微载体培养L02人肝细胞应用于生物人工肝的初步研究

Ｌ0 2人肝细胞株组织学来源为人正常肝组织 ,具备一定正常肝细胞的生物功能。我们将高密度微载体培养的Ｌ0 2人肝细胞聚集体加入中空纤维生物反应器 ,构建简易体外生物人工肝装置并进行初步的应用研究。一、材料与方法1.材料 :Ｌ0 2人肝细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所 ;Ｃｙｔｏｄｅｘ3微载体为Ｐｈａｒｍａｓｉａ公司产品 ;聚羟乙基异丁烯酸 (Ｐｏｌｙ ＨＥＭＡ )及ＤＭＥＭ、ＨａｍｓＦ12培养基均为Ｓｉｇｍａ公司产品。2 .Ｌ0 2人肝细胞的微载体培养 :( 1)取 1.4ｇＣｙｔｏｄｅｘ 3,水化处理[1] ;( 2 ) 12 %Ｐｏｌｙ ＨＥＭＡ…     

成人肝细胞分离及低温保存的研究

我们采用改进的胶原酶灌注技术 ,获取分离的成人肝细胞 ,并研究威斯康星 (ＵＷ )保存液对细胞活力和ＡＴＰ贮存的影响 ,现将结果报道如下。一、材料与方法1.主要试剂 :Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、ＤＮＡ酶Ｉ、4 2 羟乙基 1哌嗪乙磺(ＨＥＰＥＳ)均购自Ｓｉｇｍａ公司 ,离解酶(Ｄｉｓｐａｓｅ)Ⅱ型购自Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ公司 ,小牛血清为Ｇｉｂｃｏ产品。2 .分离方法 :成人肝脏取自脑死亡供体 ,采用腹部多器官联合快速切取技术获取 ,ＵＷ液低温灌洗。切取灌洗较好的肝叶组织 60～ 80ｇ(1个切面 ,保留3～ 4支血管行插管 ) ,ＵＷ液 0～ 4℃保…     

Fas介导肝细胞凋亡在肝硬化大鼠肝缺血再灌注损伤中的研究

肝脏缺血再灌注 (Ｉ/Ｒ)损伤常见于临床上入肝血流阻断肝切除术和肝移植。我们通过复制肝硬化大鼠肝Ｉ/Ｒ模型 ,测定Ｆａｓ凋亡途径上游Ｆａｓ ｍＲＮＡ表达和下游Ｃａｓｐａｓｅ 3活性及不同Ｉ/Ｒ条件下的肝细胞凋亡 ,探讨Ｆａｓ是否参与了肝Ｉ/Ｒ条件下的肝细胞凋亡。一、材料与方法1.实验动物及肝硬化模型的复制[1] :7～ 8周龄雄性ＳＤ大鼠 (中山医科大学动物中心提供 ) ,40只体重 2 0 0～2 3 0 ｇ。腹腔内注射硫代乙酰胺 (中国医药上海化学试剂公司 ,剂量为 2 0 0ｍｇ/ｋｇ体重 ) ,隔天 1次 ,共 10周 ,大鼠自由进食。造模成功后 2周开始…     

低温保存下异搏定对人肝细胞保护作用的实验研究

我们应用钙离子通道阻滞剂异搏定 (ＶＰ)保存成人分离培养的肝脏细胞 ,研究异搏定的保护作用机制 ,明确异搏定的具体作用途径。一、材料和方法1.成人肝脏细胞的分离和培养 :临床行同种异体肾移植时联合切取肝脏 ,以 4℃ＵＷ液 (ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓ ｃｏｎｓｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ)保存 1ｈ。切取肝叶组织 ,剪碎 ,加入胶原酶消化。取出细胞悬液过滤 ,滤液离心弃上清 ,加入ＵＷ液保存。台盼蓝染色 ,计数细胞存活率。2 .细胞内钙的测定 :(1)将肝细胞悬液分为 2组 ,每组又分为 4个小组(ｎ =5 ) ,第 1组分别为含 0ｍｍｏｌ/ＬＣａＣｌ…     

地塞米松对三维培养大鼠肝细胞分泌的影响

三维培养是近年发展起的技术 ,能够模仿体内的结构特点[1 ] 。肝细胞三维培养主要应用于人工生物肝研究及肝细胞疾病基础研究中 ,我们利用该技术研究地塞米松 (ｄｅｘ)对肝细胞形态的影响并探讨其机制。一、材料和方法1.肝细胞球状体 (ＨＳ)的制备 :成年雄性Ｆ344大鼠 ,6周龄 ,15 0～ 2 5 0 ｇ ,采用Ｓｅｇｌｅｎ两步灌注法[2 ] 灌注肝脏 ,以Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液梯度离心获取肝细胞 ,将其以2 .5× 10 2 个细胞 ｍｍ2 密度、无血清Ｗｉｌｌａｍｓ’Ｅ培养基培养于一次性培养皿上 ,5 %ＣＯ2 3 7℃下孵育 3～ 4ｄ后ＨＳ形成。2 .ＨＳ的三维培养[…     

