培养10～18 d形成平行排列、辐射状或旋涡状的成纤维样细胞,即为脐血源性的间充质干细胞,传代7 d左右细胞达90%融合.流式细胞仪检测90%细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD13,CD29,CD44,CD166,不表达造血细胞系的表面抗原CD34,CD45.②脐血间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的抑制:与阳性对照比较,经脐血间充质干细胞共培养后植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用受到抑制,增殖指数明显降低(P＜0.01).间充质干细胞与T淋巴细胞比值为1:1,1:2和1:4时的增殖抑制率分别为(48.16±2.31)%,(34.47±3.09)%,(22.15±2.63)%.结论:脐血间充质干细胞可显著抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,该抑制作用呈剂量依赖性.     

血小板源性生长因子-DD通过Akt信号通路促进膀胱癌T24细胞增殖

目的研究外源性血小板源性生长因子-DD(PDGF-DD)对膀胱癌T24细胞增殖及Akt信号转导通路的影响,阐述factor其诱导细胞增殖的机制。方法外源性PDGF-DD蛋白作用T24细胞,采用MTT法分析细胞的增殖;流失细胞仪检测细胞周期的变化;Western blot法观测膀胱癌T24细胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR以及核因子NF-κB蛋白表达的变化。结果 PDGF-DD促进T24细胞的增殖,并且具有浓度依赖性;DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例下降,合成期(S期)细胞比例上升;Akt、mTOR表达变化不明显,而p-Akt、p-mTOR及NF-κB p65的表达均上调。LY294002抑制PI3K/Akt及其下游靶位蛋白磷酸化;雷帕霉素和PDTC分别抑制p-mTOR和NF-κBp65的表达。结论外源性PDGF-DD刺激T24细胞的增殖,其机制可能是通过Akt/mTOR和Akt/NF-κB两条独立的信号通路实现的。     

羟基喜树碱诱导膀胱癌T24细胞凋亡的研究

目的探讨羟基喜树碱（HCPT）诱导膀胱癌T24细胞凋亡与氧化应激的关系。方法体外培养人膀胱癌T24细胞,以0.10～100.00 mg/L的羟基喜树碱处理6～48 h后,MTT法测定细胞抑制率,得出HCPT的IC50和最佳作用时间,DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。HCPT 10.00 mg/L作用细胞24 h后,采用生物化学方法检测SOD、MDA、LDH、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）、活性氧以及谷胱甘肽（glutathione,GSH）与谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）的水平并与正常值对照,分析HCPT对T24细胞氧化与抗氧化系统的影响。结果0.10～100.00 mg/L的HCPT均能抑制T24细胞增殖并诱导调亡,其作用具有时间及浓度依赖性。细胞生化指标分析HCPT明显提高了培养上清液LDH的活力,降低了细胞内LDH的活力;细胞内SOD、T-AOC、GSH及GR的水平明显减少（P〈0.05）,MDA、活性氧的水平显著升高（P〈0.05）。结论通过诱导激活氧化应激致使凋亡抑制细胞增殖可能是HCPT抗肿瘤作用机制之一。     

siRNA抑制人肝癌细胞MDM2表达及细胞增殖的研究

目的探讨siRNA对人肝癌HepG2细胞MDM2基因表达的抑制作用及对增殖的影响。方法体外合成针对MDM2基因的siRNA质粒,转染HepG2细胞株;应用RT-PCR和western blot方法检测siRNA对MDM2和P53基因和蛋白表达的影响,并用MTT法检测siRNA对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期。结果和空白组比转染siMDM2-1,2的HepG2细胞的MDM2基因和蛋白表达减低,而P53基因和蛋白表达增加。阴性对照质粒组的基因表达未见明显改变。转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,转染siMDM2-1,2和阴性对照质粒后的抑制率分别是46.3%、56.1%和3%。和对照组比较,转染siMDM2-1,2的hepG2细胞的细胞周期发生明显改变,而转染对照质粒的hepG细胞周期未发生明显变化。结论 siRNA MDM2可以有效抑制HepG2细胞株中MDM2的表达,促进P53的表达,同时可以使细胞周期发生变化,这可能是其抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一。     

消化道肿瘤局部和其他部位调节性T细胞表面标志表达的差异

目的探讨调节性T细胞（Treg）在消化道肿瘤局部与其他部位的表面标志差异性。方法采用四色流式细胞术检测消化道肿瘤患者外周血、腹水、肿瘤组织、癌旁淋巴结、正常组织、健康对照外周血Treg细胞。结果消化道肿瘤患者外周血中Treg细胞显著高于健康对照（P〈0．05）,且腹水、肿瘤组织、癌旁淋巴结中存在高水平Treg细胞。消化道肿瘤患者外周血和腹水中CD25高表达与又状头／翅状螺旋转录因子（Foxp3）显著相关,肿瘤局部CD25^＋与Foxp3显著相关。结论Treg细胞在消化道肿瘤局部与外周的表面标志存在差异,此结果为选取Treg膜标记分析Treg打下基础。     

