血小板膜糖蛋白I ba基因多态性与心血管疾病

血栓形成是导致冠脉闭塞的主要形式,血小板的突然聚集阻断了动脉的血液供应,导致心肌组织梗死。血小板膜糖蛋白(GP)Ib-Ⅸ-Ⅴ是参与血小板粘附的关键因素。血小板膜糖蛋白GP Ibα是血小板膜上含量最多的糖蛋白,可以结合vWF及凝血酶。GP Ibα基因至少有3种多态性:Kozak序列-5T/C多态性、HPA-2a/2b(humanplatelet antigen)多态性和VNTR(variant number of tandemrepeats)多态性。有证据支持Kozak序列-5C、蛋氨酸145和VNTR B/C基因型是心脑血管疾病的危险因素。有必要进行进一步的研究证实GP Ⅰbα基因多态性与心血管疾病的关系。1.GPIbα的结构组成 GP Ib-Ⅸ是血小板膜的主要糖蛋白之一,每个血小板表面约有25 000个GP Ib-Ⅸ分子。GP Ib-Ⅸ-Ⅴ复合物包括两个GP Ib-Ⅸ单位和GPV。GP Ibα(分了量14万)     

活性氧在血小板储存损伤引起的GPIbα酶切中的作用研究

目的 活性氧(ROS)在血小板活化和凋亡过程中起重要作用,血小板在发生活化和凋亡时伴随有糖蛋白(GP) Ibα酶切,血小板储存损伤(PSL)主要由血小板活化和凋亡引起。本研究主要探讨ROS在PSL引起的GPIbα酶切中的作用和分子机制。 方法 取健康志愿者单采血小板,(22±2)℃震荡,分别在保存的1、3、5 d用无菌接管机取一定量血小板,离心得到沉淀和上清,上清用酶标仪检测糖萼蛋白(GC);沉淀用缓冲液重悬,经洗涤2次后得到洗涤血小板;洗涤血小板与不同的检测探针孵育后,用流式细胞仪检测细胞内ROS浓度、线粒体跨膜电位去极化、磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和P-选择素表达;Western blot检测p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化。 结果 随着保存时间的延长,血小板P-选择素表达、PS外翻和线粒体跨膜电位去极化逐渐增多,血小板胞内ROS浓度逐渐增多,p38 MAPK磷酸化逐渐增多、血浆中GC含量逐渐增多;ROS拮抗剂抑制血小板胞内ROS增多、抑制p38 MAPK磷酸化、减少血浆GC含量;p38 MAPK抑制剂抑制p38 MAPK磷酸化和减少血浆GC含量,不抑制ROS浓度增加。 结论 ROS在PSL引起的GPIbα酶切过程中起重要作用,ROS可能通过活化p38MAPK进而引起GPIbα酶切。      

免疫金标记法研究血小板功能缺陷性疾病

本文利用国产抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体分别制备出抗人血小板膜糖蛋白（GPIb、GPⅡb及GPⅢa）的免疫金探针。以此探针检测了9例“刺参诱聚缺陷症”患者及2例血小板无力症患者血小板膜糖蛋白。结果表明“剌参诱聚缺陷症患者”其静息状态下血小板GPIb、GPⅡb正常，GPⅢa低于正常时照组（P＜0．01）。经“剌参”刺激后，GPⅢa仍低于正常（P＜O．01），而经ADP刺激后GPⅢa可恢复正常。血小板无力症患者其静息状态下GPIb正常，GPⅡb、GPⅢa、均低于正常（P＜0.01）。经“刺参”、ADP刺激后GPⅢa、GPⅡb仍低于正常，（P＜O．01）。     

