剪切力对人视网膜色素上皮细胞c—fos和c—mycm RNA表达的影响

目的 观察剪切力对体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞c-fos和c-myc基因mRNA表达的影响.方法 用2 dyne/cm2的剪切力作用于体外培养的人RPE细胞,作用时间分别为0、0.25 h、0.5 h、0.75h、1 h、1.5 h和3 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察c-fos和c-myc mRNA的表达变化,并采用单因素方差分析比较各时间点之间表达的差异.结果 2 dyne/cm2的剪切力作用0.75 h后.RPE细胞的形态开始发生变化,包括细胞间隙增大、细胞皱缩和脱落.剪切力作用1.5 h及以上时间,细胞极性改为与流动方向一致.在未受剪切力作用的RPE细胞中,c-fos mRNA表达水平低.随着剪切力的作用时间的延长,c-fos mRNA的表达逐渐增强,于1.5 h时达峰值,随后开始减弱.剪切力作用3 h时,RPE细胞c-fos mRNA的水平仍显著高于未受剪切力作用时的水平.在未受剪切力作用的RPE细胞中,c-myc mRNA表达水平较低.剪切力作用1.5 h时,c-myc mRNA的表达增强至峰值,随后开始减弱,但在作用3 h时,c-mye mRNA的表达仍高于未受剪切力作用时的RPE细胞的c-myc mRNA的水平.结论 2 dyne/cm2的剪切力可改变RPE细胞的形态.在短时间内可快速增强RPE细胞c-fos和c-myc mRNA的表达.与c-myc相比,c-fos对剪切力的反应更迅捷,增强幅度更大.     

培养人视网膜色素上皮细胞牵拉模型中细胞骨架的改变

目的研究培养人视网膜色素上皮细胞（RPE）受机械牵拉力后细胞骨架的变化。方法将胶原包被的磁珠悬液加入培养的人RPE细胞后孵育,洗去未结合的磁珠。在磁场垂直方向力作用下0、4、8、12和24h,以及加入细胞松弛素D（0．05mmol／L,25min）预处理后,用免疫荧光双标染色法着染细胞中的肌动蛋白和波形蛋白,并用激光共聚焦显微镜观察。结果机械牵拉作用4h后,人RPE细胞的形态和微丝的极性发生改变。肌动蛋白微丝的排列与受力方向一致。细胞骨架微丝表达主要在细胞核周及磁珠聚集处周围。而加入细胞松弛素D预处理的细胞,在8h时发生以上变化。结论机械牵拉可引起人RPE细胞骨架分布的改变,使其表现出肌细胞的某些生物学特征,这对细胞的移行和增生可能有促进作用。     

细胞因子对人视网膜色素上皮细胞syndecan-1表达的影响

目的 检测细胞因子对人视网膜色素上皮（RPE）细胞syndecan-1表达的影响，并探讨其作用的信号转导途径。 方法 体外培养人RPE细胞，采用逆转录聚合酶链反应和免疫荧光法检测正常细胞syndecan-1 mRNA、蛋白的表达；免疫荧光法定性、定量观察不同刺激因子作用下syndecan-1的表达变化，包括：7、35 ng/ml肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激24 h，1、6 μg/ml脂多糖（LPS）刺激11 h, 7 ng/ml TNF-α刺激不同时间（0～24 h，每2 h为1个时间点，共13个时间点)，30%单核/巨噬细胞株（THP-1细胞）上清液刺激3、14、43 h；细胞外信号调节激酶(ERK)1/2通路特异性阻断剂PD098059预处理2 h后对30% THP-1细胞上清液作用的调节；30% THP-1细胞上清液刺激细胞3 h后0.25%胰酶作用5 min，噻唑蓝法检测细胞贴壁情况。 结果 在正常RPE细胞中可检测到syndecan-1 mRNA和蛋白的表达；未受刺激的RPE细胞细胞膜、细胞浆及核仁呈强的黄绿色荧光，细胞核呈浅绿色荧光；随TNF-α、LPS浓度及时间增加，荧光强度呈减弱趋势(P<0.01); 30% THP-1细胞上清液刺激后细胞荧光强度明显减弱(P<0.001)。50 μmol/L PD098059预处理2 h后可部分阻断30% THP-1细胞上清液的下调作用。与对照组相比，THP-1细胞上清液作用3 h后贴壁细胞数下降（P<0.05）。 结论 TNF-α和LPS可下调体外培养的人RPE细胞syndecan-1的表达；30% THP-1细胞上清液可下调RPE细胞syndecan-1的表达、促使细胞脱壁，且该作用至少通过了ERK 1/2信号转导通路。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 113-116)     