脾脏及促吞噬肽在体外肝细胞培养过程的免疫调控作用

采用门静脉插管Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ⅳ体内灌注，Ｐｒｏｎａｓｅ Ｅ体外Ⅲ内消化以及发离液Ｎｙｃｏｄｅｎｚ梯度离心分离纯化ＳＤ大鼠肝实质、Ｋｕｐｆｆｅｒ和Ｉｔｏ细胞。三种细胞分别加入脾条件兴、脾细胞间液和Ｔｕｆｔｓｉｎ培养一定时间测定其不同指标。结果表明：脾脏通过不同方式参与多种肝细胞的免疫调控。表现在脾脏在对三种细胞ＤＮＡ合成和ＲＮＡ转录促进和抑制；对ｋｕｐｆｆｅｒ细胞合成ＴＮＦａ、ＩＬ１和ＩＬ     

低温保存条件下人肝细胞钙超载途径的研究

细胞内钙超载是导致细胞缺血再灌注损伤的主要原因,对人肝细胞低温保存下钙超载途径的研究报道不多,现有的研究中,对钙超载的途径尚无统一认识。本实验针对这一问题进行了探讨。一、材料和方法1.成人肝细胞的分离和培养:临床行同种异体肾移植时,联合切取肝脏,以4℃ＵＷ液保存。切取灌洗较好的肝叶组织于培养皿中,用剪刀将组织剪碎,收集于锥形瓶中,加入胶原酶10ｍｌ,37℃水浴消化。取出细胞悬液,400μｍ滤网过滤,滤液吹打后加入红细胞裂解液3ｍｌ,1000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,弃上清液,加入保存液10ｍｌ,吹打均匀,37℃孵箱保存。取1ｍｌ细胞悬…     

介绍一种简易的成纤维细胞培养方法

在研究人体细胞生物学、体细胞遗传学和疾病诊断方面 ,成纤维细胞培养日渐成为一种不可缺少的手段。目前 ,有关成纤维细胞的培养方法不尽相同。笔者经多次实验总结出一种相对简易的成纤维细胞培养方法 ,供同道们参考。1　材料和方法手术切取成年健康兔全层皮肤 0 5ｃｍ2 ～1 0ｃｍ2 ,置盛有含 10 %～ 15 %小牛血清ＲＰＭＩ16 40(ＳｉｇｍａＵＳＡ)营养液的容器内 ,在净化工作台下用眼科剪和镊将皮下脂肪组织去除干净 ,以ＰＢＳ或Ｈａｎｋ ｓ液反复冲洗三次 (末次可用ＲＰＭＩ16 40液 ) ,将其剪成 0 5ｍｍ3～ 1ｍｍ3的小块 ,以每块 1ｃｍ的…     

纤维板层型肝细胞癌的临床及病理特征

纤维板层型肝细胞癌 (ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏ ｍａ,ＦＬ ＨＣＣ)是一种临床、病理、预后均具有特点的肝细胞癌 ,以肝癌细胞巢间出现大量平行排列的板层状纤维组织为特点。ＦＬ ＨＣＣ最早由Ｅｄｍｏｎｓｏｎ于 195 6年描述 ,1980年得以认可 ,曾被称为 :嗜伊红肝细胞癌伴板层纤维化、肝细胞癌多角细胞型伴纤维间质、纤维板层颗粒细胞性肝瘤、颗粒性肝细胞瘤等[1] 。ＦＬ ＨＣＣ在肝细胞癌 (ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ,ＨＣＣ)高发地区较罕见 ,而在ＨＣＣ低发的西方国家…     

乳猪肝细胞旋转培养的意义

我们采用普通培养箱对乳猪肝细胞进行旋转培养 ,旨在探讨保持肝细胞良好功能和体外大规模培养的简便方法 ,现将结果报道如下。一、材料和方法1.材料 :本地杂种小猪 4头 ,雌雄不限 ,猪龄 10～ 15ｄ ,体重 2 .5～ 2 .9ｋｇ。2 .肝细胞分离 :采用改良的原位两步胶原酶灌注法。3 .旋转培养 :分离的肝细胞用含体积分数为 10 %的新生小牛血清、2 0 0μｇ/Ｌ氢化可的松 ,2 0 0 μｇ/Ｌ肝细胞生长因子、10 μｇ/Ｌ表皮生长因子、10 μｇ/Ｌ神经生长因子、10 0 μｇ/Ｌ胰岛素、2 0 0μｇ/Ｌ先锋必、10万Ｕ /Ｌ青霉素和 10 0μｇ/Ｌ链霉素的ＲＰＭＩ 1…     

