单细胞二重巢式PCR诊断β地中海贫血

【目的】探讨单细胞水平诊断β地中海贫血(β-thalassemia)的可靠性,为开展β地中海贫血的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)打下基础。【方法】采用二重巢式PCR并结合扩增特异的突变系统检测技术(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)扩增含有CD41-42突变位点的β地中海贫血患者的单淋巴细胞及正常人单淋巴细胞和单卵裂球的β-珠蛋白基因的5个常见突变位点(CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、CD71-72和nt.-28位点),扩增产物经过2%的琼脂糖凝胶电泳检测。【结果】患者的88个单淋巴细胞的扩增成功率为95.5%,等位基因脱扣的发生率为4.8%,诊断准确率为95.2%;正常人的41个单淋巴细胞的扩增成功率均为95.1%,假阳性率为0;正常人的34个单卵裂球细胞的PCR扩增成功率为88.2%;35管细胞洗脱液空白对照组假阳性扩增率为0。【结论】单细胞二重巢式PCR并结合ARMS技术诊断β地中海贫血是稳定的、可靠的,适用于β地中海贫血的PGD。     

脐血HLA-AB分型方法探讨

目的　探讨脐血HLA AB分型方法。方法　分别采用血清学方法和PCR SSP基因定型方法对 1 0 2份脐血HLA A、B位点进行检测。结果　两方法对比分析结果显示血清学近 1 8.6 %不能得出满意结果 ,HLA A、B位点错定率分别为 6 .1 %和 1 0 .8% ,总错误率 1 6 .9%。结论　脐血HLA表达水平低 ,单个核细胞反应弱及部分交叉反应是造成血清学不能确定或错定的主要原因     

中华(上海)骨髓库江浙沪汉族人群HLA基因多态性调查

目的 调查中华(上海)骨髓库江浙沪汉族人群HLA—A、B、DR的基因多态。方法 应用PCR—SSP技术、结合上海自行设计的基因分型格局,检测中华(上海)骨髓库江浙沪汉族人群HLA-A、B、DR基因多态性及其频率分布特征。结果 调查中共检出A位点抗原26种,B位点抗原54种,DR位点20余种,其中最常见抗原包括A2、A11、A24、A30、A33、B13、B46、B51、B58、B60、B61、B62、DR3、DR4、DR7、DR9、DR15、DR16等。结论 中华(上海)骨髓库江浙沪汉族人群HLA基因多态性的分布有自身特点,其分布格局频率介于南、北汉族之间。     

印迹基因Snrpn在人类卵母细胞及植入前胚胎mRNA表达

目的了解印迹基因Snrpn在人类卵母细胞和植入前胚胎的表达,以分析Snrpn基因表达对人类卵母细胞和早期胚胎发育的影响。方法采用单细胞巢式逆转录多聚酶链式反应(Single Cell Nested RT-PCR)方法,检测人类卵子和植入前各个阶段胚胎的印迹基因Snrpn mRNA表达情况。结果Snrpn在人类卵母细胞GV、MI、MII和植入前胚胎2、4、6、8细胞期都有表达,单卵母细胞扩增成功率为87.5%,单个胚胎为75.8%,平均扩增成功率为79.1%。单个卵母细胞和单个卵裂球扩增成功率无显著性差异(P>0.05),但单卵母细胞较单个卵裂球高。结论建立了比较稳定、可靠的单细胞巢式RT-PCR技术检测基因表达。印迹基因Snrpn在人类卵细胞和植入前胚胎的表达对卵子生长和胚胎发育有着重要意义,为早期胚胎阶段该基因表达正常图谱提供实验依据     

单细胞四重巢式荧光聚合酶链反应进行血友病A基因诊断和性别鉴定的研究

目的 建立快速有效检测血友病A基因诊断和性别鉴定的单细胞聚合酶链反应（PCR）方法。方法 联合6个与凝血因子Ⅷ（FⅧ）紧密连锁的STR位点（DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108和F8Civs13）通过多重荧光PCR进行正常人群多态性分析和血友病A家系基因诊断，从中选取杂合度和诊断率较高的STR位点联合性别位点牙釉蛋白基因（Amelogenin gene）建立单淋巴细胞多重巢式荧光PCR的检测方法。结果 选择了3个杂合度和诊断率较高的STR位点（F8Civs13、DXS1073和DXS15）联合性别位点建立了单细胞四重巢式荧光PCR的检测方法。Amelogenin、DXS15、F8Civs13和DXS1073在男性的单细胞扩增成功率分别为94．3％、91．4％、100％和100％，在女性为100％、97．1％、97．1％和97．1％。该女性的DXS1073和DXSl5位点呈杂合子，均未发现等位基因脱失现象。扩增皆未发现假阳性和假阴性的情况。结论 建立的单细胞四重巢式荧光PCR方法快速有效，有望应用于临床血友病A非创伤性产前基因诊断。     