内皮细胞白细胞黏附分子-1对猪眼小梁细胞形态和细胞骨架的作用

目的研究内皮细胞白细胞黏附分子-1(ELAM-1)对猪眼小梁细胞形态和肌动蛋白细胞骨架的作用,探讨青光眼的发病机制。方法原代培养的猪眼小梁细胞,经白细胞介素1(IL-1)刺激活化后,结合ELAM-1抗体或IgG进一步交联,观察细胞形态、细胞间连接的动态改变及肌动蛋白和细胞厚度的改变。结果未经IL-1作用的猪眼小梁细胞不表达ELAM-1,IL-1作用后猪眼小梁细胞表达ELAM-1。经过IL-1活化的猪眼小梁细胞,结合ELAM-1抗体或IgG进一步交联后,细胞间隙扩大,细胞变圆、变厚,细胞立体感增强;肌动蛋白变稀疏,荧光弥散,细胞的刚性降低,细胞厚度增加。结论猪眼小梁细胞能表达ELAM-1,表达的ELAM-1通过与抗体结合或同时通过IgG交联影响肌动蛋白细胞骨架,改变细胞形态。     

内皮素-1体外对人小梁细胞骨架肌动蛋白的影响

目的:观察内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对人眼小梁细胞细胞骨架肌动蛋白的影响。方法:培养3代人眼小梁细胞,随机分为4组:对照组(0mol/L ET-1);ET-1低剂量组(10-9mol/L ET-1);ET-1中剂量组(10-8mol/L ET-1);ET-1高剂量组(10-7mol/L ET-1),各组细胞分别处理72h后,应用Western-blot方法检测小梁细胞骨架肌动蛋白(F-actin)的表达,并用FITC-phalloidin荧光探针观察肌动蛋白在细胞内的分布。结果:ET-1作用后人小梁细胞肌动蛋白表达明显增高,在10-9～10-7mol/L浓度范围内呈剂量依耐性,荧光探针示ET-1处理组小梁细胞肌动蛋白应力纤维和周边肌动蛋白明显增多浓集,细胞微丝附着与胞膜,细胞间连接及细胞贴壁部位连接明显增多。结论:ET-1能促进小梁细胞肌动蛋白表达,参与了小梁细胞骨架的重构。     

内皮素-1体外对人小梁细胞骨架肌动蛋白的影响

目的：观察内皮素-1（endothelin-1,ET—1）对人眼小梁细胞细胞骨架肌动蛋白的影响。方法：培养3代人眼小梁细胞,随机分为4组：对照组（0mol／LET-1）;ET-1低剂量组（10^-9mol／LET—1）;ET-1中剂量组（10^-8mol／LET—1）;ET-1高剂量组（10^-7mol／LET—1）,各组细胞分别处理72h后,应用Western—blot方法检测小梁细胞骨架肌动蛋白（F—aetin）的表达,并用FITC—phalloidin荧光探针观察肌动蛋白在细胞内的分布。结果：ET—1作用后人小梁细胞肌动蛋白表达明显增高,在10^-9～10^-7mol／L浓度范围内呈剂量依耐性,荧光探针示ET-1处理组小梁细胞肌动蛋白应力纤维和周边肌动蛋白明显增多浓集,细胞微丝附着与胞膜,细胞间连接及细胞贴壁部位连接明显增多。结论：ET—1能促进小梁细胞肌动蛋白表达,参与了小梁细胞骨架的重构。     

高浓度葡萄糖对培养的人视网膜色素上皮细胞细胞表面黏附分子-1的影响

目的:研究高浓度葡萄糖对体外培养人视网膜色素上皮(RPE)细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法:用免疫荧光法检测5.6mmol/L和30.0mmol/L葡萄糖作用1,2,3d后hRPE细胞表面ICAM-1表达量,MTT方法检测两种浓度葡萄糖作用下48hhRPE表面黏附白细胞的数量。结果:30.0mmol/L葡萄糖作用1,2,3d后hRPE细胞表面荧光着色密度分别为5.6mmol/L葡萄糖作用下荧光着色的2.4,3.8,4.0倍。30.0mmol/L葡萄糖作用48h后hRPE细胞表面黏附的白细胞数量是5.6mmol/L葡萄糖组的2.34倍,有统计学显著性差异(P<0.05)。结论:高糖可以促进体外培养hRPE细胞的ICAM-1表达,提示RPE细胞在高糖作用下可能参与了糖尿病视网膜病变的早期病理反应。     

