表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒pMV—ESAT6．经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后．用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc^2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT—PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（P〈0．05）。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。     

分枝杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因在分枝杆菌中的稳…

卡介苗是全球应用最广泛的疫苗，也是一种能携带多种致病菌保护性抗原表达的疫苗载体。本研究以ＰＵＣ１９为内架，分别克隆入ＢＣＧ分泌抗原８５－Ｂ的调节和信号肽序列、Ｎｅｏ基因序列以及分枝 力质粒复制基因，构建成分枝杆菌－大肠杆菌穿梭质粒ＰＢＣＧ－８０００。该重组质粒在分枝杆菌、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制，并能稳定表达卡那霉素抗性。本研究为把ＢＣＧ和其它分枝杆菌发展成为多价疫苗载体打下基础。     

靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的:构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM03,并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS,小鼠单链IL-12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2-155,通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒;通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.     

分枝杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因在分枝杆菌中的稳定表达

卡介苗（ＢＣＧ）是全球应用最广泛的疫苗，也是一种能携带多种致病菌保护性抗原表达的疫苗载体。本研究以ｐＵＣ１９为骨架，分别克隆入ＢＣＧ分泌抗原８５－Ｂ的调节和信号肽序列、Ｎｅｏ基因序列（编码卡那霉素抗性）以及分枝杆菌质粒复制基因，构建成分枝杆菌－大肠杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－８０００。该重组质粒在分枝杆菌（含ＢＣＧ）、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制，并能稳定表达卡那霉素抗性。本研究为把ＢＣＧ和其它分枝杆菌发展成为多价疫苗载体打下了基础。     

新型大肠杆菌—分枝杆菌穿梭载体的构建及卡那霉素抗性基因？…

用ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅｃａｔｉｏｎ）技术克隆了卡介苗（ＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ，ＢＣＧ）热休克蛋白６５（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ６５，ｈｓｐ６５）启动子序列，构建成穿梭载体ＭＥ－６５。该载体含有分枝杆菌和大肠杆菌的质粒复制基因，ＢＣＧ的ｈｓｐ６５高效启动子序列以有在分析杆菌和大肠杆菌中都能表达的卡那霉素抗性基因，将其转化到耻垢分枝杆菌和ＢＣＧ中均可     

一种新型的表达PPE68蛋白的重组耻垢分枝杆菌载体疫苗的构建及鉴定

目的:构建一种新型的、含结核分枝杆菌(M.S)抗原PPE68的耻垢分枝杆菌载体疫苗.方法:以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组为模板,PCR方法获得Rv3873基因,然后通过克隆构建获得真核表达质粒pVAX-1-Rv3873,最后通过电转化的方法将pVAX1-Rv3873真核表达质粒转化至耻垢分枝杆菌的感受态细胞中获...     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠巨噬细胞产生一氧化氮的影响

目的 探讨耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响.方法 将Balh/c小鼠随机分成生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组,分别注射生理盐水和不同剂量的耻垢分枝杆菌疫苗.取小鼠腹腔巨噬细胞体外培养,化学显色法测定培养上清中一氧化氮的含量.结果 生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组产生的一氧化氮分别为(3.50±3.11)、(16.63±6.47)、(13.97±6.20)和(7.55±2.26)ng/ml,不同剂量疫苗免疫小鼠产生的一氧化氮水平均显著高于对照组(P<0.01).结论 耻垢分枝杆菌疫苗可促进小鼠巨噬细胞产生一氧化氮.     

重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达

目的：探讨携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠IL-12基因质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达。方法：将携带绿色荧光蛋白（GFP）基因质粒（pUV15）的重组耻垢分枝杆菌滴鼻BALB／c小鼠后2周，处死小鼠，观察肺、脾组织中荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布；将携带GLS和IL-12质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫BALB／C小鼠3次，第1次免疫后4周，处死小鼠，用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达，用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平。结果：在BALB／c小鼠肺、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布，以及GLS的表达，并有血清IL-12水平升高和粘膜特异性SIgA的产生。结论：携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在肺和脾组织分布；携带GLS和IL-12的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫小鼠后，可引起呼吸道粘膜特异性抗菌免疫，以及GLS和IL-12的体内表达，为新型疫苗的研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的　构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果　质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论　重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础     

乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析

[目的]利用蛋白质组学方法，识别乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc^2155细胞后差异表达的蛋白质，为进一步探讨乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。[方法]采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc^2155细胞的总蛋白质，用PDQuest7．3．1图像分析软件比较分析，以识别差异表达的蛋白质。[结果]空白对照组有268个斑点，Ethambutol（EMB）处理组有蛋白斑点195个，在相对分子质量和pI值分布的任一区域，EMB处理组蛋白斑点数均少于空白对照组，其中在EMB处理组中特异表达的蛋白质斑点有23个。[结论]乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc^2155细胞的蛋白质组具有差异，这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制并为寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。     

儿童再发性腹痛与幽门螺杆菌感染

目的探讨儿童再发性腹痛与幽门螺杆菌(HP)感染的关系.方法采用ELISA法检测血清中相应的HP-IgG抗体,再对411例阳性患儿进行13C尿素呼气试验(13C-UBT)检查. 结果 2662例儿童,HP-IgG阳性者789例,检出率29.64%;411例HP-IgG阳性患儿13C-UBT阳性者312例,检出率75.91%.男女性别感染率均无显著性差异,P>0.05.结论①儿童HP感染状况不容忽视;②血清学方法可作为初步筛选试验,根据其结果再进行13C-UBT试验判断HP感染状态.两种实验方法结合具有无创、准确、快速、相对经济的优点.     

纯化抗原半定量检测幽门螺杆菌感染

目的 :鉴定并提取幽门螺杆菌 ( Hp)特异性抗原 ,建立测定抗 Hp抗体的半定量免疫酶技术。　 方法 :10株 Hp可溶性蛋白用于十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析 ,凝胶层析提取特异性抗原 ,方阵滴定建立免疫酶方法。纯化抗原与全菌抗原同批检测 136例患者 ,以免疫印迹分析作为金标准。　 结果 :Hp主要特异性抗原分子量为 660 0 0 ,590 0 0 ,310 0 0和2 50 0 0 ,Sephadex G- 2 0 0柱层析第 1峰提取物含其中 3种抗原成分。纯化抗原 EL ISA测定抗 HpIg G,敏感性 98.9% ,特异性 92 .5% ,准确性 97.0 % ,优于应用全菌抗原的检测结果。　 结论 :本实验建立的检测抗 Hp Ig G方法 ,具有敏感、特异、半定量可靠、可目测定性及可用于微量检测等特点 ,值得推广应用     

浙江地区小儿幽门螺杆菌cagA基因变异性研究

目的 研究浙江地区儿童感染的幽门螺杆菌 (Hp)cagA基因的变异性。方法 应用3对不同引物对66例Hp感染患儿胃粘膜Hp菌株通过聚合酶链反应 (PCR)技术 ,分别扩增cagA基因不同DNA片段 ,检测cagA基因阳性 (cagA +)检出率 ;用免疫印迹法检测患儿血清CagA抗体。结果 Hp 菌株cagA基因DNA404bp、349bp、298bp 片段分别经3对引物扩增后 ,cagA +检出率分别为56.1%、39.4%、72.7% ,三者之间差别有显著性意义(χ2=14.63,P<0.01) ,总阳性检出率为90.9%。66例患儿血清CagA抗体阳性率为97.0%。结论 浙江地区儿童感染的Hp菌株cagA基因存在变异性和多态性 ,增加引物对数量进行检测可以提高Hp菌株cagA +检出率。     

大肠杆菌LTB与幽门螺杆菌HSPA融合表达载体的构建与表达

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的包涵体形式融合表达载体。方法 PCR扩增LtB基因,并在其5' 端去掉信号肽,3'端去掉终止子,引入编码YPQD接头,通过PstI BamHI酶切位点重组于PinPoint^TM Xa- Ⅲ载体上,转化E.coli JM109,SDS－PAGE及Western-blot分析其表达。结果 成功构建了LTB融合表达质粒,并将幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与之融合获得了表达。结论 LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内粘膜佐剂特性奠定了基础。     

幽门螺杆菌感染胃炎患者血清miR-155表达与IL-6表达的相关性

目的:探讨幽门螺杆菌(Hp)感染胃炎患者血清miR-155表达与白介素-6(IL-6)表达的相关性。方法:选择2018年8月至2020月2月在辽健集团铁煤总医院消化内科诊治的胃炎患者150例,所有患者均给予Hp检测、血清miR-155与IL-6表达检测。结果:在150例患者中,Hp阳性72例,阳性率为48.0%。Hp阳性患者的血清miR-155相对表达量与IL-6含量为(15.83±1.42)pg/ml和(29.47±4.68)pg/ml,高于Hp阴性患者的(2.41±0.76)pg/ml和(11.86±4.67)pg/ml(P<0.001)。在Hp阳性患者中,Pearson相关分析显示血清miR-155相对表达量与IL-6含量存在正相关性(r=0.564,P=0.004)。logistic回归分析显示miR-155(OR=1.499)、IL-2(OR=1.097)为胃炎患者Hp阳性的主要独立影响因素(P<0.05)。结论:胃炎Hp阳性患者多伴随有血清miR-155与IL-6的高表达,两者存在正相关关系,且都是胃炎患者Hp阳性的主要独立危险因素。     

