ECG、EGCG对两株耐药肿瘤细胞的细胞毒增敏作用研究

目的：研究两种儿茶素成分ECG、EGCG是否对人耐药肝癌细胞BEL-7404／Adr和耐药口腔癌细胞KBV200存在细胞毒增敏作用及可能的机制方法：用MTT法检测药物对体外培养的细胞的毒性作用，用RT-PCR法检测MDR；表达，流式细胞仪测定P-gp表达及细胞内Rh-123含量。结果：两种儿茶素成分在100μgml-1以下剂量对两株耐药肿瘤细胞的抑制率均小于10％，60μgml-1ECG或14μgml-1EGCG联合0．8μgml-1ADM或0．12μgml-1VCR时MDR1下降23．9％～38．6％，两种儿茶素成分与抗肿瘤药物联合应用可使P-gp表达下降，能明显提高细胞内Rh-123的含量结论：儿茶素成分ECG、EGCG与ADM或VCR联合应用可增强耐药肿瘤细胞BEL-7404／Adr和耐药口腔癌细胞KBV200的细胞毒作用，其机制可能与降低MDR1-mRNA表达、下调P-gp表达及抑制P-gP的功能有关。     

EGCG对两株耐药肿瘤细胞的细胞毒增敏作用及抑瘤作用研究

目的:研究EGCG对人耐药肝癌细胞BEL7404/Adr和耐药口腔癌细胞KBV200的细胞毒增敏作用及对裸鼠移植瘤的抑瘤作用。方法:MTT法检测药物对体外培养细胞的毒性作用,采用BEL7404/ADR或KBV200细胞种植于裸鼠皮下,建立耐药肿瘤模型,观察用药后对裸鼠体重、抑瘤率、病理改变以及RTPCR和免疫组化法分别检测瘤组织mdr1和P糖蛋白的表达。结果:EGCG在100mg/L以下剂量对两株耐药肿瘤细胞的抑制率均小于10%,EGCG与抗肿瘤药物联合应用可明显提高抗肿瘤药物的细胞毒作用;体内与抗肿瘤药物联合应用对两种肿瘤抑瘤率明显高于单用抗肿瘤药物组,mdr1mRNA和Pgp的表达下降。结论:EGCG与抗肿瘤药物联合应用可增强化疗药物对耐药肿瘤细胞BEL7404/Adr和耐药口腔癌细胞KBV200的细胞毒作用,机制可能与降低MDR1mRNA表达、降低Pgp表达有关。     

丹酚酸A逆转肺癌多药耐药基因MDR1相关microRNA的筛选与鉴定

通过将人肺癌A549细胞分为正常对照组和给药组,采用实时定量PCR对MDR1的表达水平进行测定。运用microRNA芯片对给药组和对照组进行microRNA表达谱分析;采用Targetscan预测上调microRNA中与多药耐药基因MDR1相关的miRNA以及实时定量PCR的方法对筛选出的miRNA进行验证,研究丹酚酸A逆转肺癌多药耐药基因MDR1相关microRNA。实验结果表明,与对照组相比,给药组MDR1的表达水平明显下调;microRNA芯片对人肺癌A549细胞的给药组和对照组进行了miRNA表达谱分析,共筛出426个差异表达的miRNA;然后对差异表达上调的miRNA进行靶基因预测,发现有4个明显上调的miRNA与多药耐药基因MDR1相关。对4个miRNA进行实时定量PCR验证,结果与芯片一致。因此认为丹酚酸A下调肺癌多药耐药基因MDR1可能是通过影响miRNA表达进而调控靶基因,对进一步阐明中药逆转多药耐药作用机制提供了实验依据。     

