轮状病毒星状病毒和甲型肝炎病毒的单管多重荧光定量RT-PCR检测方法研究

目的建立能同时检测星状病毒、轮状病毒和甲型肝炎病毒的单管多重荧光定量RT-PCR方法。方法根据Gen Bank上下载的上述3种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重荧光RT-PCR的重复性、特异性和敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的多重荧光RT-PCR检测方法对轮状病毒、星状病毒和甲型肝炎病毒具有很好的特异性和重复性,轮状病毒灵敏度达到101拷贝,星状病毒和甲型肝炎病毒灵敏度达到102拷贝。128份粪便标本中,轮状病毒和星状病毒的检出率分别为17.97%和3.13%,甲型肝炎病毒未检出。与基因测序比对结果相符。结论用于轮状病毒、星状病毒和甲肝病毒的单管多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

实时逆转录环介导等温扩增检测GⅡ.4型诺如病毒的研究

目的建立快速检测诺如病毒GⅡ.4型的实时逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。方法选取GⅡ.4型诺如病毒的ORF1与ORF2接头处较为保守的基因序列设计RT-LAMP引物并进行筛选,优化反应条件,分析方法的灵敏度、分析特异性和稳定性,采用优化的方法检测40例临床病毒性腹泻样本,结果与实时荧光逆转录PCR(RT-PCR)比较。结果该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP的最佳反应温度为65℃;该方法检测GⅠ型和GⅡ非诺如病毒4型、轮状病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒、CA16、EV71、CA6和CA10等常见10种其他腹泻病毒的结果为阴性;该方法对诺如病毒GⅡ.4型的检测能力与实时荧光RT-PCR相当;与实时荧光RT-PCR相比,该研究建立的RT-LAMP法检测诺如病毒GⅡ.4型阳性样本和诺如病毒阴性样本的符合率为100%。结论该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP快速检测方法灵敏度高,特异性好,为建立诺如病毒其他基因型的RT-LAMP检测方法奠定了基础。     

单管多重荧光定量RT-PCR方法鉴别A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型

目的建立能同时检测A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法。方法分别选用轮状病毒NSP3基因、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型orf1与orf2基因中的64 bp、90 bp和185 bp片段作为荧光定量PCR检测的靶标,设计引物和Taq Man探针,构建标准品,绘制标准曲线,评价检测方法的重复性、特异度和灵敏度,并对138份粪便标本进行检测及测序验证。结果 3种病毒对应的标准曲线分别为:轮状病毒:y=-3.9lgx+41.204;诺如病毒GⅠ型:y=-3.06lgx+40.716;诺如病毒GⅡ型:y=-3.29lgx+41.538,质粒标准曲线的方差系数为0.997,灵敏度达到每个反应102copy/μl,特异度强。138份样本中检出A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的检出率分别为32.6%、5.8%和26.1%,与基因测序比对结果相符。结论构建可用于A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

四种食源性病毒多重反转录-聚合酶链反应检测研究

目的 建立同时检测诺如病毒、轮状病毒、星状病毒和甲肝病毒多重RT-PCR检测方法.方法 以四种食源性病毒的高度保守区为靶序列设计特异引物,优化反应体系和条件,确定多重RT-PCR检测四种病毒的特异性和灵敏度,并初步应用于临床样本中四种病毒的同时检测.结果 在灵敏度试验中得到的轮状病毒、诺如病毒和星状病毒稳定的最高检测限均为50 pg/ml,甲肝病毒为100 pg/ml.在128份临床粪便样本中,其中轮状病毒阳性62份(48.44%),诺如病毒阳性8份(6.25%),星状病毒阳性11份(8.59%),甲肝病毒阳性4份(3.12%).结论 研究所建立的多重RT-PCR方法,在实际应用中能同时处理大量的样本,提高PCR检测方法的能力,可以应用于临床病例的诊断和流行病学调查等研究.     

