猪链球菌2型溶血素sly基因的表达及其产物的纯化和活性研究

目的 克隆并表达猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly),为筛选SS2疫苗保护性抗原奠定基础.方法 用PCR方法从SS2临床分离株05ZYH33的基因组DNA中扩增出溶血素基因片段,将目的 基因插入表达载体pET-30b(+)中,构建重组表达载体pET30b-sly.重组载体经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定后,转化大肠埃希菌(E.coli Rosetta).IPTG诱导表达,镍离子亲和层析纯化重组蛋白,鉴定目的 蛋白的免疫学活性以及溶血活性.结果　PCR扩增的sly基因长度约为1500 bp,经测序分析,插入载体的sly基因序列准确并保持了正确的读框.经IPTG诱导的目的 蛋白表达量约占总蛋白的30%,亲和层析纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测证实该蛋白能与感染SS2的人血清发生特异性结合.溶血试验表明重组蛋白溶血素能使猪红细胞发生溶解,溶血价为256.结论 成功构建了表达载体pET30b-sly,该载体可在大肠埃希菌中表达,表达蛋白具有免疫反应原性及溶血活性.     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定抗T-2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株,以期为T-2毒素的快速检测提供有力的抗体工具。方法:采用琥珀酸酐法将T-2毒素活化为T-2HS,T-2HS在DCC与NHS作用下与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联合成完全抗原。以T-2HS-BSA为抗原,免疫BALB/c小鼠,用ELISA筛选、建立分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株。测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价,用间接竞争法检测单克隆抗体细胞株的特异性。结果:建立了1株稳定分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株T-1B3,该细胞株所分泌的单隆抗体Ig亚类为IgG1,ELISA检测结果表明抗T-2毒素抗体可以与T-2毒素发生特异性反应,工作浓度为1:6.5×104,IC50为3.6 ng/ml。该抗体与HT-2毒素的交叉反应为65.9%,与黄曲霉毒素无交叉。结论:制备出能分泌具有较高特异性和亲和力的抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。     

汉坦病毒单克隆抗体的制备和鉴定

本文用汉坦病毒A16和R22株活毒免疫BALB／c小鼠，取牌细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合，制备了6株分泌抗汉坦病毒单克隆抗体的杂交癌细胞系。单克隆抗体IgG亚类鉴定表明，其中2株为IgG1，1株为IgG2b，3株为IgG2a。用间接免疫荧光检测单抗腹水滴度，分别在1：10240～1：81920之间；用反向被动血凝抑制试验测定单抗腹水，滴度均低于1：20。免疫印迹试验表明，6株单克隆抗体均为抗核蛋白单抗。对已知型别病毒的反应话表明，其中3株为组特异性单抗，1株为汉滩型特异性单抗，2株为汉城型特异性单抗。还用6株单抗对宁夏新分离毒株进行抗原性分析。     

去甲氯胺酮单克隆抗体制备及鉴定

近年来,氯胺酮(ketamine,KET)在中国青少年中滥用呈快速上升趋势。目前,KET及其代谢物的分析检测主要依赖仪器联用技术,有关KET的免疫学检测方法也有报道〔2-3〕。KET代谢的半衰期为3～4h,摄入体内由细胞色素酶P450经N去甲基作用形成去甲基氯胺酮(norketamine,NKET)和去氢去甲基氯胺酮(dehydronorketamine,DHNK),这些代谢产物在生物检材中含量比较高,因此,建立KET代谢物(主要是NKET)的检测技术更为重要。     

猪链球菌2型多重PCR鉴定方法建立

目的建立猪链球菌2型多重PCR鉴定方法。方法根据猪链球菌种特异基因16S rRNA序列和猪链球菌2型特异性荚膜多糖编码基因cps2 J基因序列,设计和合成2对特异引物,通过条件和体系优化,建立多重PCR检测方法。结果猪链球菌2型参考株及18株分离株均扩增到清晰的目的条带,而6株非猪链球菌2型参考菌株不能扩增出目的条带。结论多重PCR可以用于猪链球菌2型检测,特异性和敏感性好,为该病的快速诊断和分子流行病学调查提供了新的技术方法。     

甲型肝炎病毒H2株单克隆抗体的制备及鉴定

目的 为甲型肝炎病毒(HAV)的诊断和相关研究提供高效价的抗体来源. 方法 用细胞培养获得的H_2株HAV免疫BALB/C小鼠,经细胞融合技术,ELISA筛选和有限稀释克隆化培养. 结果 获得3株能稳定分泌抗HAV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名为6-A8、6-F2和1-H3.经鉴定,其上清和腹水的抗体效价分别为1∶(2048～16 824)和1∶(65 536～524 288).6-A8和6-F2属IgG2a亚型,1-H3属IgG1亚型.染色体数分布在92～98之间.3株细胞株McAb分别能与HAV不同抗原位点结合. 结论 3株能稳定分泌抗HAV McAb的杂交瘤细胞株成功建立,并获得高效价的抗HAV McAb.     