幽门螺杆菌毒性噬菌体分离纯化及模拟治疗研究

目的分离纯化幽门螺杆菌(Hp)的野生型毒性噬菌体,并采用体外模拟试验,探讨借口腔Hp保护噬菌体突破胃液屏障、释放子代噬菌体、侵染并治疗胃肠Hp感染的方法。方法以烛缸法培养Hp,用单层平板和双层平板实验分离纯化噬菌体,采用体外模拟胃液环境处理对照组噬菌体和Hp保护的实验组噬菌体,以双层平板实验检测处理后噬菌体的杀菌效果。结果经过模拟胃液处理后,噬菌体溶菌活性随处理时间延长而降低,处理1.5h的实验组依然可形成噬斑,对照组不形成噬斑。结论口腔Hp可以帮助噬菌体抵抗胃液。     

幽门螺杆菌ureB基因表达产物的反应原性

目的：克隆幽门螺杆菌ureB基因，并进行表达，验证表物的反应原性。方法：应用PCR技术从技术临床分离株中扩增出ureB基因，克隆入载体pGEM-7zf( ）进行测序，进一步转到友大肠杆菌表达载体pBV220进行诱导表达，以Western blot实验验证重组蛋白的反应原性。结果：测序后经同源性比较，证实扩增后得到的片断确为ureB基因，并原核表达出可被抗Hp抗体识别的非融合重组蛋白。结论：获得了有反应原性的重组ureB蛋白。     

含左氧氟沙星四联疗法治疗十二指肠溃疡60例对照观察

目的 比较左氧氟沙墨四联与奥美拉唑三联疗法治疗幽门螺杆菌(Hp)阳性十三指肠球部溃疡的临床疗效.方法将60例经内镜诊断并检测证实Hp阳性的十二指肠溃疡患者随机分为两组.左氧氟沙星组(30例为治疗组):左氧氟沙星200mg 呋喃哇酮200mg 法莫替丁20mg 果胶铋100mg,2次/d,共7d,继而服用法莫替丁20mg,2次/d,连用3周.奥荚拉唑组(30例为对照组):奥美拉哇20mg 甲硝唑400mg 克拉霉素500mg,2次/d,共7d,继而服用奥美拉唑20mg,2次/d,连用3周.疗程结束4周后复查胃镜、检测Hp;并于治疗第1周和第3周观察症状缓解情况及用药后的不良反应等.结果 治疗组和对照组治疗第1周和第3周的症状缓解情况以及症状消失时间差异均无统计学意义(P>0.05).对照组和治疗组的渍疡愈合率分别为73.3%和76.6%,而Hp根除率分别为83.3%和80%,两组间差异无统计学意义(P>0.05).两组用药后不良反应均较少,有较好的安全性.结论 左氧氟沙星四联疗法治疗Hp阳性的十二指肠溃疡安全有效且费用低廉.     

胃癌组织幽门螺杆菌vacA基因型的分布及其与CDX2表达的关系

目的筛查辽宁地区胃癌患者幽门螺杆菌(Helicobacte pylori,H.pylori)vacA优势基因型并了解其对CDX2表达的影响,为胃癌的发生机制及因型施治提供实验室依据。方法采用GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT试剂盒提取173例H.pylori阳性石蜡包埋胃癌组织的DNA;采用PCR检测H.pylori不同vacA基因型分布情况,采用免疫组化方法检测胃癌组织CDX2蛋白表达。结果在胃癌中vacAs1,vacAm1,vacAs1m1亚型分布高于其他亚型(P0.05),其中vacAm1,vacAs1m1与肿瘤分化程度密切相关,二者在高分化组的分布低于中低分化组(P0.05),vacAm1在男性患者中分布高于女性(P0.05);年龄大于60岁、高分化和肠型胃癌与CDX2的表达呈正相关(P0.01);CDX2的低表达与vacAm1,vacAs1,vacAs1m1基因型密切相关(P0.05)。结论 vacAm1,vacAs1与vacAs1m1是辽宁地区胃癌发生的优势基因型,vacAs1m1阳性的H.pylori患者及男性vacAm1 H.pylori阳性感染者可能抑制CDX2的表达进而促进胃癌的恶性分化。