糖蛋白Ⅸ基因Ala139→Thr突变导致的巨大血小板综合征

目的：对1例有血小板膜糖蛋白(GP)Ib／Ⅸ缺失的巨大血小板综合征(BSS)患者的GPIb／Ⅸ的基因进行系统的研究。方法：用PCR扩增GPIba．GPIbβ与GPⅨ基因全长编码序列并做DNA序列分析。用限制性内切酶HPYCH4Ⅲ对GPⅨ的基因片断做酶切位点分析。用定点诱变技术制备突变质粒并通过脂质体转染技术转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用流式细胞术比较野生型与突变CHO细胞表面的GPIb／Ⅸ表达。结果：在GPⅨ cDNA的688bp位置发现G→A突变，导致GPⅨ跨膜区139 Ala(GCC)被Thr(ACC)取代。该突变为一种国际上尚未报道的BSS新的基因突变。限制性酶切位点分析显示患者为纯合子，而家庭的其它成员为杂合子。野生型细胞表面有大量的GPIb／Ⅸ，但突变型细胞几乎无GPIb／Ⅸ表达。结论：研究表明本例BSS患者的发病机理为GPⅨAla139((GCC)→Thr(ACC)突变，并提出GPⅨ跨膜区结构对维持GPTb／Ⅸ在血小板正常表汰与可能中的重要意义。     

Expression of Platelet Membrane Glycoprotein Ib/Ⅸ/Ⅴ Complex,a Receptor of Thrombin,in Patients with Hemorrhagic Thrombopathy

To investigate the role of platelet membrane glycoprotein (GP) Ib/Ⅸ/Ⅴ complex and its subunit GP Ibα in patients with hemorrhagic thrombopathy (HT), the expressions of GP Ib/Ⅸ/Ⅴ complex and GP Ibα,defined as mean fluorescence intensity (MFI), were assessed by flow cytometry. The maximum aggregation of platelet was determined by turbidity method. These indicators were compared among 68 HT patients with the presenting complaint of hemorrhage, 33 well-controlled HT patients and 32 normal healthy subjects. The results showed that the MFI of GP Ib/Ⅸ /Ⅴ complex and GP Ibα was markedly lower in HT patients with current hemorrhage than that in the healthy subjects, with difference being statistically significant (P<0.05). There was no significant difference in the expressions of GP Ib/ Ⅸ/ Ⅴ complex and GP Ibα between well-controlled HT patients and normal healthy subjects (P>0.05). It was concluded that the expression of GP Ib/Ⅸ /Ⅴ complex, the receptor of thrombin and von Willebrand factor, was down-regulated in HT patients with current hemorrhage, which might result in the dysfunction of platelet aggregation and recurrence of HT.     

维持性血液透析患者血小板凝血酶受体的表达及其意义

目的观察维持血液透析患者(研究组)血小板蛋白酶激活受体1(PAR1)、蛋白酶激活受体4(PAR4)和糖蛋白Ibα(GPIbα)的表达及其与正常对照者(对照组)之间的差异。方法采用流式细胞术检测两组的PAR1,PAR4和GPIbα的表达,采用比浊法检测其血小板最大聚集率(MAR)。结果维持性血液透析患者血小板GPIbα表达略低于对照组,但差异无统计学意义(P=0.072);血小板PAR1表达高于对照组,血小板MAR低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);相关性分析显示PAR1的表达和血液透析频率之间存在明显正相关(r=0.601,P<0.05)。结论与正常对照者相比,维持性血液透析患者的血小板PAR1表达明显升高,而PAR1的高表达又可引起血小板的进一步活化,从而使血液的高凝状态加剧,可能增加动脉粥样硬化及血管意外发生的概率。     

血小板膜糖蛋白Ibα基因HPA-2、Kozak序列多态性与脑梗死的相关性研究

目的探讨血小板膜糖蛋白(platelet membrane glycoprotein，GP) Ibα基因HPA-2、Kozak序列多态性与脑梗死的相关性。方法选取316例经CT/MRI证实的脑梗死患者做病例组，209例与病例组年龄、性别相匹配的无脑血管病人群做对照组。采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术检测人类血小板抗原-2（human platelet antigen-2，HPA-2）及Kozak序列多态性在两组中的分布频率。结果病例组GPIbα基因HPA-2等位基因频率、基因型与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。病例组Kozak序列C等位基因频率为25.95%，对照组C等位基因频率为18.18%，两组间差异具有统计学意义（χ2=8.1323, P＜0.01）。结论GPIbα基因HPA-2序列多态性与脑梗死无相关性；Kozak序列多态性可能是脑梗死的遗传易感因素。     