A群轮状病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立

摘要:目的　建立以特异性荧光探针为特点的Taqman荧光定量RT-PCR方法,对轮状病毒A群核酸进行检测。方法　根据轮状病毒A群基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析TaqMan RT-PCR的重复性、特异性、敏感性;以所建立的方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果　所建立的TaqMan RT-PCR检测方法对轮状病毒A群具有很好的特异性和重复性,灵敏度达到101拷贝/μl。128例粪便标本中,轮状病毒A群的检出率为18.0%,与基因测序比对结果相符。结论　构建的轮状病毒A群TaqMan RT-PCR检测方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

水中诺如病毒浓缩与应急检测研究

目的探索适合于基层实验室开展的水中诺如病毒浓缩与应急检测的方法,评估钙离子法对水体中诺如病毒的富集效果及检测灵敏度,为水源性诺如病毒突发疫情的病原检测提供可靠的检测数据。方法将不同浓度的指示病毒(GⅡ型诺如病毒)加入到不同水样中,用钙离子法进行富集,用荧光定量PCR检测,根据富集前后的病毒浓度,评估方法的回收率;根据不同梯度的检测值,评估方法的灵敏度。同时制备不同的模拟水样进行荧光定量PCR检测。结果钙离子法的平均回收率为81.6%,检测灵敏度为模拟样本中病毒浓度为10 copy/μl。而10份不同模拟水样荧光定量PCR检测阳性9份。结论钙离子法浓缩水样中的诺如病毒,回收率与灵敏度均较高,操作简单;同时,荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏的优点,适用于基层实验室开展水体中诺如病毒的应急检测。     

西宁地区秋冬季节婴幼儿GⅡ型诺瓦克病毒流行情况分析

目的:了解青海省儿童诺瓦克病毒(NLVs)流行株和流行趋势,为NLVs引起的腹泻提供实验室资料,以便更好的控制传染病的爆发流行。方法:采用Real-Time PCR和RT-PCR两种方法对西宁地区婴幼儿腹泻的标本进行NLVs的检测。结果:西宁地区120例婴幼儿腹泻中,Real-Time法检测阳性45例,检出率为37.50%;RT-PCR检出阳性39例,检出率为32.50%。结论:西宁地区秋冬季节婴幼儿腹泻中NLVs是主要的病原体之一,仅次于轮状病毒;在快速诊断中Real-Time的灵敏度优于RT-PCR。     

婴幼儿病毒感染与腹泻相关临床参数的关系分析

目的研究婴幼儿病毒感染与腹泻相关临床参数的关系,为婴幼儿病毒性腹泻的诊治和预防提供依据。方法收集124例5岁以下腹泻患儿血液和粪便进行常规检测,采用免疫金层析技术检测粪便标本的轮状病毒,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测粪便标本轮状病毒、星状病毒、腺病毒及诺如病毒的表达水平,对结果采用SPSS16.0软件进行统计分析。结果 124例腹泻患儿中免疫金层析技术和RT-PCR检测轮状病毒阳性率分别为37.9%和46.0%;RT-PCR检测星状病毒、腺病毒及诺如病毒感染率分别为41.10%、19.40%和15.32%;重叠感染91例,其中轮状病毒与星状病毒重叠感染28例最为常见;急性胃肠炎患儿病毒感染率明显高于胃肠功能紊乱患儿(P<0.05);病毒感染在1岁以下腹泻患儿更常见(P<0.05),病毒感染腹泻患儿粪便性状常见水样;胃肠功能紊乱患儿血液C-反应蛋白(CRP)>10、白细胞(WBC)>10×109/L和粪便WBC阳性比例均明显高于急性胃肠炎患儿(P<0.05)。结论 RT-PCR可以提高腹泻患儿轮状病毒检出率,轮状病毒为腹泻患儿特别是<1岁患儿急性胃肠炎的主要病毒性因素,病毒性感染引起的腹泻以水样便更常见,胃肠功能紊乱患儿血像变化比急性胃肠炎患儿明显。     

诺如病毒和轮状病毒实时荧光PCR联合检测在托幼机构病毒性腹泻疫情检测中的应用

目的探讨实时荧光PCR联合检测诺如病毒和轮状病毒在托幼机构病毒性腹泻疫情中的应用。方法收集2017-01/2018-06期间青白江区托幼机构报告的疫情患儿肛拭子和大便样品共124份,同时用实时荧光PCR检测诺如病毒和轮状病毒RNA。结果 124份样品中共检出了诺如病毒GⅡ型69例,检出率55.6%,轮状病毒(A/B/C)26例,检出率21.0%;混合感染3例(2.4%)。其中47份肛拭子样品检出诺如病毒16例,检出率34.0%;检出轮状病毒5例,检出率10.6%;77份大便样品检出诺如病毒53例,检出率68.8%;检出轮状病毒21例,检出率27.3%。结论在托幼机构的病毒性腹泻疫情中,诺如病毒检出率最高,但轮状病毒也占一定的比例,因此同时检测两种病毒很有必要。大便样品病毒RNA检出率显著高于肛拭子样品,提示要尽量采集大便样品进行检测。     