美洲大蠊多肽逆转人肝癌HepG2/ADM细胞多药耐药性的作用及机制研究

目的探讨美洲大蠊多肽(PAE_2)逆转人肝癌多药耐药细胞株HepG2/ADM的作用及机制。方法噻唑蓝(MTT)法检测HepG2/ADM细胞对不同化疗药物的耐药性以及PAE_2联合化疗药物(5-氟尿嘧啶、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、奥沙利铂)对HepG2/ADM细胞增殖的影响;激光共聚焦观察PAE_2对HepG2/ADM细胞中药物累积的影响;Western blotting法检测PAE_2对HepG2/ADM细胞凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X,Bax)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase 9,Caspase-9)、DNA修复酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)表达的影响;qRT-PCR法检测PAE_2对多药耐药蛋白1(multiple drug resistance 1,MDR1)、乳腺癌耐药相关蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP)和酶介导的多药耐药途径中蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、拓扑异构酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ,TopⅡ)的m RNA表达。结果 PAE_2抑制Hep G2/ADM细胞增殖,呈时间和剂量相关性。PAE_2可逆转Hep G2/ADM对不同化疗药物的耐药性;PAE_2可上调Hep G2/ADM细胞中阿霉素水平,呈剂量相关性。PAE_2可显著上调耐药细胞中Bax、cleaved Caspase-9 p37蛋白表达水平(P0.05、0.01),显著下调Bcl-2蛋白表达水平(P0.01),对cleaved PARP蛋白表达无显著影响。PAE_2均显著下调Hep G2/ADM细胞中MDR1、BCRP、PKC、TopⅡm RNA水平(P0.01)。结论 PAE_2可以通过减少药物外排、促进细胞凋亡、下调耐药蛋白表达等途径逆转Hep G2/ADM细胞的多药耐药性。     

中药逆转MCF-7/ADM细胞多药耐药机制的研究进展

乳腺癌细胞(MCF-7/ADM)的多药耐药性(MDR)是导致抗肿瘤药物临床化疗失败的主要原因。现认为细胞中的P-gp、Bcl-2、GST-π、TopoⅡ等蛋白可能与乳腺癌的多药耐药相关。近年来研究发现,不少中药能够下调MDR1 mRNA和/或P-gp的表达,从而逆转MCF-7/ADM细胞对抗肿瘤药物的多药耐药性,提高耐药细胞对化疗药物敏感性。主要对MCF-7/ADM细胞的多药耐药机制及有逆转MCF-7/ADM多药耐药作用的中药进行了综述。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对裸鼠肝癌移植瘤细胞凋亡作用的研究

目的 了解表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对裸鼠肝癌移植瘤细胞凋亡的影响.方法 建立BEL-7404/ADR细胞裸鼠移植瘤模型,分为control组、ADM组、EGCG组、ADM联合低剂量EGCG组(AE low组)、ADM联合中剂量EGCG组(AE mid组)和ADM联合高剂量EGCG组(AE high组),给药20 d,处死裸鼠去瘤块.用免疫组织化学法(TUNEL法)检测瘤组织内原位细胞凋亡和流式细胞仪(FACS)检测肿瘤组织细胞周期.结果 ADM与低、中、高剂量的EGCG合用,其细胞凋亡率分别为16.7％,20.3％和25.9％,高于单用ADM组的9.3％(P＜0.01),使肿瘤细胞增殖阻滞在S/G2期.结论 EGCG可协同增强ADM促肝癌MDR细胞BEL-7404/ADR的凋亡,使肿瘤细胞增殖周期阻滞在S/G2期.     

白花蛇舌草对肝癌细胞SMMC-7721基因表达的影响

目的:检测白花蛇舌草对肝癌细胞SMMC-7721细胞生长及肝癌相关基因表达的影响。方法:利用MTT比色法检测白花蛇舌草对肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖方面的影响;利用以肝癌cDNA抑制性消减文库构建的肝癌相关基因微阵列,检测白花蛇舌草作用肝癌细胞SMMC-7721 36 h后基因的表达变化。结果:白花蛇舌草作用肝癌细胞SMMC-7721后36 h,观察到有1个基因的表达上调,14个基因表达下调。结论:证实白花蛇舌草对肝癌细胞的作用是通过影响多基因的表达改变实现的。本研究发现的差异表达基因为进一步研究白花蛇舌草抗肝癌的分子机制提供了线索,并为中草药筛选提供了一种可能的依据方法。     

IFRD1基因表达下调对人肝癌细胞细胞株SMMC-7721基因表达谱的影响

目的 探讨IFRD1表达下调后人肝癌细胞SMMC-7721基因表达谱的改变.方法 采用脂质体lipo2000将构建的含目的基因shRNA的质粒转染入SMMC-7721细胞,并应用Affymetrix U133 plus 2.0 array基因芯片检测目的基因表达下调后,该细胞基因表达谱的变化.结果 RNA干扰抑制IFRD1基因表达后,基因芯片检测发现25476个基因中,表达量发生明显改变的有4221个(上下调大于等于1.5倍),上调的基因有1109个,下调的有3 112个;这些基因涉及到细胞周期、细胞凋亡、DNA复制等通路.结论 IFRD1基因表达下调后,人肝癌细胞SMMC-7721基因表达谱发生明显变化,与细胞生长增殖关系密切的细胞信号通路也发生了明显的改变.     