Effect of TAP-SSL5 fusion protein on human platelet functions in vitro and in vivo

目的 探讨抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响.方法 采用健康人富含血小板血浆以凝胶过滤法分离得到人血小板.流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5或小鼠抗人CD42b( glycoprotein Ibα,GPIbα)单克隆抗体( HIP1)与血小板的结合情况；以人血小板表面P-选择素的表达及PAC-1的结合反映血小板的激活程度；以全血电阻法定量分析TAP-SSL5对人血小板聚集功能的影响；为评价TAP-SSL5的出血风险,进一步观察了TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响.结果 融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合,并竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合,进而抑制GPIbα与vWF的相互作用.但高浓度的TAP-SSL5(终浓度30m g/L)也能激活血小板,使人血小板表面P-选择素的表达增加(表达阳性率为90.4％)和PAC-1的结合量上升(阳性率为66.3％)；终浓度为10、30 mg/L的TAP-SSL5可引起血小板的显著聚集.给小鼠单次尾静脉注射10mg/kg的TAP-SSL5,可显著延长尾部出血时间,由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(P ＜0.01)；而常规剂量组(3 mg/kg TAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s,与对照组相比无显著差异(P＞0.05).结论 融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能,有助于进一步提高TAP-SSL5的抗血栓作用,但同时也导致融合蛋白TAP-SSL5在高浓度情况下可延长出血时间和激活血小板.     

2型糖尿病患者血小板膜糖蛋白Ib/IX/V复合物表达的研究

目的观察2型糖尿病(T2DM)患者血小板膜糖蛋白(GP)Ib/IX/V复合物及其组分GPIbα的表达。方法将51例T2DM患者分为控制良好组(WCP组)和控制不良组(PCP组),并根据有无血管病变分为伴血管病变组(VD组)和不伴血管病变组(NVD组)。同时选取23例健康体检者为正常对照组(NC组)。检测受试者的生化指标、血小板GPIb/IX/V复合物和GPIbα的表达,并采用比浊法检测血小板最大聚集率(MA)。结果(1)PCP组空腹血糖(FPG)和糖化血红蛋白(HbA1c)与NC组、WCP组比较,差别有统计学意义(P<0.01);WCP组和PCP组的空腹胰岛素(FINS)、BMI、血脂(TC、TG、HDL、LDL)与NC组比较,差别有统计学意义(P<0.01)。(2)WCP组、PCP组GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物平均荧光强度(MFI)与NC组比较,差别有统计学意义(P<0.05);且PCP组GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物的MFI与WCP组比较,差别亦有统计学意义(P<0.05)。WCP组、PCP组GPⅠbαMFI与NC组比较,差别有统计学意义(P<0.01);且PCP组GPⅠbαMFI与WCP组比较,差别亦有统计学意义(P<0.01)。(3)相关性分析显示,T2DM患者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物的MFI与FPG、HbA1c、FINS呈负相关(P<0.05);GPⅠbαMFI与FBG、HbA1c呈负相关(P<0.05)。结论T2DM患者不伴血管病变时即存在血小板活化,发生血管病变后活化更明显,且血小板活化与血糖呈正相关。血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物作为凝血酶和血管性血友病因子的受体,可能参与了T2DM血管病变的发生、发展。     

融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响

目的探讨抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响。方法采用健康人富含血小板血浆以凝胶过滤法分离得到人血小板。流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5或小鼠抗人CD42b(glycoprotein Ibα,GPIbα)单克隆抗体(HIP1)与血小板的结合情况;以人血小板表面P-选择素的表达及PAC-1的结合反映血小板的激活程度;以全血电阻法定量分析TAP-SSL5对人血小板聚集功能的影响;为评价TAP-SSL5的出血风险,进一步观察了TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响。结果融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合,并竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合,进而抑制GPIbα与vWF的相互作用。但高浓度的TAP-SSL5(终浓度30 mg/L)也能激活血小板,使人血小板表面P-选择素的表达增加(表达阳性率为90.4%)和PAC-1的结合量上升(阳性率为66.3%);终浓度为10、30 mg/L的TAP-SSL5可引起血小板的显著聚集。给小鼠单次尾静脉注射10 mg/kg的TAP-SSL5,可显著延长尾部出血时间,由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(P<0.01);而常规剂量组(3 mg/kg TAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s,与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结论融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能,有助于进一步提高TAP-SSL5的抗血栓作用,但同时也导致融合蛋白TAP-SSL5在高浓度情况下可延长出血时间和激活血小板。     

