SIGIRR过表达抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞NF-κB的活化

目的: 研究单免疫球蛋白白介素1受体相关蛋白(SIGIRR)对脂多糖(LPS)刺激的肺泡上皮细胞核因子-κB信号通路的调节作用。方法: 以LPS刺激人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549。将含有SIGIRR cDNA 全长的真核表达载体瞬时转染A549细胞,使SIGIRR在A549细胞过表达。用双萤光素酶报告系统检测LPS刺激后A549细胞NF-κB的转录活性,用ELISA法检测LPS刺激后细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)的水平,对比转染与否对上述因子在A549细胞中释放水平的影响。结果: 在A549细胞中,过表达SIGIRR可显著抑制NF-κB的转录活性,同时抑制LPS诱导的细胞因子IL-1β、TNF-α以及IL-6的表达。 结论: SIGIRR过表达可以抑制LPS触发的肺泡上皮细胞中TLR4信号的转导,从而发挥减轻炎症反应、保护肺泡上皮细胞的作用。     

LPS致大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB促进TNF-α分泌

目的: 观察脂多糖（LPS）致大鼠肺泡巨噬细胞（AMs）中核因子NF-κB活性及其调控肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌的作用。 方法: LPS作用大鼠AMs后，用电泳迁移率改变分析法（EMSA）测NF-κB活性；用特异的反义寡核苷酸阻断NF-κB亚基（p65）后，Western blotting检测p65表达变化；ELISA法检测细胞上清中TNF-α的含量。 结果: 于LPS作用AMs后4 h，NF-κB活性达到峰值，24 h仍维持在高水平；作用后4 h上清中TNF-α的含量达到峰值。反义寡核苷酸阻断NF-κB亚基（p65）表达后，LPS致AMs上清中TNF-α的含量显著低于未阻断组（P<0.01）。结论: LPS致大鼠AMs中NF-κB正向调控TNF-α分泌。     

流体剪切力通过下调p21促进 MC3T3-E1成骨细胞增殖

目的 探讨流体剪切力(fluid shear stress, FSS)对成骨细胞p21表达的影响,并明确p21在FSS诱导的成骨细胞增殖过程中的作用。方法 对成骨细胞加载不同时间(0、15、30、45、60 min)、1.2 Pa FSS。用CCK-8实验、EdU实验检测成骨细胞增殖活性。用siRNA p21或pcDNA p21转染成骨细胞,并用Western blotting检测转染效果。Western blotting检测不同干预条件下p21、cyclin D1、CDK4的表达变化。结果 加载1.2 Pa FSS后,p21表达显著下调,且加载45 min后表达水平最低。加载FSS和下调p21表达都显著增强成骨细胞增殖,并增加cyclin D1、CDK4表达。而上调p21表达后,加载FSS不再具有增强成骨细胞增殖和增加cyclin D1、CDK4表达的作用。结论 1.2 Pa FSS能够下调成骨细胞p21表达,在加载45 min时下调最为明显。p21下调对成骨细胞增殖具有促进作用,且FSS通过下调p21促进成骨细胞增殖。     

辛伐他汀通过NF-κB p65通路影响食管癌细胞增殖

目的:探究辛伐他汀(SIM)通过NF-κB p65通路对食管癌Eca109细胞增殖的影响。方法:采用不同浓度(2、4、8、16和32μmol/L)SIM处理食管癌Eca109细胞,MTT法检测食管癌Eca109细胞活力的变化,平板集落形成实验检测食管癌Eca109细胞平板集落形成率,Western blot法检测食管癌Eca109细胞增殖相关蛋白细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、c-Myc及NF-κB p65通路中p65和IκB-α蛋白的表达水平,ELISA法检测食管癌Eca109细胞培养上清液中NF-κB p65通路下游调控因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的水平。结果:与对照组比较,2、4、8和16μmol/L SIM对食管癌Eca109细胞活力的抑制呈浓度及时间依赖性(P<0.05),同一时点,16和32μmol/L SIM对食管癌Eca109细胞活力的抑制率无显著性差异(P>0.05)。16μmol/L SIM作用48 h时对食管癌细胞活力的抑制率为50.61%,接近半数抑制量IC50,因此采用该浓度及时间用于下游实验。与对照组比较,8...     

pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体的构建及蛋白表达

目的克隆NF-κB(p65)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/NF-κB(p65),并进行体外表达研究。方法提取B16总RNA,RT-PCR扩增出NF-κB(p65)基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染到B16细胞中,Real-time PCR和Western-blot检测NF-κB(p65)的抗原性和表达量。结果获得高质量的B16总RNA,RT-PCR扩增出1.65kb的cDNA片段,成功构建了pcDNA3.1/NF-κB(p65)载体,Blast序列分析与GenBank中NM_009045.4完全一致。NF-κB(p65)重组蛋白具有抗原性,其基因和蛋白表达高于B16细胞组和空质粒pcDNA3.1组。结论成功构建pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体和表达出具有NF-κB(p65)抗原性的重组蛋白。     

神经钙调蛋白介导IL-1β诱导的NF-κB p65的表达及神经毒性

目的：探讨神经钙调蛋白在白细胞介素-1β(IL-1β)和兴奋性氨基酸（NMDA）诱导皮层神经元NF-κΒ表达及神经损伤机制的作用。 方法： 应用IL-1β或NMDA诱导原代培养的胎鼠皮层神经元损伤；通过MTT法、LDH释放率测定观察细胞生存力和损伤程度；通过Western blotting分析NF-κB p65的表达；通过膜联蛋白（Annexin V）和碘化丙啶（PI）免疫荧光法观察细胞凋亡或坏死程度。 结果： MTT和LDH释放率测定结果表明， IL-1β和NMDA都可分别引起神经细胞的生存力明显下降，并呈量效依赖关系。IL-1β和NMDA在引起细胞损伤的同时都可促进NF-κΒ p65的表达。应用神经钙调蛋白抑制剂CsA明显抑制IL-1β引起的细胞损伤，也明显抑制IL-1β诱导的NF-κB p65表达增加。但是，环孢菌素A(CsA)不能明显抑制NMDA诱导的细胞损伤（P>0.05），对NMDA诱导的NF-κΒ p65的表达的抑制作用也不明显。Annexin V 和 PI免疫荧光检测表明，IL-1β诱导的神经损伤以神经元凋亡为主，而NMDA则主要引起坏死。 结论： 神经钙调蛋白参与介导IL-1β诱导的NF-κΒ p65的表达及神经细胞凋亡，但对NMDA诱导的神经元坏死则不起主要作用。说明神经钙调蛋白是细胞凋亡信号通路中重要分子。     

LPS诱导肺微血管内皮细胞ICAM-1的表达及NF-κB作用的实验研究

目的研究LPS诱导的肺微血管内皮细胞 (PWVEC)ICAM -1的表达及调控机制。方法100ng/mlLPS刺激PMVEC0h、2h、4h、6h、8h或10ng/ml、50ng/ml、100ng/mlLPS刺激6h ,免疫细胞化学检测PMVECICAM -1的表达。凝胶电泳迁移率变化分析检测NF -κB的活化。并通过加入活化阻断剂PDTC观察对PMVECICAM -1表达的影响。结果PMVECICAM -1的表达与LPS的刺激呈时相 -剂量依赖方式。LPS的刺激迅速活化NF -κB ,60min达到高峰 ,后逐渐下降。PDTC能显著降低ICAM -1的表达 (P<0 .01)。结论LPS刺激诱导NF-κB的活化 ,启动ICAM -1的合成表达。     

NF-κB信号通路在骨及相关疾病中的作用的研究进展

NF-κB是一类核转录因子,可与其靶基因启动子区的DNA序列结合,而启动基因转录的功能。它们广泛参与胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、免疫反应、炎症反应、病毒感染等过程。目前研究已经证实NF-κB信号通路在骨的发育和形成中具有重要的调控作用,NF-κB信号通路的阻断可导致骨发育异常或相关疾病的发生。NF-κB通过调控成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和软骨细胞的增殖、分化和凋亡等生物学过程,调控骨的发育和重塑,并在骨相关疾病的发生中发挥重要的调控作用。     

槐定碱抑制LPS诱导巨噬细胞株NF-κB表达

 摘 要：目的 观察槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IKKβ,IκBα,NF-κB P65及TNF-α表达的影响,探讨其抗内毒素机制。方法 培养RAW264.7巨噬细胞,分为对照组、槐定碱对照组、LPS组、槐定碱干预组。槐定碱干预组加入LPS100μg/L孵育1h,弃去LPS后加入槐定碱15.63mg/L,作用5、30、60、120min,分别获取细胞与培养液。RT - PCR与Western Blot分别检测NF-κB等的mRNA与蛋白表达,放免法检测培养液中TNF-α含量。结果 LPS组各时间点IKKβ、pIκBα、NF-κB P65 mRNA和/或蛋白表达及TNF-α含量均显著高于同时间点对照组(P < 0.01);槐定碱干预组以上因子mRNA和/或蛋白表达及TNF-α含量均较同时间点LPS组显著回落(P < 0.01)。结论 槐定碱调控LPS激活的巨噬细胞NF-κB通路IKKβ、IκBα、NF-κB P65等分子的表达,进而抑制下游TNF – α分泌是其抗内毒素作用机制之一。     