白藜芦醇通过下调 mdr1/P - gp表达逆转 K562/ADM细胞凋亡抑制

目的：研究白藜芦醇对多药耐药K562/ADM细胞的诱导凋亡效应及其分子机制。方法：以白血病多药耐药细胞K562/ADM为白藜芦醇作用的靶细胞,用MTT比色法检测细胞增殖活性,形态学和DNA片段化观察细胞凋亡;RT-PCR检测mdr1基因和Caspase-3基因mRNA的表达;FCM测定P-gp蛋白表达水平;比色法测定Caspase-3活性。结果：白藜芦醇显著抑制K562/ADM细胞增殖,白藜芦醇诱导后K562/ADM细胞出现典型的凋亡形态学变化和DNA片段化等特征性改变。白藜芦醇下调K562/ADM细胞mdr1基因表达、抑制P-gp合成,并上调caspase-3基因表达、增强caspase-3活性。结论：白藜芦醇通过下调mdr1/P-gp表达逆转K562/ADM多药耐药细胞的凋亡抑制。     

人参皂苷Rg3逆转人胆管癌细胞多药耐药性的实验研究

目的探讨人参皂苷Rg3逆转人胆管癌多药耐药细胞株QBC939/ADM的耐药性。方法人胆管癌多药耐药细胞株QBC939/ADM的建立,主要采用阿霉素(ADM)持续接触浓度递增法,必要时结合高低浓度交替法诱导人胆管癌细胞QBC939产生多药耐药性(MDR)。将三种不同浓度的化疗药物,即环磷酰胺(CTX)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)分别作用于QBC939及QBC939/ADM,用CCK-8法检测不同化疗药物的细胞毒作用,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测MDR基因的表达水平,将得到的数据运用统计学分析,并得出结果,从而证明人胆管癌多药耐药细胞株QBC939/ADM的建立。以中药人参的有效成分人参皂苷Rg3作为MDR逆转剂,逆转QBC939/ADM的MDR,用CCK-8法、流式细胞术、RT-PCR法检测其逆转作用。结果CCK-8法检测化疗药物作用于对照组和实验组的细胞毒作用,结果显示:实验组细胞的OD值(吸光度)明显低于对照组,P 0. 05,差异有统计学意义;流式细胞仪检测化疗药物作用于对照组和实验组的细胞凋亡率:实验组的细胞凋亡率明显高于对照组,P 0. 05,差异有统计学意义; RT-PCR法测定MDR基因的表达,结果显示实验组MDR基因的表达明显低于QBC939/ADM,P 0. 05,差异有统计学意义。结论人胆管癌多药耐药细胞株QBC939/ADM成功建立,并初步证明中药人参的有效成分人参皂苷Rg3能有效逆转其MDR,但其逆转机制尚未研究,需进一步探索。     

PUMA在EGCG调节肝癌细胞生长中的作用

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人肝癌细胞株SMMC-7721生长的影响及其可能作用机制。方法采用不同浓度的EGCG处理SMMC-7721细胞,以四唑氮蓝还原法(MTT)观察处理后细胞的生长情况,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡情况,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测抑癌基因PUMA mRNA表达水平的变化,Western-Blot检测PUMA蛋白水平的表达。结果 EGCG处理后SMMC-7721细胞生长明显抑制,并且呈现时间、剂量依赖性,凋亡细胞比例明显上升。抑癌基因PUMA的mRNA水平和蛋白表达水平随着EGCG浓度的增加而升高。结论 EGCG可以明显抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长,诱导其凋亡;其可能机制为上调抑癌基因PUMA的表达水平,从而促进细胞凋亡。     