宁波市江北区婴幼儿腹泻病原分析

目的:了解宁波市江北区婴幼儿腹泻病原组成及其流行情况,为腹泻病的防治提供依据。方法:采集2007~2008年宁波市江北区腹泻患儿粪便265份,采用细菌培养法检测6种肠道致病菌:沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157:H7、致病性气单胞菌。采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)快速检测粪便样本中轮状病毒,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测轮状病毒核酸。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增并检测轮状病毒。结果:在265份样品中,检出肠道致病菌2株,致病菌感染率为0.75%。用ELISA法和RT-PCR法检出轮状病毒阳性样本分别为86株和84株,阳性率分别为33.21%和31.70%,两者检测结果无统计学差异。PAGE法结果显示均为A组轮状病毒,未发现病毒细菌混合感染现象,而2岁以下腹泻病人,轮状病毒检出率为78.57%。结论:轮状病毒是江北区婴幼儿腹泻最主要的病原体,且以轮状病毒A组为主,2岁以下儿童是轮状病毒感染的高危人群,应加强对腹泻儿童轮状病毒的监测。     

水中肠道食源性病毒的多重RT-PCR检测法

目的 建立能同时检测水环境中肠道病毒(Enterovirus,EVs)、诺如病毒GⅡ(Norovorus,Nov GⅡ)、轮状病毒(Rotavirus,RVs)、腺病毒(Adenovirus,AdVs)的多重RT-PCR检测.方法 根据GenBank收录的肠道食源性病毒核酸序列,利用软件DNAMAN设计肠道病毒通用引物以及Nov GⅡ、RVs、AdVs的特异性引物;将这4对引物置于同一体系中进行多重RT-PCR,利用各种肠道食源性病毒的核酸模板检测其特异性并通过不同滴度[100～107 pfu(copies )/ml]病毒测试其灵敏度;利用加标实验验证该方法的准确性;通过对5份河水或某水厂出水大体积水样(50L)进行病毒富集与检测,以确定该方法的实用性,同时,采用传统细胞培养法验证其结果.结果 该方法对目的病毒均获得了理想的电泳条带,而对其他病毒无非特异扩增;对EVs、AdVs的最低检出滴度均为10 pfu/ml,Nov GⅡ-4为10 copies/ml,对RVs的最低检出滴度为102 pfu/ml;加标实验检测结果准确率为100％;对5份河水或某水厂出水大体积水样进行病毒富集与检测,对以上各种病毒均有检出且与细胞培养结果一致.结论 该方法不仅特异性强、灵敏度高、简便快捷,而且准确率高,实际应用性强,适用于水中肠道食源性病毒的快速检测.     

2018年-2019年定西地区腹泻病原谱及流行特征

目的 了解并掌握定西地区感染性腹泻的病原谱及流行特征,为腹泻的预防控制提供科学依据.方法 采集腹泻病例粪便标本,用细菌常规分离培养法鉴定监测方案要求的8种细菌,用RT-PCR法和毛细管电泳检测A组轮状病毒、肠道腺病毒等5种病毒.结果 407份标本共检出腹泻病原332株,总检出率为81.57％.177份A组轮状病毒阳性标...     

海河天津城市区域人类腹泻病毒的污染特征调查

目的研究城市典型河流生境条件下人类腹泻病毒的污染特征,阐明环境水体病毒污染规律。方法于2014年3月—2015年2月,采集海河天津城市区域水样,采用实时荧光定量PCR技术检测腹泻病毒[轮状病毒(HRVs)、诺如病毒(HuNoVs)、肠道腺病毒(HadVs)、星状病毒(AstVs)、肠道病毒(EnVs)]的浓度。结果在36份海河水样中,肠道腺病毒和星状病毒的检出率最高,均为91.7%,其次是肠道病毒83.3%,诺如病毒75.0%,而轮状病毒的检出率最低,为58.3%。肠道病毒在7—9月出现高峰期,其他腹泻病毒均在10月—次年1月出现高峰期。结论人类腹泻病毒在海河中均呈现一定的时间分布规律且具有明显的季节性。     

