切应力作用下与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的前列环素分泌变化

目的：研究切应力作用下与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的抗凝血功能。方法：应用流动腔系统,对与平滑肌细胞联合培养的同皮细胞施加生理大小的切应力,以放免分析法检测内皮细胞分泌ＰＧＩ２的变化。结果：ＰＧＩ２峰值释放速率及稳定释放速率随切应力的增大而增高,峰值释放速率的衰减常数（ｔ１／２）随切应力的增大而减小。结论：切应力作用下,与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的抗凝血功能增强。     

与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞外基质构筑及含量的变化

目的：探讨联合培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）对内皮细胞（ＥＣ）粘附能力的影响。方法：应用免疫荧光细胞化学、激光共聚焦扫描显微镜和图像分析等技术,以静态条件下单独培养的ＥＣ为对照组,观察与ＶＳＭＣ联合培养的ＥＣ细胞外基质Ｆｎ,Ｌｎ和ＣｏｌⅣ的构筑方式及其含量的变化。结果：与单独培养的ＥＣ相比,联合培养的ＥＣ细胞外基质各组分的构筑有明显的变化,且含量也发生变化,Ｆｎ,Ｌｎ增多,ＣｏｌⅣ减少。结论：与ＶＳＭＣ联合培养的ＥＣ的粘附能力可能增强,为改进血管ＥＣ种植的组织工程技术提供了部分实验依据。     

切应力作用下联合培养的血管内皮细胞血管假性血友病因子的含量变化

目的：研究切应力对与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的抗凝血和粘附的影响。方法：对与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞施加生理范围的切应力,用免疫组化及图像分析法检测内皮细胞的血管假性血友病因子（ｖＷＦ）含量。结果：联合培养的内皮细胞ｖＷＦ的变化与切应力大小及作用时间有关,随切应力增大,胞内ｖＷＦ含量逐渐减少,且切应力作用的第１小时减少的最快。结论：生理范围的切应力作用,可能减少与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的ｖＷＦ表达,或促使ｖＷＦ短时释放加快,有利于增强抗凝血功能及内皮细胞的粘附。     

流体切应力对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的探讨流体切应力（SS）对体外培养的血管平滑肌细胞（VSMC）形态学影响。方法运用倒置相差显微镜和免疫组化ABC方法对VSMC进行鉴定，采用荧光显微镜和TuNEL—AP方法观察其变化。结果组织块贴壁法培养的VSMC呈典型的长梭形，α—actin染色显示95％以上VSMC呈阳性；SS强度分别为1．041、4．767和10．389dyne／cm^2冲击VSMC12h其凋亡百分率分别为（1．56±0．28）％、（1、95±0．23）％和（2、62±0．49）％，而对照组分别为（0、61±0．12）％、（0．55±0．16）％和（0、64±0．24）％，两组比较差异有统计学意义（P〈0.01），随着冲击时间的延长凋亡细胞有进一步增多的趋势。结论VSMC大量凋亡可由SS所诱导，颅内动脉瘤组织内VSMC过度凋亡可能与局部升高的SS密切相关。     

联合培养的内皮细胞对平滑肌细胞增殖和形态的影响

目的探索体外培养和扩增同一来源内皮细胞和平滑肌细胞的有效方法,研究联合培养的内皮细胞对平滑肌细胞形态和增殖的影响。为研究内皮细胞和平滑肌细胞相互关系和体外构建组织工程血管提供理论和实践基础。方法在体外用酶消化法和组织块贴壁法分别建立内皮细胞和平滑肌细胞的原代,并应用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠传代培养。应用光镜、透射电镜、细胞计数和MTY法对内皮细胞和平滑肌细胞的形态和代谢进行研究。模拟血管壁的内层结构及内皮细胞和平滑肌细胞间的相互影响途径,建立以聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜为介质的内皮细胞与平滑肌细胞联合培养模型。分3组：内皮细胞／平滑肌细胞、平滑肌细胞／平滑肌细胞和空白／平滑肌细胞,应用。H—TdR掺入法研究联合培养的内皮细胞对平滑肌细胞增殖的影响。结果酶消化法和植块培养法可以有效地建立起内皮细胞和平滑肌细胞的原代。内皮细胞对联合培养的平滑肌细胞早期增殖有促进作用,晚期则增殖缓慢。结论以PET膜为介炙联合培养同一来源的内皮细胞和平滑肌细胞的新模型是研究两者间相互影响的良好模型。内皮细胞和平滑肌细胞作为血管构成的基本细胞,对于它们的形态学、体外培养和扩增以及相互关系的研究具有重要的意义。     