Clinical value of specific autoantibodies against platelet glycoprotein and lymphocyte subpopulations in immune thrombocytopenia

目的 检测血小板特异性自身抗体和外周血淋巴细胞亚群在免疫性血小板减少症(ITP)患者中的水平,并探讨两者之间的联系以及自身抗体与ITP病情间的关系,评价其在ITP中的临床价值.方法 应用改良的单克隆抗体俘获血小板抗原(MAIPA)法检测40例ITP患者血小板膜糖蛋白(GPⅡbⅢa、GPIbα)特异性自身抗体;利用流式细胞术(FCM)检测ITP患者外周血淋巴细胞亚群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、CD19+CD5+)水平.结果 ITP组抗GPⅡbⅢa抗体阳性30例,抗GPIbα抗体阳性26例,其中25%患者仅为单一抗GPⅡbⅢa抗体阳性,15%患者仅为单一抗GPIbα抗体阳性,50%患者为双抗体阳性,10%患者为双抗体阴性.非免疫性血小板减少组与对照组均为阴性.单抗体阳性组采血时血小板计数平均值明显低于双抗体阴性组(P<0.05);双抗体阳性组血小板计数平均值亦明显低于单抗体阳性组和双抗体阴性组(P< 0.05).ITP组与正常对照组相比较,CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞百分率以及CD3+CD4+/CD3+CD8+比例减低,CD3+CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD19+CD5+B淋巴细胞百分率均明显高于对照组(P<0.05).双抗体阳性组CD19+B淋巴细胞、CD19+CD5+B淋巴细胞百分率明显高于单抗体阳性组(P<0.05).结论 血小板特异性自身抗体检测对鉴别ITP和非免疫性血小板减少症有一定价值,自身抗体与ITP的病情有一定关系;血小板特异性自身抗体和T、B淋巴细胞可能共同参与了ITP的发病过程,并在其中起重要作用.     

血小板特异性自身抗体和淋巴细胞亚群检测在免疫性血小板减少症中的临床价值

目的检测血小板特异性自身抗体和外周血淋巴细胞亚群在免疫性血小板减少症(ITP)患者中的水平,并探讨两者之间的联系以及自身抗体与ITP病情间的关系,评价其在ITP中的临床价值。方法应用改良的单克隆抗体俘获血小板抗原(MAIPA)法检测40例ITP患者血小板膜糖蛋白(GPⅡbⅢa、GPIbα)特异性自身抗体;利用流式细胞术(FCM)检测ITP患者外周血淋巴细胞亚群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、CD19+CD5+)水平。结果 ITP组抗GPⅡbⅢa抗体阳性30例,抗GPIbα抗体阳性26例,其中25%患者仅为单一抗GPⅡbⅢa抗体阳性,15%患者仅为单一抗GPIbα抗体阳性,50%患者为双抗体阳性,10%患者为双抗体阴性。非免疫性血小板减少组与对照组均为阴性。单抗体阳性组采血时血小板计数平均值明显低于双抗体阴性组(P<0.05);双抗体阳性组血小板计数平均值亦明显低于单抗体阳性组和双抗体阴性组(P<0.05)。ITP组与正常对照组相比较,CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞百分率以及CD3+CD4+/CD3+CD8+比例减低,CD3+CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD19+CD5+B淋巴细胞百分率均明显高于对照组(P<0.05)。双抗体阳性组CD19+B淋巴细胞、CD19+CD5+B淋巴细胞百分率明显高于单抗体阳性组(P<0.05)。结论血小板特异性自身抗体检测对鉴别ITP和非免疫性血小板减少症有一定价值,自身抗体与ITP的病情有一定关系;血小板特异性自身抗体和T、B淋巴细胞可能共同参与了ITP的发病过程,并在其中起重要作用。     