辽南地区造血干细胞捐献者HLA基因分布和单倍型分析

目的了解辽南汉族造血干细胞捐献者的HLA基因多态性和单倍型的分布特点。方法应用PCR-SSP和PCR-SSO2种方法对辽南地区的9678份样本进行HLA-A、B、DRB1位点的基因分型,并对分型结果作统计学分析。结果辽南地区造血干细胞捐献者HLA基因分型,共检出A位点表型特异性18种,检出率为85.71%;B位点共检出表型特异性41种,检出率为93.18%;DR位点共检出表型特异性13种,检出率为92.86%。基因分布符合Hardy-Weinbery规律(P>0.05)。在HLA单倍型分布中,A30B13、A2B46、A33B58、A30DR7、A33DR13、A2DR10、B13DR7、B46DR9、B52DR15等均具有较高的连锁频率。结论本组数据了解辽南地区,汉族人造血干细胞捐献者的HLA基因分布特点,有利于估计相合供者的概率。     

应用引物延伸预扩增方法对地中海贫血进行植入前遗传学诊断的初步研究

植入前遗传学诊断 (PGD)由于可检测的材料仅 1～ 2个卵裂球细胞 ,很难进行一个基因的多种突变或多位点基因改变的基因分析。引物延伸预扩增 (PEP)是随机扩增单细胞全基因组的有效方法 ,有望解决这个问题。我们在本研究中探讨PEP在地中海贫血 (珠蛋白生成障碍性贫血 ,地贫 )PGD中的应用。材料和方法1　细胞来源　外周静脉血取自 3例东南亚缺失型α地贫 1杂合子 (- - SEA/αα)患者、5例 β 4 1 4 2 (-TCTT)突变杂合子患者、2例IVS Ⅱ 6 5 4 (C→T)突变杂合子患者。胚胎来自本单位体外受精 胚胎移植过程中由于多精受精或胚胎质量差…     

孕妇外周血胎儿细胞中巨细胞病毒基因的检测及意义

目的利用孕妇外周血中胎儿细胞进行无创性产前诊断巨细胞病毒宫内感染的新方法。方法(1)采用显微操作技术从273例孕妇外血中分离单个胎儿有核红细胞。(2)应用多重引物原位合成技术(primed in situ labeling，PRINS)检测76例孕妇外周血HCMV-DNA阳性标本的单个胎儿细胞的SRY基因和HCMV-DNA基因。(3)应用引物延伸预扩增法(primed extension preamplification，PEP)及聚合酶链反应(PCR)检测273例孕妇外周血中单个胎儿细胞的SRY基因和HCMV-DNA基因。结果(1)应用显微操作技术分选胎儿细胞的分选率为100％。(2)PRINS技术检测SRY基因的敏感性为97．56％(40／41)，特异性为100％(35／35)。检测HCMV-DNA基因的敏感性为92．68％(38／41)，特异性为100％(35／35)。(3)PEP及PCR方法检测SRY基因的敏感性为97．39％(149／153)，特异性为99．17％(119／120)，检测HCMV-DNA基因的敏感性为95．12％(39／41)，特异性为100％(232／232)。结论应用PRINS技术、PEP方法及PCR技术对孕妇外周血中单个胎儿细胞进行非创伤性产前诊断巨细胞病毒宫内感染是一种敏感性高特异性强的新方法，可能具有广阔的临床应用前景。     

中国安徽地区白血病患者与HLA-A、B、DRB1基因关联性研究

本研究旨在探讨中国安徽地区人群中白血病的易感性与HLA—A、B、DRB1基因多态性之间的关联。采用聚合酶链反应序列特异性引物（PCR—SSP）方法对安徽地区140例慢性髓系白血病（CML）、84例急性淋巴细胞性白血病（AIJL）、90例急性非淋巴细胞性白血病（ANLIJ）患者以及916名健康的非血缘造血干细胞捐献者作为正常对照组进行了HLA基因分型,分别比较了病人组及正常对照组的HLA—A、B、DRB1位点的基因频率,通过x。检验进行统计学分析。结果表明,CML患者A2、A11、B58、DR9基因频率较对照组明显升高,DR7基因频率较对照组明显降低：AIJIJ患者A11、B13基因频率明显高于对照组;ANLL患者A24、B58、DR9基因频率较对照组明显升高。结论：HIA—A2、A11、B58、DR9是CML的易感基因,DR7是其拮抗基因;HLA—A11、B13是ALL的易感基因;HLA—A24、B58、DR9是ANLL的易感基因。     