THP-1细胞对体外培养的人视网膜色素上皮细胞c—fos表达的上调作用

目的 检测与单核/巨噬细胞株THP-1细胞共培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞c-fos的表达.方法 在Transwell小室中共培养THP-1细胞和人RPE细胞迭不同的时间(0,2 h,3 h.24 h,48 h,72 h),采用免疫荧光染色法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达变化.结果 在未与THP-1细胞共培养的RPE细胞中,c-fos表达微弱或不表达,细胞浆和部分细胞核为浅黄绿色荧光.与THP-1细胞共培养达2 h时,RPE细胞的荧光强度逐渐增强并出现核移位.随着与THP-1细胞共培养时间的延长,RPE细胞c-fos mRNA的表达(0 h,0.40±0.07)开始逐渐增强,于2 h时达峰值(2 h,0.91±0.10,P=0.002),随后表达减弱,至3 h时(3 h,0.51±0.08)降至近未共培养时的水平.结论 与THP-1细胞共培养可在短期内迅速上调体外培养的人RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达,且蛋白表达出现核移位现象,提示THP-1细胞可引起RPE细胞c-fos的活化.     

胰岛素对人视网膜微血管内皮细胞syndecan-1的表达及细胞通透性和增殖的影响

目的：观察胰岛素对人视网膜微血管内皮细胞syndecan-1的表达及细胞的增殖和通透性的影响。

方法：以低浓度(100nmol/L)和高浓度(1 000nmol/L)胰岛素分别刺激细胞48h后,采用蛋白印迹和实时定量聚合酶链反应观察syndecan-1蛋白和mRNA的表达变化。分别以四甲基偶氮唑蓝法和辣根过氧化物酶法观察细胞的增殖性和通透性。

结果：不同浓度的胰岛素刺激后,视网膜微血管内皮细胞syndecan-1蛋白和mRNA的表达均升高,且高浓度胰岛素的作用更显著。胰岛素刺激后,视网膜微血管内皮细胞的增殖水平和通透性均增高,且高浓度胰岛素的作用更强。

结论：胰岛素可上调人视网膜微血管内皮细胞syndecan-1的表达、增加细胞的通透性和促进细胞的增殖。     

缺氧诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞转录和表达缺氧诱导因子-1α的研究

目的探讨在不同缺氧时相人视网膜色素上皮(RPE)细胞转录和表达缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的情况。方法原代培养人RPE细胞,经鉴定后,选择第3—6代RPE细胞进行缺氧分析,分别在缺氧6、8、16、24、48h不同时相,利用半定量RT—PCR法及免疫荧光测定法检测人RPE细胞转录和表达HIF-1α的情况。结果半定量RT-PCR法和免疫荧光法检测结果均显示缺氧可以明显诱导入RPE细胞转录和表达HIF-1α。在缺氧8h时,HIF-1α转录和表达量达高峰,并可持续至24h后;缺氧48h时,人RPE细胞代谢产物增加,细胞形态发生改变,HIF-1α转录和表达量开始下降。结论缺氧可以明显诱导人RPE细胞转录和表达HIF-1α,这可能是发生脉络膜新生血管的重要始动因素。（中华眼科杂志,2005,41：312-316）     

氧化应激反应对视网膜色素上皮细胞迁移的影响及相关机制的探讨

目的 探讨氧化剂tert-butyl hydroperoxide(TBH)诱导的氧化应激反应对视网膜色素上皮(RPE)细胞迁移的影响。方法 将人RPE细胞内氧化反应产物以Carboxy-H2DCFDA染色标记;细胞的迁移采用改良的Boyden腔测定;其存活及黏附通过MTT比色法测定。肌动蛋白,局部黏附激酶及纽带蛋白的表达采用免疫荧光染色观察。通过蛋白电泳观察分裂原激活的蛋白激酶和局部黏附激酶的表达。结果 TBH处理后RPE细胞内氧化反应产物增加。TBH对RPE细胞迁移的影响呈双向反应,即低浓度促进,高浓度抑制。高浓度TBH降低RPE细胞黏附力,也能减少局部黏附激酶和纽带蛋白的表达,同时。TBH可活化分裂原激活的蛋白激酶。结论 由TBH诱导的氧化应激反应既能刺激也能抑制RPE细胞的迁移。(中华眼科杂志,2005,41：100-105)     

缺氧对培养人视网膜色素上皮细胞线粒体酶活性的影响

目的　研究缺氧对培养的人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞线粒体琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase,SDH)和细胞色素氧化酶(cytochromeoxi dase,COX)活性的影响,以及缺氧对RPE细胞增生的作用。方法　氯化钴(CoCl2 )法建立培养人RPE细胞缺氧模型。于缺氧后0 .5h、1h、2h、4h、6h、8h、16h和2 4h ,用组织化学法测定SDH和COX活性。于缺氧后第1天、2天、3天、4天和5天,用四甲基偶氮唑蓝[3(4,5dimethylthiazole 2 yl) 2 ,5diphenyltetrazoliumbromide,MTT]比色法检测RPE细胞增生。结果　RPE细胞SDH和COX活性随缺氧时间延长而逐渐降低,与对照组有显著性差异(P <0 .0 5 )。缺氧组RPE细胞增生能力增强(P <0 .0 5 )。结论　缺氧可使RPE细胞线粒体酶活性降低,并刺激RPE细胞增生,对深入了解视网膜脉络膜缺血缺氧性疾病的发病机制有一定的价值     