兔血吸虫病肝细胞的凋亡及基因调控

细胞凋亡和坏死是细胞死亡的两种形式。细胞凋亡是有核细胞在一定条件下启动自身内部机制而发生的细胞死亡。我们旨在探讨肝细胞的凋亡在血吸虫病肝损伤发病机制中的意义,并为治疗提供理论基础。1.材料和方法:(1)血吸虫病兔动物模型:雄性健康大耳白兔20只,体重2～3ｋｇ,采用腹部敷贴感染血吸虫尾蚴。感染12周后随机取10只兔,麻醉后剖腹取肝组织。5只正常家兔为对照组。(2)免疫组织化学染色:第一抗体为单克隆ＴＮＦα,ＣＦｏｓ和诱导型一氧化氮合酶(ｉＮＯＳ)抗血清,采用Ｓ-Ｐ试剂盒,操作程序按组织化学ＳＰ法常规进行。ＤＡＢ显色,棕褐色为…     

环孢素及山莨菪碱对大鼠原代培养肝细胞酶释放的影响

用ＳＤ大鼠肝细胞原代培养研究了ＣｓＡ及山莨菪碱对肝细胞膜的影响。不同剂量的ＣｓＡ及山莨菪碱加入培养液，培养８、２４小时的取上培养液侧丙氨酸转氨酸、冬氨酸转氮酶、碱性磷酸酶及乳酸脱氢酶，发现ＣｓＡ使肝细胞对ＡＬＴ、ＡＳＴ及ＬＤＨ通透性增加，而山莨菪碱可部分拮抗此作用。     

肝干细胞研究方法进展

当前 ,国外有关肝干细胞 (又称肝祖细胞或肝干 /祖细胞 )研究进展迅速 ,但国内研究甚少 ,主要原因是方法学受限。肝干细胞方法学较为复杂 ,涉及其活化、分离培养、细胞特异性标志物筛选及细胞体内演变的鉴定等。现将有关研究方法进展综述如下。一、分离培养方法 (图 1 )肝干细胞的分离与培养是研究其生物学特性以及通过细胞移植治疗肝病的必要前提 ,因而倍受重视。Ｙａｓｕｉ等[1 ] 从ＬＥＣ(Ｌｏｎｇ ＥｖａｎｓＣｉｎｎａｍｏｎ)大鼠分离肝脏细胞 ,继用胶原酶、蛋白酶Ｅ、胰蛋白酶及ＤＮＡ酶破坏大肝细胞 ,然后将细胞悬液覆盖于 1 .0 35～…     

肝细胞在多孔状乳酸/乙醇酸共聚材料的培养

肝细胞的体外培养 ,在肝病研究中发挥着日益重要的作用。尤其在生物人工肝支持系统 (BLSS)和肝细胞移植中 ,肝细胞的数量和质量至关重要。虽然肝细胞在体内具有巨大的增殖潜能 ,但肝细胞在体外增殖能力差 ,并很快失去其生化功能 ,故在一定程度上限制了肝细胞培养的广泛开展[1 3 ] 。我们与中山大学合作采用高压气体发泡技术制备而成一种新型的多孔状乳酸 /乙醇酸共聚材料 (PLGA) ,观察乳鼠肝细胞在该材料的培养情况。一、动物及试剂1.动物 :1～ 3d龄SD乳鼠 (6～ 7g/只 ) ,2 0只 ,雌雄不限 ,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。2…     

已酮可可碱对大鼠脾切除内毒素血症的干预作用

磷酸二酯酶抑制剂己酮可可碱 (ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅＰＴＸ)为甲基黄嘌呤衍生物 ,它对肿瘤坏死因子 α(ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ,ＴＮＦα)的合成与释放具有抑制作用 ,可减轻炎症过程中的细胞因子级联反应。我们采用脾切除大鼠内毒素血症模型 ,观察脾切除对ＴＮＦα的影响及ＰＴＸ对其抑制作用 ,探讨ＰＴＸ对脾切除大鼠内毒素血症的治疗意义。材料与方法1.动物模型制备及分组 :雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 4 8只 ,体重2 0 0～ 2 5 0ｇ,随机分为 3组 :无脾组 ( 18只 ) ,以 1%戊巴比妥钠麻醉后取左肋缘下切口 ,行全脾切除 ;…     