血管内皮-平滑肌细胞双层联合培养模型的改进

目的　建立并改进血管内皮和平滑肌细胞双层联合培养模型 ,为进一步研究血管内皮和平滑肌细胞间的信号传递奠定基础。方法　先分别单独培养大鼠主动脉血管内皮和平滑肌细胞 ,然后分别培养在聚乙烯细胞培养微孔滤膜两面 ,并以不同的比例重叠。结果　两种细胞重叠 1 3、2 3和 10 0 %,以孔径分别为 1 0或 3 0 μm微孔滤膜对两种细胞进行双层联合培养后 ,对内皮细胞的影响不明显 ,但对平滑肌细胞的影响则十分显著 ,细胞形态以“收缩型”为主 ,肌纤维增多 ,生长速度较单独培养时慢 ,形成单层贴壁细胞的时间延长 12～ 18h ,无明显“峰 谷”状态形成。结论　改进后的联合培养方法经济、简便 ,更适合于研究血管内皮和平滑肌细胞间的信号传递     

切应力作用下脐静脉内皮细胞的流变特性

用流室法研究人工培养脐静脉内皮细胞在切应力作用下的变形特性。对脐静脉内皮细胞分别施加０．６、３．８及７．５Ｐａ的切应力，作用１２小时，通过实时显微观测和计算机图象分析，结果证明切应力为３．８或７．５Ｐａ。作用１２小时后内皮细胞被拉长，长轴与流场方向一致，并且内皮细胞的拉长与定向程度，切应力大小及其作用时间的长短有关。     

血管平滑肌细胞和内皮细胞联合种植生物可降解材料的组织工程血管研究

目的探讨应用组织工程学方法构建人工血管片。方法应用聚(乙交酯/丙交酯)二元共聚物(PLGA)无纺网织片作为细胞支架,体外逐层顺序种植血管平滑肌细胞、内皮细胞制作组织血管片。免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞、内皮细胞;扫描电镜观察组织血管片生长情况;放射免疫方法检测内皮细胞分泌内皮素、前列腺素E的功能。结果免疫组织化学染色鉴定平滑肌细胞肌动蛋白染色阳性,内皮细胞凝血Ⅷ因子相关抗原染色阳性。组织血管片在扫描电镜下显示出细胞融合,连接成片。放射免疫方法可以检测出平滑肌细胞和内皮细胞联合培养的组织片分泌内皮素(229pg/ml±34pg/ml),分泌前列环素的代谢产物6-酮-前列腺素F1α(402pg/ml±108pg/ml)。结论应用PLGA无纺网织片作为细胞支架,体外逐层种植血管平滑肌细胞、内皮细胞制作的组织血管片,基本具备正常血管组织基本形态结构和功能。     

切应力作用下脐静脉内皮细胞的流变特性

用流室法研究人工培养脐静脉内皮细胞在切应力作用下的变形特性。对脐静脉内皮细胞分别施加０．６、３．８及７．５Ｐａ的切应力，作用１２小时。通过实时显微观测和计算机图象分析，结果证明切应力为３．８或７．５Ｐａ，作用１２小时后内皮细胞被拉长，长轴与流场方向一致；并且内皮细胞的拉长与定向程度、切应力大小及其作用时间的长短有关。     