人参二醇组皂苷对脂多糖攻击大鼠脑皮质NF-κB的影响

目的： 观察人参二醇组皂苷对脂多糖(LPS)攻击大鼠脑皮质NF-κB的影响。方法: 大鼠随机分为实验对照（control）组、脂多糖（LPS）组、脂多糖加地塞米松（LPS+Dex）组和脂多糖加人参二醇组皂苷（LPS+PDS）组。大鼠静脉注射LPS（4 mg·kg^-1）1 h、4 h后检测脑皮质NF-κB的变化。结果:EMSA实验显示人参二醇组皂苷可抑制LPS攻击后1 h、4 h NF-κB的DNA结合活性；抑制细胞核p65和p50蛋白的表达。结论:LPS休克早期脑组织细胞NF-κB激活入核，人参二醇组皂苷通过抑制其活性而减轻脑组织损伤。     

胃腺癌组织中survivin、NF-κB p65和p27的表达及其相关性

目的 探讨survivin、NF-κB p65和p27在胃腺癌组织中的表达及其相关性研究.方法 用免疫组化SP法检测73例胃腺癌及20例正常胃黏膜组织中survivin、NF-κB p65和 p27的表达情况.结果 (1) survivin 和NF-κB p65在胃腺癌中蛋白表达阳性率分别为46.6%(34/73)和58.9%(43/73),明显高于它们在正常胃黏膜组织中的阳性表达率(0,0/20)和(20%,4/20)(P均＜0.01);p27在胃腺癌中蛋白表达阳性率为41.1%(30/73),明显低于它在正常胃黏膜组织中的阳性表达率(95.0%,19/20)(P＜0.01);(2) survivin与胃腺癌浸润深度、淋巴结转移及临床分期呈正相关(P均＜0.05),而与组织分化程度无明显相关性(P＞0.05);NF-κB p65与胃腺癌分化程度呈负相关(P＜0.05),与胃腺癌浸润深度、淋巴结转移及临床分期呈正相关(P均＜0.05);p27与胃腺癌浸润深度、淋巴结转移及临床分期呈负相关(P均＜0.01),与组织分化程度无关(P＞0.05);(3)胃腺癌中survivin的阳性表达率与NF-κB p65的阳性表达率呈正相关(P＜0.05),而与p27的阳性表达率呈负相关(P＜0.05); NF-κB p65与p27的阳性表达率无相关性(P＞0.05).结论 survivin、NF-κB p65和p27基因在胃腺癌的发生发展中起着不同程度的作用;联合检测survivin、NF-κB p65和p27,有助于对胃腺癌恶性程度的判定及侵袭转移能力的评估,进而为胃腺癌的预后分析和临床治疗提供依据.     

RNAi沉默NF-κB p65对小鼠巨噬细胞细胞因子表达的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术在抑制NF-κB p65表达、调控LPS活化后巨噬细胞细胞因子表达中的应用.方法:利用阳离子脂质体将NF-κB p65小干扰RNA(siRNA)瞬时转染入Ana-1细胞,RT-PCR及Western blotting法检测其沉默效率,ELISA法检测LPS(1 mg/L)刺激下0 h、4 h、12 h和24 h Ana-1细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10浓度.结果:NF-κB p65 siRNA转染24 h后,NF-κB p65在基因水平及蛋白水平表达均被明显抑制(P<0.05).RNA干扰组Ana-1细胞培养上清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达在相应时点内均较对照组明显降低(P<0.05),IL-10表达显著升高,在12 h和24 h差异显著(P<0.05).结论:体外实验初步证实RNAi技术能有效沉默小鼠巨噬细胞NF-κB p65基因的表达,下调其下游调控的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及上调抑炎症细胞因子IL-10的表达,从而抑制过度的炎症反应.     