E-钙粘素在原发性肝细胞癌中表达的研究

我们应用免疫组织化学Ｓ Ｐ法 ,研究Ｅ 钙粘素 (Ｅ Ｃａｄｈｅｒｉｎ)在原发性肝细胞癌中的表达及其与肝癌的侵袭转移、预后的关系 ,结果报道如下。一、对象与方法1.一般资料 :原发性肝细胞癌根治性切除术患者 82例 ,术前未经任何治疗 ,组织选取癌与癌旁交界处。收集患者术前甲胎蛋白 (ＡＦＰ)、ＨＢｓＡｇ、镜下门静脉瘤栓、肿瘤包膜、癌细胞分化程度等指标。对照组为正常肝组织 2 0例 ,取自肝破裂手术切除的正常肝组织。门脉性肝硬化组织活检标本 2 0例。2 .方法 :免疫组织化学染色程序按Ｓ Ｐ试剂盒说明书进行。3.光镜下阳性结果判定 :按…     

异丙酚对原代培养大鼠心肌细胞的毒性作用

异丙酚对在体心血管系统有一定的抑制作用 ,本研究采用原代培养大鼠心肌细胞模型 ,以观察其对离体大鼠心肌细胞的毒性作用。材料与方法心肌细胞的制备与培养[1] 取 2～ 3日龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ,雌雄兼用 ,断颈法处死后无菌条件下摘取心室 ,剪成 1ｍｍ3左右碎块。依次用 0 1%、0 2 %胰蛋白酶磷酸盐缓冲液和 0 0 1%胶原酶磷酸盐缓冲液消化分散细胞 ,弃去前两次细胞悬液 ,将后 5次细胞悬液离心后弃去上清液 ,将沉淀物合并混悬于 10ｍｌＥａｇｌｅＭＥＭ培养基中 ,以每孔 1× 10 6细胞的密度接种于含 10 %小牛血清及青霉素 10 0ｕ/ｍｌ的Ｅａ…     

肝细胞肝癌中血管内皮生长因子及其受体表达的意义及p5 …

目的 探讨ＶＥＧＦ及其受体ＫＤＲ在肝细胞肝癌（ＨＣＣ）的血管生成、生长及转移中的作用及Ｐ５３、ｒａｓ对ＶＥＧＦ表达的调控。方法 用免疫组织化学、原位杂交图像分析的方法研究肝细胞肝癌４５例、肝硬化２１例及正常肝８例的石蜡标本切片，从而探讨ＶＥＧＦ、ＫＤ直癌病理学特点的关系及Ｐ５３、ｒａｓ对其表达的影响。结果 肝癌组中ＶＥＧＦ的表达明显闹于肝硬化组和正常肝组，３组的表达率分别为６４％（２９／４５）、１     

双荧光素染色检测5-氟尿嘧啶及羟基喜树碱诱导的肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

我们用 5 氟尿嘧啶 (5 Ｆｕ)、羟基喜树碱 (ＨＣＰＴ )在体外诱导人肝癌细胞ＳＭＭＣ 772 1产生凋亡 ,并用双荧光染料吖啶橙 /溴乙锭 (ＡＯ/ＥＢ)染色结合ＤＮＡ电泳法进行观察 ,结果报道如下。一、材料与方法将 1× 10 8/ＬＳＳＣ 772 1细胞 (中国科学院上海细胞学研究所 )接种于含体积分数为 10 %小牛血清的ＲＰＭＩ 164 0培养液中 ,于 3 7℃ ,体积分数 5 %ＣＯ2培养 2 4ｈ ,细胞铺满瓶底 ,呈对数生长时加入 5 Ｆｕ、ＨＣＰＴ使二者终浓度分别为75ｍｇ/Ｌ、1ｍｇ/Ｌ ,再继续孵育 ,分别于6、12、2 4、48ｈ观察结果。细胞孵育至特定时间 …     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸及抗KDR抗体对人肝癌细胞系HHCC的生长抑制作用

本研究采用ＶＥＧＦ反义寡核苷酸 (ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ,ＯＤＮ)抑制ＶＥＧＦ分泌及抗ＫＤＲ抗体封闭ＫＤＲ的方法 ,观察它们对体外培养的肝癌细胞系ＨＨＣＣ细胞生长情况的影响 ,以探讨ＶＥＧＦ及其受体在肝细胞癌中的作用。材料与方法1.细胞株 :人肝癌细胞株ＨＨＣＣ由第四军医大学病理学教研室 86 3课题组保存并提供 ,培养于含 10 0ｍｌ/Ｌ胎牛血清的ＲＰＭＩ 16 40培养液中。2 .寡核苷酸及抗体 :ＯＤＮ由上海生工合成 ,ＰＡＧＥ电泳纯化。反义ＯＤＮ为针对ＶＥＧＦ第 3外显子单链区第 37 5 5共 19个碱基设计而成 ,…