内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖的影响。方法：采用6%羟乙基淀粉沉降红细胞和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁并向EPCs分化;采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定EPCs,间接免疫荧光检测VSMCs收缩表型标志物α-SM-actin和calponin的表达;Transwell培养板建立早期EPCs和大鼠VSMCs共培养模式,以20%胎牛血清刺激VSMCs增殖,分别共培养6,12,24,48,72 h后收集VSMCs,采用BrdU标记法、蛋白定量、流式细胞术分析VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量以及细胞周期进程。结果：从脐血单个核细胞成功培养了EPCs。EPCs和大鼠VSMCs共培养12,24,48,72 h后,VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量均较对照组明显降低(P＜0.05),其中以48 h最明显;流式细胞术显示,共培养组VSMCs细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著降低(P＜0.05),而细胞周期中G1期细胞所占百分率均相应高于对照组(P＜0.05),其中均以48 h最明显。结论：早期EPCs能够抑制VSMCs增殖。     

缝隙连接在血管平滑肌细胞内皮源性超极化中的作用

目的：研究乙酰胆碱(ACh)对与血管内皮细胞(EC)混合共培养的平滑肌细胞(SMC)的电生理作用．方法：培养主动脉EC和SMC，利用常规全细胞膜片钳技术记录其膜电位和膜电流．再记录ACh对两的作用，并与其对混合共培养中SMC的作用作对比，加入缝隙连接和NO合成酶阻断剂，判断其作用机制．结果：ACh可以使得EC膜电位超极化并可引出一个外向电流，但对SMC没有作用；ACh对混合共培养中的SMC膜电位有一个超极化作用，此作用对NO合成酶阻断剂硝基精氨酸(L-NNA)不敏感，而对TEA或缝隙连接阻断剂1813-甘草次酸(18β-GA)敏感．结论：ACh对SMC产生内皮源性超极化作用可能与SMC上KCa开放有关，且该内皮源性超极化作用与EC与SMC之间的缝隙连接有密切的关系．     

Different responses of cell cycle between rat vascular smooth muscle cells and vascular endothelial cells to paclitaxel

Summary： Although previous reports showed dmg-eluting stent （DES） could effectively inhibit neointima formation, in-stent restenosis （ISR） remains an important obstacle. The purpose of this study was to investigate different effects of paclitaxel on proliferation and cell cycle regulators between vascular smooth muscle cells （VSMCs） and vascular endothelial cells （VECs） of rats in vitro. The cultured VSMCs and VECs of rats from the same tissues were examined by using immunohistochemistry, flow cytometry and Western blotting in control and paclitaxel-treated groups. The results showed paclitaxel could effectively inhibit proliferation of VSMCs and VECs. However, as compared with VECs, prolif- eration of VSMCs in paclitaxel-treated group decreased less rapidly. The percentage of cells in G0-G1 and G2-M phases was reduced, and that in S phase increased after treatment for 72 h. The expression of cyclin D1 and B1, p27 and PCNA in VSMCs of paclitaxel-treated group was up-regulated, but that of p21 down-regulated as compared with VECs. It is concluded that there are significant differences in the expression of cell cycle regulators and proliferation rate between paclitaxel-treated VSMCs and paclitaxel-treated VECs, suggesting that the G1 S checkpoint regulated by paclitaxel may play a critical role in the development of complications of DES, which provides new strategies for treatments of ISR.     