螺杆菌感染与NF-κB p65蛋白表达相关性在人食管癌发生中的意义

目的研究人食管癌是否存在螺杆菌感染及其与NF-κB p65蛋白的关系,从而探讨在人食管癌发生中的意义。方法随机收集食管癌标本40例和正常食管标本10例,采用聚合酶链反应(PCR)扩增螺杆菌16S rRNA,随机选4例测序及同源比较。阳性者再扩增幽门螺杆菌(H.pylori, Hp)的特异基因相对分子质量(M_r)26×10~3的种特异性抗原和相关功能基因(CagA,VacA)。并采用免疫组化法检测食管癌组织中NF-κB p65蛋白的表达情况。结果32.5%(13/40)的食管癌组织中发现有螺杆菌16S rRNA基因存在,正常人食管组织无一例阳性。4例测序及同源比较,食管癌组织中螺杆菌序列与H.pylori的16S rRNA序列有99%～100%同源性。阳性标本均扩增出Hp特异基因M_r 26×10~3种特异性抗原,但仅2例扩增出CagA基因,3例扩增出VacA基因。免疫组化法染色显示,16S rRNA阳性的食管癌组织中NF-κB p65蛋白表达率为100%(13/13),而16S rRNA阴性食管癌组织表达率仅占18.5%(5/27),二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论食管癌患者食管组织存在螺杆菌感染,该螺杆菌可能为Hp。螺杆菌感染导致食管黏膜NF-κB p65蛋白表达的增加,可能在食管癌生成中作为信号传导机制之一。     

NF-κB与TNF诱导的细胞凋亡

不同类型的细胞对于TNF-α诱导的细胞凋亡的敏感性可以有很大差别,但是多数的细胞在同时给予蛋白质合成抑制剂处理时会对TNF-α变得非常敏感。有学者认为有一个基因或一组基因在TNF受体活化后被诱导而传导细胞凋亡信号。近期的研究表明,一种被TNF激活的NF-κB转录因子在这一过程中起部分的作用。该发现把NF-κB原先只作为免疫和炎症反应调控因子的功能拓宽到了也可参与细胞凋亡的调控。     

NF-κB参与脂多糖致永生化小鼠脑血管内皮细胞通透性增高的调控

目的:探讨脂多糖(LPS)对永生化小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3通透性的影响及可能的机制.方法:实验分3组:bEnd.3细胞组、bEnd.3/vector细胞组和bEnd.3/muIκBα细胞组,后2组中分别转染空载pcDNA3.1hygro质粒和IκBα显性负性突变体DNMu-IκBα质粒.利用报告基因法、跨内皮细胞电阻抗(TEER)法、直接荧光染色法和免疫印迹(Western blotting)法分别检测LPS对细胞的NF-κB活性、细胞通透性、骨架蛋白F-actin分布、紧密连接蛋白(ZO-1和claudin-5)表达以及肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化水平的影响.结果:bEnd.3组和bEnd.3/vector组细胞中,LPS作用0.5 h可引起NF-κB活化(P<0.05);3 h时细胞TEER开始下降(P<0.05),并伴随细胞F-actin重构,ZO-1表达下调;12 h时,LPS对细胞的TEER、F-actin、ZO-1和claudin-5的破坏程度均达到最高.LPS对bEnd.3组和bEnd.3/vector组细胞早期损害伴有MLC磷酸化增加.而bEnd.3/muIκBα组细胞的NF-κB活性被明显抑制;相应时点,LPS对细胞的TEER、F-actin、ZO-1和claudin-5的损害作用也被减轻.同时LPS引起细胞MLC磷酸化增加的作用被明显抑制.结论:LPS通过破坏紧密连接增加脑微血管内皮细胞的通透性,该过程受NF-κB调控.     

NF-κB参与Akt信号途径激活诱导的心肌肥大

目的：探讨NF-κB信号在Akt信号途径激活诱导的心肌肥大发生机制中所起的作用。 方法： 以缩窄SD大鼠升主动脉诱导的心肌肥大和心脏特异性表达的caAkt转基因小鼠为模型，采用EMSA检测心肌组织中NF-κB结合活性，应用Western blot方法分析心肌组织中phospho-Akt 和 phospho-IκBα的表达水平。 结果： ①缩窄大鼠升主动脉3周后，心脏重量/体重比值高于假手术组34.5%(P＜0.01) ，而且肥大心肌组织中p-Akt蛋白表达明显高于假手术组(P＜0.01)。②caAkt转基因小鼠心脏明显肥大，其心肌组织中NF-κB活性比野生型小鼠高567.86%(P＜0.01)，同时心肌组织中IκBα的磷酸化水平也明显高于野生型小鼠(P＜0.01)。 结论： NF-κB介入到Akt信号途径激活所致的心肌肥大发生发展过程中。     