猪链球菌2型gdh基因的克隆与表达

目的 克隆表达猪链球菌2型诊断性抗原谷氨酸脱氢酶GDH. 方法 根据基因库中的gdh基因序列设计PCR引物,自病人分离株2007SF0165基因组扩增GDH的编码基因gdh,克隆至pMD19-T载体后进行测序分析,并且构建重组表达质粒pGEX4T-2-gdh,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测. 结果 PCR法自猪链球菌2型菌株2007SF0165基因组扩增出约1.3kb的目的片段;序列分析显示猪链球菌的GDH具有GDH蛋白家族Ⅰ的典型保守序列;构建筛选的原核重组表达质粒pGEX4T-2-gdh经诱导表达,获得蛋白相对分子质量为45 kDa目的蛋白. 结论 克隆并表达出猪链球菌2型诊断性抗原GDH,可为进一步研究奠定坚实的基础.     

环丙沙星单克隆抗体制备、纯化及鉴定

目的制备抗环丙沙星单克隆抗体.方法用碳二亚胺(EDC)法合成的环丙沙星-牛血清白蛋白完全抗原(CPFX-BSA)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选分泌抗环丙沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果筛选出3株分泌抗环丙沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D10、3C6和3G7,其抗体类型分别为IgM、IgG1和IgG1.其中3C6腹水抗体纯度、抗体浓度、亲和常数分别为80.04%、3.96 g/L和1.01×108 L/mol.该单抗与恩诺沙星、诺氟沙星的交叉反应率分别为125.89%、19.50%,与青霉素、卡那霉素和庆大霉素等无交叉反应.结论该单抗可用于动物性食品中CPFX残留ELISA检测方法的建立.     

VITEK2 compact微生物分析系统快速鉴定猪链球菌2型

目的建立快速准确鉴定猪链球菌方法，为疫情的及时诊断和感染者治疗提供科学依据。方法运用VITEK2 compact微生物分析系统对四川省2005年不明原因疾病疫情病原菌进行鉴定。结果运用VITEK2 compact微生物分析系统对四川省2005年分离出的111株可疑病原菌进行了鉴定，有110株鉴定为猪链球菌2型，1株鉴定为猪链球菌1型，而且最短在4h内可以鉴定。结论运用VITEK2 compact微生物分析系统可以快速准确的鉴定猪链球菌2型。     

抗杀虫脒单克隆抗体的制备和特异性鉴定

用自制的杀虫脒人工抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，致敏的小鼠脾细胞与ＳＰ２／Ｏ骨髓瘤细胞融台后，筛选出４株持续稳定分泌抗杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤，将其注入预处理后的小鼠腹腔，制备出高效价腹水。腹水中的单克隆抗体用ＤＥＡ－纤维素柱分离纯化。经间接竞争ＥＬＩＳＡ考查，发现制备的抗体对杀虫脒具有很高的特异性，为建立杀虫脒的免疫分析法打下了基础。     

Sao蛋白多克隆抗体制备鉴定及促全血杀菌作用

目的 制备2型猪链球菌（S.suis 2）表面抗原一（Sao）重组蛋白的多克隆抗体,鉴定其免疫学特性。方法 通过PCR从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中扩增基因Sao,构建重组表达质粒pET28a-Sao,转化E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷诱导表达目的蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物,His亲和层析柱纯化重组蛋白,利用纯化后Sao蛋白制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,评价Sao多克隆抗体的促全血杀菌作用。结果 构建的重组质粒可以在宿主菌中高效表达,纯化后获得的重组蛋白纯度可达90%;间接酶联免疫吸附试验测定Sao多克隆抗体效价为1：102400;Western blot结果显示,Sao多克隆抗体有较好的特异性;全血杀菌实验显示,05ZYH33在含有Sao多抗血清的全血中相对存活率下降85%。结论 本研究制备的2型猪链球菌重组Sao蛋白多克隆抗体效价高,特异性好,可明显增强全血对细菌的杀伤作用。     

粗糙型布鲁氏菌单克隆抗体的制备及应用于种型鉴定的实验研究

应用首次制备的犬种及绵羊附睾种布鲁氏菌单克隆抗体对不同种型布鲁氏菌株检测的实验研究表明,两种单克隆抗体对粗糙型布鲁氏菌具有特异性,可应用于粗糙型与光滑型布鲁氏菌的鉴别,并且较之常规凝集试验,不仅可定性或定量检测,而且应用ELISA试验检查具有很髙的敏感性。     

宁波市首例人感染猪链球菌2型的实验室鉴定

目的:对首例人感染猪链球菌2型菌株进行鉴定,了解病原学及毒力。方法:将疑似猪链球菌感染患者血液、脑脊液进行增菌培养,对所分离的病原菌进行染色形态观察、APIStrep20生化鉴定;合成引物检测菌株的16SrRNA、cps2J、mrp、ef、sly、gapdh基因片段;制作cps2J、mrp、ef、sly长片段产物,进行基因序列测定。结果:从患者血液和脑脊液中分离的病原菌,经API20Strep生化鉴定编码为4641453,确认为猪链球菌2型,16SrRNA扩增结果进一步证实该菌为猪链球菌2型,基因测序结果与Genebank中注册05ZYH33的猪链球菌2型序列同源性在99%以上。结论:根据流行病学调查、临床表现和实验室鉴定结果,本起人感染猪链球菌的病原为猪链球菌2型,带有多种毒力基因其分子生物学特征典型。     