天津地区3000份脐血HLA-DR等位基因多态性分析

目的　了解天津地区汉族人群HLA DR位点基因多态性和HLA单倍型特点。方法　采用反向聚合酶链反应 序列特异性寡核苷酸探针 (PCR SSOP)杂交的方法 ,对来源于天津地区汉族产妇的 30 0 0份脐血进行HLA DR位点基因分型 ,对分型结果进行分析 ,并与欧洲白种人、西安汉族人群进行比较。结果　天津地区HLA DR等位基因以DRB1 15最为常见 ,其后依次为DRB1 0 9,DRB1 0 7,DRB1 12和DRB1 0 4。主要单倍型依次为A 0 2 DRB1 0 9,A 0 2 DRB1 15 ,B 13 DRB1 0 7,A 0 2 DRB1 12 ,A 30 DRB1 0 7,B 4 6 DRB1 0 9。DRB1 12和DRB1 0 9在天津地区汉族人群中出现频率明显高于欧洲白种人 ,而DRB1 0 1与DRB1 0 3则明显低于欧洲白种人 ,与西安地区汉族人群比较 ,本资料除DRB1 0 4 ,DRB1 13低以外 ,其余均无显著差异。结论　天津地区汉族人群HLA DR位点等位基因多态性与北方汉族人群 (如西安 )分布相近。     

反向PCR—SSOP技术行HLA—AB分型与临床应用

建立快速,准确的DNA分型技术并用于临床移植前HLA-AB配型,以弥补血清学分型技术的局限性。采用反向聚合酶链反应-序列特异寡核苷酸探针杂交技术（反向PCR-SSOP）进行DNA分型,可检出HLA-A（*0101-8001）和B（*07021-8201）等等位基因。结果表明,发现利用反向PCR-SSOP技术对所有样本分型均获成功,无假阳性和假阴性结果出现;美国洛杉矶加州大学（UCLA）质控细胞DNA分型结果与UCLA公布的测序结果一致。血清学与基因分型相比。血甭学结果HLA-A错检率6.4%和HLA-B错检率为7.4%。2例白血病病人分别有一个HLA抗原血清学方法不能检出。结论提示,反向PCR-SSOP技术用于HLA分型分辨率高,简单快速。结果直观、准确。分型结果较血清学方法更加精确,可适用于临床应用。     

标准HLA-A、B、DR配型与氨基酸残基配型在肾移植术后早期急性排斥反应中的差异

目的　研究标准HLA -A、B、DR配型和氨基酸残基配型与肾移植术后早期急性排斥反应中的差异。方法　将 14 47例次肾移植受者 ,按HLA误配率 (MM )对标准配型和氨基酸残基配型 ,分别进行分组 ,统计各组术后 1～ 2个月内 ,急性排斥反应的发生率。结果　标准HLA配型 6误配组 ,术后早期急性排斥反应发生率为 2 1 .6% ;5误配组为 2 8. 9% ;4误配组为 19 .1% ;3误配组为 16. 5 % ;2误配组为 16 .3 % ;1和 0误配组未见术后早期急性排斥反应发生。而氨基酸残基配型 6误配组 ,术后早期急性排斥反应发生率为 2 8 .6% ;5误配组为 2 0 . 2 % ;4误配组为2 3 . 6% ;3误配组为 2 0 . 2 % ;2误配组为 2 0 . 4% ;1误配组为 19% ;0误配组为 16%。结论　标准HLA -A、B、DR配型比氨基酸残基配型在肾移植术后早期急性排斥反应中的作用更为明显。     

HLA class I and II antigen phenotypes of North American Indians from Minnesota: implications for marrow transplants using unrelated donors

As a result of an appeal for a bone marrow donor for a North American Indian (Native American) patient, 261 Native Americans from our community were typed for HLA-A,B,DR antigens, and 51 were typed for HLA-A,B antigens only. The HLA antigen frequencies of the Native Americans were compared with those of 12,881 white bone marrow donors and were found to differ markedly. To investigate the implications these differences in HLA antigen frequencies would have for the location of unrelated bone marrow donors, the HLA types of 12 Native American bone marrow transplant patients from our institution were used to search among 5389 HLA-A,B,DR-typed white donors in the National Marrow Donor Program file and the file of 261 HLA-A,B,DR-typed Native American donors. In the white donor file, at least two donors were found that matched at all HLA-A,B,DR antigen loci of one Native American patient (8%). Using the Native American donor file, which was less than one-twentieth the size of the white donor file, and HLA-A,B,DR-matched donor was also found for one (8%) of the patients. These results suggest that although donors for nonwhites can be identified in a file of HLA-typed white volunteers, the probability of finding a suitably matched donor for such individuals is enhanced if donors representing racial or ethnic minorities are included in unrelated donor registries.     