主动性Heymann肾炎中NF-κB p65在肾间质病变中的作用

目的 :探讨主动性Heymann肾炎 (AHN)肾间质内NF -κBp6 5的活化及意义。方法 :8- 10周龄Wis tar雌性大鼠 2 0只均分为 2组 ,肾炎组予皮下免疫Fx1A/CFA ;对照组予皮下注射CFA。免疫组化染色观察大鼠肾组织NF -κBp6 5的活化及其与肾组织病理改变、尿蛋白量和血清白蛋白水平变化的相互关系。结果 :肾炎组大鼠肾间质病变评分、肾小管 -间质NF -κBp6 5的活化均明显高于对照组 (P <0 0 1) ;肾小管NF -κBp6 5阳性数与尿蛋白水平和肾间质病变评分呈明显正相关 (r分别为 0 7138和 0 6 376 ,P <0 0 5 )。结论 :NF -κBp6 5的活化可能参与AHN的小管 -间质的病理损害过程     

NF-κB p65在口服诱导免疫耐受防治主动性Heymann肾炎中的作用

目的探讨口服诱导免疫耐受对主动性Heymann肾炎(AHN)的防治作用及机制。方法6～8周龄Wistar雌性大鼠30只平均分3组,AHN模型组和口服诱导免疫耐受组大鼠分别予PBS、Fx1A灌胃,然后皮下免疫Fx1ACFA,同时设正常对照组。观察大鼠迟发性超敏反应(DTH)、肾组织的病理变化、尿蛋白水平,并用SandwichELISA法和免疫组化染色分别观察大鼠脾淋巴组织和肾小球内核因子NFκBp65的活化。结果与正常对照组大鼠比较,AHN模型组和口服诱导免疫耐受组大鼠迟发性超敏反应均明显增强,肾小球基底膜(GBM)明显增厚、尿蛋白水平明显增多,肾小球内和脾淋巴组织NFκBp65的活化明显增加,但与AHN模型组比较,口服诱导免疫耐受组DTH明显减低,尿蛋白水平减低,肾组织病变程度和NFκBp65的活化程度有所减轻,差异有显著性(P<0.01);肾小球内NFκBp65的阳性细胞数与脾淋巴组织NFκBp65活性和肾小球基底膜厚度呈明显的直线正相关(P<0.05)。结论口服诱导免疫耐受减轻了AHN肾小球的病理损害,可能与口服诱导免疫耐受对脾淋巴细胞和肾小球内细胞NFκBp65的活化的抑制作用有关。     

脂多糖诱导大鼠心肌细胞NF-κB、IκB-α的表达及意义

目的研究脂多糖(LPS)诱导大鼠心肌细胞NF-κB,IκB-α的表达及意义。方法100ng/mlLPS刺激心肌细胞0、0.5、1、2、4、6、8h和0、10、50、100ng/mlLPS刺激1h,免疫细胞化学检测NF-κBp65的表达,Westernblot检测IκB-α表达。结果LPS的刺激迅速激活心肌细胞NF-κBp65的表达,于1h时达高峰;IκB-α的表达先降低,后升高。结论LPS可诱导大鼠心肌细胞NF-κB的激活,并通过激活心肌细胞核因子-κB途径从而促进细胞损伤。     

核因子-κB“诱饵性”寡核苷酸抑制LPS诱导的肠上皮细胞TLR4、IL-8的表达

目的： 研究NF-κB decoy寡核苷酸对LPS诱导结肠癌细胞SW480后，对TLR4、IL-8表达的影响。方法：体外培养SW480细胞，用LPS(10 μg/L)刺激3 h后，用脂质体lipofectin 2000介导NF-κB decoy ODNs转染6 h，收集细胞上清液，用ELISA法检测IL-8；提取细胞mRNA，经 RT-PCR法检测TLR4 mRNA、IL-8 mRNA的表达。并设对照组、Scrambled ODNs组、lipofectin 2000组进行比较。结果：LPS刺激后TLR4 mRNA、IL-8 mRNA和IL-8的表达明显强于对照组；用NF-κB decoy寡核苷酸干预，可以明显抑制TLR4 mRNA、IL-8 mRNA和IL-8的表达。而Scrambled ODNs组和转染剂lipofectin 2000组对其没有明显影响。结论：NF-κB decoy ODNs有望成为治疗IBD的一种新型基因药品。