ADAM17对血小板GPIbα 受体的切割作用—— 活血化瘀中药的一个作用靶点？*

GPIbα(glycoprotein Ibα) 是血小板表面重要的黏附受体GPIb-IX-V复合物的组成部分,其细胞外配体结合片段可在基质金属蛋白酶ADAM17/TACE的作用下发生剪切脱落,削弱血管性血友病因子vWF等配体与血小板的结合,是一种重要的血小板功能调控机制。笔者前期研究发现中药赤芍、红花和黄芪中的活性成分芍药苷（PF）、羟基红花黄色素（HSYA）和某些黄芪皂苷单体（AS-III）,以及复方活血胶囊均可激活血管内皮细胞中的ADAM17,诱导血管内皮细胞表面多种炎症相关蛋白（如TNFR1和EGFR配体）的胞外片段脱落,调控炎症过程、激活保护性信号通路。本文通过综述血小板膜受体GPIbα的功能、ADAM17的激活机制及其对血小板GPIbα受体的切割作用,推测血小板ADAM17可能是中药活血化瘀作用的一个重要物质基础,为研究和阐明中药抑制血小板黏附聚集、血栓形成的作用机制提供了新思路。     

抗人α-synuclein多克隆抗体的制备和鉴定

制备特异性抗人α synuclein抗血清 ,用于α synuclein相关退行性疾病及病理状态的研究。用重组人α synuclein免疫BALB/C小鼠 ,Dotblot、Westernblot及免疫组化法鉴定所获抗血清。Dotblot显示该抗血清可识别高于5 0ng的重组α synuclein。Westernblot分析表明此抗血清可识别人及大鼠脑匀浆中相对分子质量为 1 .8万的蛋白质 ,与以往报道α synuclein的相对分子质量一致。免疫组化染色显示α synuclein免疫活性物质广泛分布于皮质、海马、纹状体、杏仁核和嗅球 ,主要集中于神经元核周胞质及神经末梢。提示 :所制备的抗血清可特异性识别人及大鼠脑中的α synuclein ,该抗体对α synuclein相关疾病的研究具有应用价值     

子痫前期及子痫患者血小板膜糖蛋白Ibα、Ⅱb、PLT及其相关参数的变化

目的 观察子痫前期及子痫患者血小板膜糖蛋白Ⅰbαn(GPlbα)、Ⅱb(GPⅡb)、血小板计数(PLT)及其相关参数的变化.方法 采用流式细胞术检测32例重度子痫前期及子痫患者、16例轻度子痫前期患者、22例孕晚期妇女剖宫产术前及剖宫产术后72 h内GPⅠbd和GPⅡb水平的变化;同期采用全自动血细胞分析仪检测PLT及其相关参数-平均血小板体积(MPV)及血小板分布宽度(PDW).结果 剖宫产术前,与轻度子痫前期组、正常孕晚期组相比较,重度子痫前期及子痫组GPⅠα及PLT明显降低(P＜0.01);MPV及PDW明显升高(P＜0.01).GPⅡb变化差异无显著性(P＞0.05).剖宫产术后,各组GPⅠbα、PLT及其相关参数均恢复至剖宫产术前正常孕晚期水平,GPⅡb变化差异无显著性.结论 孕晚期重度子痫前期及子痫患者存在血小板活化、消耗状态,GPⅠbα、PLT及其相关参数可作为诊断监测指标.产后GPⅠbα、PLT及其相关参数较快恢复至正常孕晚期水平可能与胎盘娩出有关.     