下调PAI对HpG2细胞VEGF表达的影响

目的 探讨PAI的发卡样siRNA真核表达载体PAI siRNA对人肝癌HpG2细胞VEGF表达的影响.方法 设计短发夹状PAI siRNA的寡核苷酸链,将其插入到真核细胞表达载体pSilencerTM 2.1-U6 neo载体中,构建的重组载体后;采用脂质体转染方法将构建的重组载体导人人肝癌细胞HpG2中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、western blot法分别检测转染细胞PAI mRNA和蛋白的表达变化以及对VEGF表达的影响.结果 经测序证明PAI siRNA序列正确;转染PAI siRNA载体后,HpG2细胞PAI mRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P＜0.01).转染后,细胞中PAI含量降低,V EGF的表达也减少.结论 测序结果表明发卡样的PAI siRNA真核表达载体构建成功,转染HpG2细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭PAI的表达,PAI siRNA能有效阻断PAI的蛋白合成,同时抑制细胞中V EGF的表达.     

子宫颈癌中血管内皮细胞生长因子的表达和微血管密度的临床意义

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)与子宫颈癌的关系。方法本研究采用S-P免疫组化学法,检测子宫颈癌中VEGF的表达情况和微血管密度。利用Ⅷ因子相关抗原标记血管内皮细胞,检测宫颈癌中微血管的表达。结果VEGF在正常宫颈组织中无表达,在子宫颈癌中表达增高,差异显著(P<0.05);且在子宫颈癌中VEGF的阳性表达率及表达强度随细胞组织学分级增高而增高,低分化组高于高分化组;临床分期Ⅲ、Ⅳ期组的VEGF表达较Ⅰ、Ⅱ期组有更高趋势,但无显著差异(0.05相似文献   

靶向VEGF基因的siRNA联合树突状细胞介导的CTL对MCF-7细胞作用的研究

目的探讨靶向血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的小干扰RNA(siRNA)联合负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)致敏的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的联合抗瘤作用。方法体外应用靶向VEGF基因最佳转染浓度(100nmol/L,增加浓度不再提高沉默作用)的siRNA联合负载人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)抗原的DC介导的CTL(siRNAVEGF+CTL组)共同作用于MCF-7细胞,同时设立空白对照组和空白+CTL组(只加无血清无抗生素培养基);脂质体组和脂质体+CTL组(只加LipofectamineTM2000);siRNAVEGF-组(100nmol/LsiRNA);siRNASCR组和siR-NASCR+CTL组(100nmol/LsiRNASCR),每组做6个平行孔,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测siRNAVEGF+CTL组和各对照组肿瘤杀伤活性(n=6),Hoechst33258核染色观察细胞的凋亡(n=3)。结果siRNAVEGF+CTL组、siR-NAVEGF-组siRNASCRCTL组肿瘤杀伤活性分别为99.37%,51.17%和43.94%,siRNAVEGF+CTL组与对照组比较可明显杀伤肿瘤细胞,瘤细胞几乎完全溶解,Hoechst33258显示细胞核呈明显的细胞凋亡改变。结论体外实验显示靶向VEGF的siRNA联合负载肿瘤抗原DC致敏的CTL能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长,二者的联合应用抗瘤效果显著。     

新霉素对脑胶质瘤细胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表达的影响

目的：探讨新霉素对脑胶质瘤细胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表达的影响。方法采用人脑胶质瘤细胞U251,DMEM培养基添加10％胎牛血清培养。MTT细胞活性实验检测细胞增殖,RealTimePCR检测mR-NA表达情况,酶联免疫吸附实验检测蛋白表达。结果MTT结果表明,新霉素对U251细胞增殖存在抑制作用,并以剂量依赖的方式进行,并发现新霉素的抑制作用随时间增强。RealTimePCR结果显示,新霉素作用后U251细胞中PDGF、VEGF和血管生成素mRNA的表达都受到不同程度的抑制,分别降低了26．75％、38．23％和43．87％。ELISA分析表明新霉素能够降低PDGF、VEGF和血管生成素蛋白水平的表达。结论新霉素能够抑制脑胶质瘤细胞U251中PDGF、VEGF和血管生成素的表达并抑制脑胶质瘤细胞增殖。     

稳定高表达microRNA-218膀胱癌T24细胞系建立

目的建立稳定高表达microRNA-218膀胱癌T24细胞系。方法构建pHBLV-U6-ZsGreen-Puro质粒,制备慢转录病毒载体pHBLV-U6-ZsGreen-Puro-miR-218和pHBLV-U6-ZsGreenPuro-vector转染膀胱癌T24细胞系,用嘌呤霉素筛选并荧光显微镜和qRT-PCR检测。结果转染的细胞在荧光显微镜下呈现出绿色荧光,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)显示实验组细胞microRNA-218表达水平比对照组升高250倍。结论该实验成功建立了稳定高表达MicroRNA-218膀胱癌T24细胞系,为进一步研究microRNA-218在膀胱癌中的功能奠定了基础。