内皮细胞和平滑肌细胞在微孔聚碳酸酯膜上共培养模型方法

目的 探讨主动脉内皮细胞（EC）和平滑肌细胞（SMC）共培养模型，为下一步研究两之间的电生理活动提供基础。方法 采用微孔聚碳酸酯膜（polycarbonate filter membrane）作为载体，将EC和SMC接种于微孔膜的两侧，建立EC和SMC联合培养模型，模拟血管壁EC和SMC间的结构关系，采用倒置显微镜和透射电镜进行观察。结果 共培养的EC和SMC组织结构关系类似于体内，EC呈单层生长，而SMC呈多层生长，同类和异类细胞间都有缝隙连接形成，缝隙连接的形成与培养的时间有关，在SMC接种后24h，EC可以通过微孔与SMC形成缝隙连接。结论 此种EC和SMC共培养模型模拟了在体时EC和SMC之间的结构关系，可以用来研究两种细胞间的相互影响。     

低氧刺激复合培养的平滑肌细胞表达Janus激酶

目的：研究低氧对复合培养的平滑肌细胞中Janus激酶（JAK）基因表达的作用。方法：鼠肺微血管内皮细胞与肺动脉平滑肌细胞复合培养，采用半定量RT－PCR技术检测常氧组、低氧2、6、12h组的JAK1、JAK2和JAK3基因的表达水平，并对PCR产物进行测序。结果：低氧复合培养2h组肺动脉平滑肌细胞中JAK1、JAK2、JAK3 mRNA表达水平升高，在低氧6h组达最高，与正常组比较均有明显差别。低氧12h组的表达量低于6h组，但高于正常组。RT－PCR产物直接测序证实扩增产物片断与Genebank中相应序列相同。结论：低氧增强复合培养的肺动脉平滑肌细胞中JAK基因的表达，而JAK基因在低氧所致的肺动脉收缩和低氧肺动脉高压的信号转导中可能发挥重要作用。     

雷帕霉素联用阿托伐他汀减轻大鼠血管平滑肌细胞氧化应激损伤

目的探讨雷帕霉素与阿托伐他汀联用对大鼠血管平滑肌细胞氧化应激损伤的影响。方法取大鼠血管平滑肌细胞进行实验,随机分为空白对照组、DMSO组、阿托伐他汀（3Ixmol／L）组（A3组）、雷帕霉素50nmol／L组（R50组）、雷帕霉素100nmol／L组（R100组）、联用组（阿托伐他汀加雷帕霉素100nmol／L）。实验各组细胞给予相应药物干预2h后,加入三丁过氧化氢（t-BHP）刺激诱导氧化应激损伤,24h后检测各项指标。结果与空白对照组相比,DMSO组细胞SOD活力、MDA含量及β—Gal染色率差异无统计学意义,而其细胞增殖率降低（P〈0．01）。各药物干预组细胞SOD活力、MDA含量、β—Gal染色率和细胞增殖率与空白对照组和DMSO组比较差异均有统计学意义（P均〈0．05）;而A3组和R50组比较上述指标差异无统计学意义。R100组与A3组和R50组比较上述指标差异有统计学意义（P均〈0．05）;联用组细胞SOD活力较其余各组明显升高（P〈0．01）,而MDA含量、β—Gal染色率和细胞增殖率较其余各组则均明显降低（P均〈0．05）。而内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在大鼠血管平滑肌细胞中无表达。结论在氧化应激状态下,阿托伐他汀及雷帕霉素均具有抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖、抗氧化损伤的作用,从而维护血管平滑肌细胞的正常功能并能延缓其衰老,两药联用的效果优于两药单独应用。     

改良组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的以简捷、高效的方法获取原代和传代的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),为进一步的科学研究提供实验材料。方法采用改良的组织块贴壁法培养原代大鼠VSMC,2.5 g.L-1胰蛋白酶消化传代,并用相差显微镜、电镜、荧光显微镜及激光共聚焦显微镜对细胞进行鉴定。结果95%的组织块接种成活,相差显微镜下细胞呈典型的"峰-谷"状生长,胞体长梭形;电镜下可见粗、细肌丝沿细胞长轴平行排列;荧光显微镜及激光共聚焦显微镜检测α-肌动蛋白可见细胞胞浆内呈阳性显色,细胞核不显色。结论本方法培养VSMC简便、易操作,获得的细胞纯度和成活率较高。