三聚氰胺多克隆抗体的制备及其特异性鉴定

目的制备特异的能区分奶粉中α-乳清蛋白和乳铁蛋白等含氮化合物的三聚氰胺多克隆抗体。方法采用碳化二亚胺法将三聚氰胺和匙孔碱血蓝蛋白(KLH)藕联成完全抗原,在BALB/C小鼠皮肤背部多点注射,收集分离血清,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫印迹法(Westernblotting)鉴定抗血清特异性。结果在BALB/C小鼠体内制备出三聚氰胺多克隆抗体效价为1︰12 800,可与三聚氰胺免疫原多肽良好结合,不与奶粉中α-乳清蛋白和乳铁蛋白等含氮化合物发生交叉反应。结论成功的制备了三聚氰胺特异性多克隆抗体,为研制三聚氰胺免疫学检测方法奠定了基础。     

抗寨卡病毒包膜蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备抗寨卡病毒(zika virus,ZIKV)包膜蛋白(envelope protein,E蛋白)单克隆抗体,检测其免疫反应特异性.方法 将ZIKV重组E蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞用50％聚乙二醇(PEG)融合,经过含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培养基筛选出阳性克隆,采取有限稀释法获...     

A型流感病毒M2e单克隆抗体的研制及鉴定

目的 制备A型流感M2e(2-24)单克隆抗体,并进行初步研究.方法 以M2e-OVA免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,经有限稀释法克隆化及筛选,获得抗M2e(2-24)的杂交瘤细胞株,制备腹水,并对其进行纯化,分析和鉴定.结果 获得3株稳定分泌M2e单克隆抗体的杂交瘤细胞株L1,L2,L3,其免疫球蛋白亚类均为IgG1,腹水效价为105以上. 结论 成功制备了抗M2e(2-24)的特异性单克隆抗体,为研制具有交叉保护作用的流感疫苗奠定了基础.     

鳙鱼变应原小清蛋白单克隆抗体制备及鉴定

目的 制备、纯化及鉴定抗鳙鱼小清蛋白单克隆抗体。方法 以重组鱼主要过敏原小清蛋白(parvalbu-min)为抗原免疫BALB/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1,半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体,间接ELISA方法和w estern blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性;采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。结果 共获得抗parvalbumin细胞株7株,1G1,1B5,1A5,2B9,1H4,1B7,1G3。1G1、1B7、1A5、1H4和1G3效价均高于1:400 000,P/N>2.1;1B5效价高于1:200 000,2B9效价较低;Western blot检测表明所有抗体均能识别parvalbumin;抗体亚类为IgG1型,1G1,1A5,2B9,1H4,1B7特异性结合parvalbumin,与其他种类过敏原无交叉反应,1G3和1B5与虾和大豆过敏原有交叉反应性,P/N>2.1。结论 获得高效价抗体5株,发现parvalbumin与虾、大豆过敏原存在交叉反应性,为建立parvalbumin检测体系提供依据。     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体,并对其进行鉴定。方法提取白假丝酵母菌基因组DNA为模板,经聚合酶链反应（PCR）获取SAP2目的基因;双酶切SAP2基因与原核表达载体pMAL c2x（+）,构建pMAL c2x/SAP2重组质粒;在大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达出可溶性的融合蛋白;用可溶性Sap2免疫小鼠制备抗血清,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清效价,亲和层析法纯化抗血清后,利用Western免疫印迹(Western Blot)检测抗体特异性。结果该研究成功制备了抗Sap2多克隆抗体,抗体效价＞1∶51 200;Western Blot检测结果表明,该抗体可特异性识别Sap2蛋白。结论纯化后的Sap2作为抗原免疫小鼠,有较好的抗原性和免疫原性,可成功制备多克隆抗体,并具有高特异性,为快速检测侵袭性白假丝酵母菌感染奠定了基础。     

西尼罗病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备西尼罗病毒单克隆抗体并对其生物特性进行鉴定,为快检试剂盒的研制奠定基础。方法通过动物免疫、细胞融合、克隆和筛选等方法制备西尼罗病毒单抗,应用间接免疫荧光(IFA)、ELISA方法进行特异性、效价、亚型等的鉴定。结果获得了5株西尼罗病毒的单克隆抗体,其中4株与所检的登革病毒1-4型、黄热病毒、乙脑病毒、布尼安病毒、基孔肯雅病毒均无交叉反应,1株与乙脑病毒有交叉反应;亚型分类均为IgG2a;效价可达1∶12 800以上。结论本研究获得了5个高滴度、特异性较好的西尼罗病毒单克隆抗体。