Donor-specific transfusions. Donor-recipient HLA compatibility, recipient HLA haplotype, and antibody production

HLA profiles of 25 donor-specific transfusion (DST) kidney donor-recipient pairs were analyzed for HLA antigen compatibility. Serum samples collected during and after DST were tested for cytotoxic antibodies against T and B lymphocytes of the donors and 30 normal individuals. Eleven recipients did not produce cytotoxic antibodies to the antigens of their DST donors, and eight produced cold and/or warm, broadly reactive B-cell antibodies. Six patients (24%) produced HLA-A, B, C, and/or DR antibodies. Three of these individuals produced antibodies after two immunizations, while others required three immunizations. Three of the 11 antibody nonproducers (17%) had not received previous transfusions, as compared to three of the eight antibody producers (43%). Comparison of HLA profiles revealed 22 percent of the HLA-A, B, DR identities between the transfusion donor and recipient in antibody nonproducers as compared to 9 percent of the HLA-A, B, DR identities in antibody producers. The HLA-A2, B40, DR4 haplotype and HLA-DRW6 antigen were more common among antibody producers than among nonproducers, who had an excess of the HLA-B8, DR3 haplotype. These results are consistent with the hypothesis that there may be high- and low-responder HLA haplotypes that control immunologic responsiveness to histocompatibility antigens.     

HLA-A,B,DRB1单体型频率计算及其在骨髓库中的应用

目的从群体资料计算HLAA,B,DRB1三座位单体型频率,并用于骨髓库寻找HLA匹配供者。方法根据HLA表型群体资料,使用最大数学预期值算法(ExpectationMaximization,EM)计算HLA三座位单体型频率。通过实例运算介绍HLA表型频率以及发现HLA匹配无关供者的概率。结果①使用DNA基因分型技术鉴定12193例无关汉族健康个体HLA表型,计算求得HLAA,B,DRB1单体型频率。②预期概率与观察结果吻合,并用于评估骨髓库的最适大小。结论使用EM算法估计大样本汉族群体HLAA,B,DRB1三座位单体型频率,结果可靠,可用于评估骨髓库的最适大小和组份。     

Selection of compatible platelet donors: a prospective evaluation of three cross-matching techniques

A prospective study was undertaken to assess the values of platelet aggregometry, lymphocytotoxicity, and mixed lymphocyte cultures in selecting compatible donors for patients refractory to random platelet transfusions. Donors were selected at random without regard to HLA types. Concurrent with each platelet transfusion, platelet aggregometry and lymphocytotoxicity were performed using patient serum and donor cells. The results were compared with HLA types, MLC, and increments in platelet counts. Forty-one transfusions were given to 21 patients; 27 were from related and 14 from unrelated donors. Platelet aggregometry was used successfully in selecting compatible donors in 37 cases (90%) with three false negative and one false positive results. Lymphocytotoxicity was useful in 73 per cent of cases with eight false negative and three false positive results. The response to platelet transfusions correlated poorly with HLA matches or MLC reactions. These data suggest platelet aggregometry and lymphocytotoxicity are useful cross matching techniques in selection of compatible platelet donors.     

5186例上海汉族无关脐带血HLA基因多态性研究

目的了解上海地区汉族人群脐带血供者HLA-A、B、DRB1基因及单体型频率的分布特征。方法采用基因分型技术对5 186例脐带血进行HLA-A、B、DRB1基因分型,利用最大似然性原理方法计算HLA-A、B、DRB1基因及单体型频率。结果 5 186例脐带血样本中,共观察到72种HLA基因,其中频率>0.1的HLA-A、B、DRB1基因分别为A2、A11、A24、B60、B13、B46、DR9、DR12、DR4、DR15。385条A-B单体型中,195条单体型呈现显著的正连锁不平衡(A.L.D>0),12条表现为强连锁不平衡(R.L.D>0.40),26条单体型的频率高于0.01;387条B-DRB1单体型中,159条单体型呈现显著的正连锁不平衡(A.L.D>0),7条表现为强连锁不平衡(R.L.D>0.40),20条单体型的频率高于0.01;1847条A-B-DRB1单体型中,760条单体型是"可靠的"(频率≥2.89×10-4),单体型频率高于0.005有29条。结论上海汉族新生人群脐带血HLA基因和单体型多态性较为丰富,其频率分布数据和相关遗传参数为临床移植供者的选择、脐带血库的建立及人类遗传学研究提供了重要的参考。     