15例遗传性血小板膜糖蛋白缺陷疾病临床和基因突变分析

目的探讨遗传性血小板膜糖蛋白(GP)缺陷疾病临床特征和发病机制。方法采用血小板聚集试验观察血小板对各种诱聚剂的反应,流式细胞术检测血小板膜GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ、αⅡb/β3复合物的含量;应用PCR扩增与DNA直接测序技术进行GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ、αⅡb/β3复合物基因突变分析,同时进行100名健康对照人群相关基因检测并结合千人基因组资料以排除基因多态性。结果 4例大血小板综合征(BSS)患者血小板数减少,血小板体积巨大,对瑞斯托霉素(RIS)诱导的聚集显著降低,对二磷酸腺苷(ADP)诱聚剂反应正常,血小板膜糖蛋白GPⅠbα表达量严重降低;11例血小板无力症(GT)患者,血小板计数均正常,对ADP诱聚剂反应低下,而对RIS反应基本正常。流式细胞仪检测结果显示,Ⅲ型GT 1例,Ⅱ型GT 5例,Ⅰ型GT 5例。基因测序共发现16种突变,其中GPⅠbα基因突变c.G987 A、c.1480ins A,αⅡb基因突变c.C2870 T、c.C2330 A、c.T2597 G为新的突变。结论在BSS和GT中,血小板膜糖蛋白异常与致病基因缺陷有关,出血症状严重程度可能受多种因素的影响。     

角蛋白18在HepG2细胞凋亡中的磷酸化(Ser33,Ser52)及其意义

目的研究角蛋白18(keratin 18,K18)在人肝癌细胞HepG2凋亡中的磷酸化情况并分析其意义。方法以不同浓度的顺铂(cisplatin,CDDP)作用于HepG2细胞,用双标记流式细胞术(Annexin V/PI)染色检测HepG2细胞的凋亡情况,免疫荧光法和蛋白质印迹法检测不同凋亡状态下K18的磷酸化水平。结果顺铂可以使HepG2细胞发生明显的凋亡,而且凋亡比例随着药物浓度的增加而增加;52位丝氨酸(Ser52)磷酸化水平随着药物浓度增加而增加;33位丝氨酸(Ser33)磷酸化在低浓度药物作用下增加,但在高浓度药物作用下明显减少。结论Ser33和Ser52磷酸化的K18与HepG2细胞凋亡有密切关系。     

益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物及GPⅠbα表达的影响

目的 观察益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者凝血酶受体血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物及其组分GPⅠbα的表达的影响来探讨其配伍规律.方法 68例出血性血小板病患者及32例健康人静脉血在静息状态及体外加益气活血方及其拆方中药孵育后,采用流式细胞术检测血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GP Ⅰbα的表达.结果 静息状态时,患者GP Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ及GP Ⅰbα的表达明显低于健康人;益气活血方及其部分拆方组能使患者凝血酶受体GP Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ及GP Ⅰbα恢复至正常水平;而单味中药组作用不明显;方中的主药黄芪与当归配伍为用,可促进血小板膜糖蛋白的表达.结论 益气活血全方及其部分拆方组在受体蛋白水平上调节GP Ⅰ b/Ⅸ/Ⅴ及GP Ⅰ bα的表达,是其治疗出血性血小板病的疗效机制之一.     

ERα AF-1区磷酸化位点突变体的构建及对ERα活性的影响

目的：构建雌激素受体(ERα) AF1区丝氨酸（Ser）磷酸化位点104、106、118和167位基酸的4个突变体,并在哺乳动物细胞293T中检测突变后对其活性的影响。方法：以pcDNA3-ERα为模板,用重组PCR的方法扩增出编码这4种突变体的基因片段,再将这些片段以正确相位与pcDNA3-FLAG载体中的FLAG编码序列融合。用Western blotting检测融合蛋白的表达,并在哺乳动物细胞293T中检测这些突变体突变后对ERα活性的影响。结果：成功构建了ERα AF1区丝氨酸磷酸化位点104、106、118和167位氨基酸的4个突变体,并在293T细胞中得到表达。活性测定结果表明,在不加雌激素(E2)的情况下,ERα及其突变体的转录活性分别是空载体pcDNA3的3.40 、3.21 、3.02 、3.00和3.54倍;在雌激素的作用下,104、106位氨基酸的突变体对ERα的活性无影响,而118和167位氨基酸的突变体的活性值是ERα的50%。结论：在104、106、118和167这4个ERα AF1区磷酸化位点中,只有118和167位点的丝氨酸的磷酸化是雌激素调节靶基因转录过程中所必需的。