川芎嗪逆转HepG2/ADM细胞多药耐药性的体外研究

目的 :研究川芎嗪对人肝癌多药耐药细胞系HepG2/ADM多药耐药性的逆转效应及对P-gp170表达的影响 ,深入探讨川芎嗪逆转肿瘤细胞多药耐药的机理。方法 :应用细胞培养、细胞毒实验、RT-PCR、流式细胞仪等方法 ,观察川芎嗪对体外培养HepG2/ADM细胞的逆转作用。结果 :川芎嗪可以使细胞膜表面的P-gp170表达减弱 ,增加阿霉素对HepG2/ADM细胞的毒性 ;RT-PCR结果表明川芎嗪可以使HepG2/ADM细胞的mdr1基因表达减弱 ;流式细胞仪检测结果表明川芎嗪可以使HepG2/ADM细胞内罗丹明 123的浓度增加 ,从而增加阿霉素对HepG2/ADM细胞的毒性。结论 :川芎嗪具有在体外逆转HepG2/ADM细胞多药耐药的效应 ,具有临床应用前景。     

温郁金提取物对食管癌TE-1细胞增殖的抑制作用

目的 研究温郁金提取物对食管癌TE-1细胞增殖的抑制作用。方法 采用超临界CO2萃取法提取温郁金成分。将TE-1细胞贴壁后分成4组：1组加入100 μL含0.1%DMSO的RMPI-1640 培养基,作为对照组;另外3组分别加入浓度为25、50、100 mg/L温郁金提取物完全培养液各100 μL,分别作为温郁金低、中、高剂量组。培养48 h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定各组TE-1细胞生长抑制率。应用基因芯片技术检测各组TE 1细胞基因表达谱的变化。对差异表达基因进行基因本体(gene ontology, GO)功能分类。结果 与对照组比较,温郁金各剂量组生长抑制率均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。温郁金各剂量组TE-1细胞生长抑制率随着剂量升高而增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。通过基因芯片筛选出温郁金提取物作用前后88个基因表达水平发生改变且有统计学意义,包括22个基因表达下调,66个基因表达上调。基因GO分类提示差异表达基因主要涉及信号传导(6个)、细胞周期(8个)、凋亡(14个)或分化调节(10个)等。结论 温郁金提取物对人食管癌TE-1细胞生长有抑制作用,其抗肿瘤作用可能与调控多层次的基因表达改变有关。     

三物白散加味方影响肿瘤多药耐药基因表达实验研究

观察三物白散加味方对肿瘤多药耐药（MDR）基因表达的影响。以三物白散加味方含药血清加入人胃癌SGC-7901细胞中,观察MDR基因表达的变化。结果：三物白散加味方可降低人胃癌SGC-7901细胞MDR基因表达率。提示三物白散加味方临床不易产生多药耐药,并可作为MDR逆转剂使用。     

人BMI-1基因真核表达载体构建及其在人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中的表达

目的：构建人Bmi-1基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Bmi-1,转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞中并检测其表达。方法：RT-PCR检测Bmi．1mRNA在乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-MB-468细胞中的表达水平;从MCF-7细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,扩增Bmi-1基因序列,将含有Bmi-1全长编码序列的PCR产物经TA克隆后经PCR、酶切验证,亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-Bmi-1,转化至大肠杆菌后,酶切、测序鉴定;将重组质粒转染到MDA-MB-468中,48h后RT-PCR检测转染前后Bmi-1mRNA及hTERTmRNA的表达变化。结果：Bmi-1mRNA在MCF-7细胞中表达较高,而在MDA-MB-468细胞中仅适量表达。成功从MCF-7细胞中克隆获得Bmi-1基因并构建真核表达载体。转染后在MDA-MB-468中检测到Bmi-1mRNA表达上调,其过表达上调hTERTmRNA的表达。结论：成功克隆和建立人Bmi-1基因真核表达载体;pcDNA3．1（＋）-Bmi-1能在MDA-MB-468中表达;为进一步研究Bmi-1基因在细胞中的功能奠定了基础。     