黑龙江地区汉族HLA-A、B、DRB1基因及单倍型的研究与应用

目的研究中国造血干细胞捐献者资料库黑龙江分库汉族捐献者HLA-A、B、DRB1等位基因和单体型频率分布特征,探讨中国广大地区乃至世界其他人种利用黑龙江汉族捐献者进行造血干细胞移植的可能性。方法采用序列特异性引物(PCR-SSP)和序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)基因分型技术,对黑龙江地区汉族捐献干细胞的9 019名供者进行HLA-A、B、DRB1基因低分辨检测。结果共观察到77个HLA等位基因,其中频率>0.1的A、B、DRB1座位特异性分别为A2、A11、A24、B13、DR15、DR9、DR7、DR12、DR4。432条A-B单体型中,25条单体型的频率高于0.01,101条单体型呈现显著的正连锁不平衡,21条表现为强连锁不平衡(RLD>0.40);437条B-DRB1单体型中,22条单体型的频率高于0.01,115条单体型呈现显著的正连锁不平衡,16条表现为强连锁不平衡;2 002条A-B-DRB1单体型中,971条单体型有意义(频率≥1.66×10-4),18条单体型频率高于0.005。截止2007年3月通过中国造血干细胞捐献者资料库管理中心检索,成功移植20例。结论黑龙江汉族人群HLA-A,B,DRB1等位基因和单体型的分布特征接近北方汉族人群,与中国汉族人总体分布特征相似。未发现群体特有的基因和单体型,但具有其自身分布特征。不同地区、不同人群有可能在中国造血干细胞库黑龙江地区汉族捐献者中寻找到HLA相合的供者。其中中国人群最容易找到HLA相合供者,其次是日本人和韩国人。     

人类白细胞抗原（HLA）基因分型在造血干细胞移植中的应用

目的提高造血干细胞移植供、受者HLA配型的精确度，有效防止移植物抗宿主病Graft—vs host disease（GVHD）的发生。方法采用准确、简便的DNA提取方法和PCR—SSP基因分型方法。建立HLA—A，B，DR基因分型方法。结果对167例临床标本进行基因水平的研究发现。DNA提取方法可以满足此项研究对样本的要求。HLAPCR—SSP基因分型方法具有良好的稳定性、可靠性和特异性。结论HLA基因分型方法准确、特异、重复性好．可作为临床造血干细胞移植配型和正常人群无关供者筛选的常规方法。对（GVHD）的发生必将起到重要的预防作用。     

应用不同类型白血病患者群体HLA-A、B和DRB1遗传学数据评估HLA相合供者的概率

目的探讨不同类型白血病汉族患者群体找到HLA-A、B和DRB1低分辨全相合无关供者可能性。方法依据1201名急性淋巴细胞白血病(ALL)、1065名急性非淋巴细胞白血病(AML)和1432名慢性粒细胞白血病(CML)汉族患者群体HLA-A、B和DRB1低分辨分型结果,计算这3类白血病汉族患者群体的HLA-A、B和DRB1抗原频率,单体型频率和表型频率,联合应用中华骨髓库(CMDP)中健康汉族供者HLA表型频率数据,进一步推导出这3类白血病汉族患者群体找到至少1名HLA低分辨全相合供者概率及回归方程。结果ALL、AML、CML汉族患者群体表型种类数分别为416851、373903和464373种,其中31%的表型频率均>1/100万;ALL、AML、CML汉族患者群体在CMDP的汉族供者群体中找到至少1名HLA表型相同供者回归方程分别为:P=0.0824LgN-0.3667、P=0.0825LgN-0.3636和P=0.0829LgN-0.3644;计算出81.6%的ALL、81.9%的AML、82.4%的CML汉族患者要找到1名HLA低分辨表型相同的无关供者,CMDP中汉族有效供者群体数平均146.7万。结论应用不同类型白血病患者群体HLA-A、B和DRB1遗传学数据评估患者找到HLA相合供者概率较仅以健康供者群体HLA遗传学数据评估更为精确。为有效地提高患者的移植效果,需要征募更多的无关供者。