依赖核酸扩增技术在轮状病毒检测中的应用

目的将一种新颖的核酸扩增技术—依赖核酸扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification NASBA)应用于轮状病毒的快速检测与辅助诊断。方法根据美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)轮状病毒VP7基因保守序列设计引物,建立NASBA检测方法,进行特异性、灵敏度和重复性试验,以所建立方法和RT-PCR方法同时对108例临床病毒性腹泻患者粪便样本进行检测。结果所建立的NASBA方法对轮状病毒具有较好的稳定性和高度特异性,与诺如病毒等8种腹泻相关病毒均无交叉反应,灵敏度达5μg/L。108份粪便样本中,用RT-PCR方法检出轮状病毒阳性11份,用NASBA方法检出阳性样本13份。结论本研究应用的轮状病毒NASBA检测方法特异、灵敏、快速简便,适用于轮状病毒的日常监测和暴发疫情的应急诊断。     

GⅠ和GⅡ型诺如病毒双重荧光RT-PCR法检测

目的 建立应用Allglo探针同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重荧光反转录\聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法 设计针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒开放阅读框架ORF1及ORF2为目的基因的引物和Allglo探针,优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系;对该方法的特异性、抗干扰性、灵敏度进行评估,对96份临床粪便标本进行检测、测序分析.结果 该方法特异性强,与轮状病毒、扎如病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应;同一体系下GⅠ或GⅢ型诺如病毒相互之间没有干扰;最低检测限均为10 copies/μL;对96份临床粪便标本进行检测,结果与单重荧光RT-PCR方法符合率100％,且测序结果显示目标序列正确.结论 本研究建立的Allglo探针法检测GⅠ和G Ⅱ型诺如病毒技术特异性好,灵敏度高,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速筛查.     

反转录聚合酶链反应检测水产品中甲型肝炎病毒的研究

目的：建立一种特异、灵敏的RT-PCR方法检测水产品中甲肝病毒。方法：采用抗体捕获RT-PCR和直接RNA提取RT-PCR对细胞传代的甲肝病毒、模拟染毒水产品中甲肝病毒、上海农贸市场水产品中的甲肝病毒进行检测。结果：2种RT-PCR检测细胞传代的甲肝病毒，检测灵敏度无明显区别；而对模拟染毒水产品中甲肝病毒的检测，两者检测灵敏度有显著差异。对农贸市场94份水产品中的甲肝病毒检测，检出率分别为2．13％、13．83％。结论：对于水产品中的甲肝病毒的检测，直接RNA提取RT-PCR要比抗体捕获RT-PCR方法灵敏。     

实时荧光定量RT-PCR快速检测星状病毒方法的研究

目的建立以特异性荧光探针为特点的Taq Man荧光定量RT-PCR检测星状病毒。方法根据星状病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析荧光定量RT-PCR的重复性、特异性、敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的荧光定量RT-PCR检测方法对星状病毒具有很好的特异性和重复性,灵敏度达102copy/μl。128例粪便标本中星状病毒的检出率为3.1%,与基因测序比对结果相符。结论构建的星状病毒荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异且灵敏的特点,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

2017-2019年湖北省病毒性腹泻监测病原学与流行病学分析

目的 了解湖北病毒性腹泻病原体的病原构成和流行特征.方法 收集2017-2019年湖北病毒性腹泻哨点监测的成人和儿童腹泻患者粪便标本,采用Real-time RT-PCR方法检测轮状病毒、诺如病毒、腺病毒、星状病毒和札如病毒核酸,对5种病原体检测结果进行统计学分析.结果 1 957份标本中5种腹泻病毒总的阳性检出率为3...     

一起诺如病毒感染性腹泻暴发的病原学调查分析

目的检测某高校一起感染性腹泻暴发疫情的标本,以明确其致病原,为制定防控措施提供依据。方法采集患者的粪便、呕吐物、唾液、手涂抹样标本,健康人群的粪便标本,患者宿舍外环境标本进行检测。采用四号琼脂、Mac、SS、沙门科玛嘉培养基对标本进行划线分离培养与系统生化鉴定常见肠道致病菌细菌学种类。采用普通PCR、多重RT-PCR和实时荧光RT-PCR方法进行诺如GⅡ型病毒和C组轮状病毒检测,并对阳性标本进行测序鉴定。结果共检测291份标本,病毒总阳性率17.53%,其中诺如GⅡ型病毒检测阳性45份,阳性率15.47%,C组轮状病毒阳性率2.06%。98份病例标本检出阳性率高,总阳性率37.76%,其中诺如GⅡ型病毒阳性率31.63%。54份健康人群标本诺如GⅡ型病毒阳性检出率7.41%,环境标本诺如GⅡ型病毒检测阳性率7.19%。结论本起疫情为主要由诺如GⅡ型病毒引起的诺如病毒感染性腹泻暴发,致病病原中同时混杂有C组轮状病毒。