藏花素对膀胱移行细胞癌T24细胞基因表达谱的影响

目的：应用基因表达谱芯片研究藏花素(crocin)对膀胱移行细胞癌T24细胞基因表达谱的影响。方法：MTT法测定藏花素对T24细胞的生长抑制率，选出藏花素最佳作用时间和浓度，运用高通量的基因表达谱芯片检测藏花素作用T24细胞前后基因表达谱的变化，筛选差异表达基因。RT-PCR和免疫细胞化学验证上调基因p21^WAF1和下调基因cyclinD1。结果：MTT实验结果显示3 mmol·L^-1藏花素作用T24细胞48 h的抑制率与对照组相比有显著意义(P<0.05)。基因芯片检测发现3 mmol·L^-1藏花素作用T24细胞48 h引起该细胞系基因表达谱广泛地改变，其中表达差异2倍以上的基因共836个，这些差异表达基因的功能涉及多个方面，最为明显的是与细胞生长调节相关的细胞周期调节基因、细胞凋亡调控基因、DNA复制相关基因等类型。RT-PCR检测其中的细胞周期调节相关基因p21^WAF1和cyclinD1，结果与基因芯片相符。同时免疫细胞化学结果从蛋白表达水平上佐证p21^WAF1和cyclinD1变化与芯片结果一致。结论：藏花素可以诱导T24细胞基因表达谱广泛的改变，并可能通过调控细胞周期相关基因的表达来抑制T24细胞的增殖。     

四物合剂对人红白血病细胞株K562/ADM多药耐药性的逆转作用研究

目的 :观察四物合剂对人红白血病细胞株K5 62 /ADM多药耐药性的逆转作用。方法 :以维拉帕米为阳性对照 ,MTT法观察耐药细胞株K5 62 /ADM的耐药倍数及四物合剂的逆转倍数 ;采用反相高效液相色谱法 (RP-HPLC)检测细胞内的ADM浓度 ;免疫荧光法测定细胞膜P-糖蛋白 (Pgp)表达。结果 :四物合剂和ADM合用时 ,对K562/ADM耐药性的逆转倍数及细胞内的ADM含量比ADM单独使用时明显增高 (P<0.01);但对K562/ADM细胞膜Pgp表达的影响差异不显著 (P>0.05)。结论 :四物合剂在无毒性剂量时能逆转细胞株K562/ADM对ADM的耐药性 ,但对细胞膜Pgp表达影响不大 ,其逆转作用可能与降低Pgp药物外排作用、增加细胞内药物浓度有关。     

肠胃清对长春新碱诱导的人结肠癌耐药细胞株Y盒结合蛋白核移位及P-糖蛋白表达的影响

目的观察肠胃清对长春新碱诱导的人结肠癌耐药细胞株HCT8/V的Y盒结合蛋白(YB-1)核移位、多药耐药基因MDR1及P-糖蛋白(P-gp)表达的影响,进一步探讨该方逆转肿瘤多药耐药的分子机制。方法制备大鼠灌胃后的肠胃清药物血清,以Western blot方法检测肠胃清药物血清作用下HCT8/V细胞胞浆、胞核YB-1表达情况,EMSA法分析YB-1与MDR1基因启动子结合活性,RT-PCR检测MDR1、YB-1、多药耐药相关蛋白(MRP)mRNA转录水平,流式细胞仪检测细胞膜表面P-gp表达。结果在1.25%、2.5%、5%药物血清作用下,HCT8/V细胞核内YB-1表达逐渐减弱,细胞质内YB-1表达则逐渐增强;YB-1与MDR1基因启动子结合活性逐渐下降(P0.01);MDR1 mRNA转录水平逐渐降低(P0.05,P0.01),YB-1和MRPmRNA的水平无明显变化(P0.05);细胞膜表面P-gp表达荧光强度值减弱(P0.05,P0.01)。结论肠胃清可通过影响耐药细胞YB-1的核移位、降低MDR1/P-gp的表达,逆转结肠癌细胞的耐药。     

金龙蛇颗粒对原位移植人MKN-45胃癌组织基因表达谱的影响

目的:利用基因表达谱芯片研究金龙蛇颗粒对MKN-45胃癌的分子机制。方法:抽提经金龙蛇颗粒治疗的裸鼠原位移植人MKN-45胃癌组织和生理盐水阴性对照的瘤组织总RNA并纯化mRNA,分别逆转录并进行荧光标记,制作成cDNA探针,与包含4096个人类基因的cDNA表达谱芯片进行杂交,筛选出两组间差异表达基因。结果:在mRNA水平上,筛选出包括与DNA结合、转录和转录因子、蛋白翻译、细胞周期等相关表达差异的基因共341条,其中44条(比值>2)表达上调(占12.9%),297条(比值<0.5)表达下调(占87.1%)。结论:金龙蛇颗粒可引起MKN-45胃癌组织一系列基因表达的改变,金龙蛇颗粒抗胃癌的基因途径可能是多环节、多层次的结果。