Induction of vascular endothelial growth factor after application of mechanical stress to retinal pigment epithelium of the rat in vitro

PURPOSE: To investigate the response to mechanical stress of vascular endothelial growth factor (VEGF) production by cultured retinal pigment epithelial (RPE) cells. METHODS: A pulsatile stretch device was used in vitro. RPE cells of the second passage were seeded onto flexible-bottomed culture plates; then, at subconfluent culture, the plates were subjected to pulsatile stretch. Culture plates prepared in the same way but not subjected to stretch were used as controls. After stretching for 1 hour or 24 hours, conditioned medium for measurement of VEGF production by RPE cells was collected using a mouse VEGF immunoassay. To study the expression of VEGF in RPE cells, passaged-cultured RPE cells were exposed to pulsatile stretch for 0, 1, 3, or 14 hours. Total cytoplasmic RNA was then prepared from the RPE cells. Northern blot analysis was performed for VEGF, with G3PDH used as an internal control. RESULTS: The expression and secretion of VEGF in RPE cells were increased by pulsatile stretching. CONCLUSIONS: Results indicate that stretching of the RPE could result in increased production of VEGF, with associated risk for neovascularization and changes in the blood-retinal barrier.     

TIMP-1 Production in Human Retinal Pigment Epithelial Cells after Laser Exposure

Purpose: To investigate changes in the production of tissue inhibitor of metalloproteinase type 1 (TIMP-1) by human retinal pigment epithelial (RPE) cells following argon laser exposure. Methods: Human cultured ARPE19 cells were exposed to argon green laser at four different energy levels ranging from 60mW to 360mW. After laser exposure, the culture media were sampled at 0, 24, 72 and 144 hours for TIMP-1 concentration produced by the RPE cells. The levels of TIMP-1 in the cells treated with different laser energy levels were compared with a control group not exposed to laser application. Immunocytochemistry for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was performed to detect any adverse effects on the RPE cells caused by laser exposure. Results: Immediately after laser exposure, the concentration of TIMP-1 was not detectable. At 24 hours after laser exposure, the concentration of TIMP-1 increased significantly in RPE cells treated with 120mW and 240mW at 24 hours (P=0.006 and P=0.001 respectively) comp     

缺氧诱导体外培养人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的:了解缺氧条件下体外培养人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡情况。方法:将培养的人RPE细胞置于含10mL/LO2、50mL/LCO2和940mL/LN2的培养箱内建立缺氧模型。于缺氧后1,3,6,12,24h,利用扫描电镜、透射电镜、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucle-otidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)技术和流式细胞仪测定RPE细胞凋亡水平。结果:常氧状态下RPE细胞生长良好,几乎没有凋亡(TUNEL法测凋亡指数为1.2)。缺氧条件下,RPE细胞发生了不同程度的凋亡,缺氧后3h凋亡水平达峰值(凋亡指数为34.43)。结论:缺氧可导致体外培养的人RPE细胞凋亡,提示RPE凋亡可能参与了某些缺血缺氧性眼病的发生。     

Thrombospondin-1 Expression in RPE and Choroidal Neovascular Membranes

Introduction Age-related macular degeneration (AMD) s the leading cause of blindness in the West or individuals more than 50 years of age[1-3].Severe visual loss in the late stages of AMD most commonly results from choroidal neovas- cularization (CNV), a process characterized by the growth of new vessels from the choriocapil- laris through Bruch′s membrane. These new vessels are prone to leakage and bleeding and may be associated with detachment of the retinal pigment epithelium (RPE). …     

Latrunculin-A causes mydriasis and cycloplegia in the cynomolgus monkey

PURPOSE: To determine the effect of latrunculin (LAT)-A, which binds to G-actin and disassembles actin filaments, on the pupil, accommodation, and isolated ciliary muscle (CM) contraction in monkeys. METHODS: Pupil diameter (vernier calipers) and refraction (coincidence refractometry) were measured every 15 minutes from 0.75 to 3.5 hours after topical LAT-A 42 microg (approximately 10 microM in the anterior chamber [AC]). Refraction was measured every 5 minutes from 0.5 to 1.5 hours after intracameral injection of 10 microl of 50 microM LAT-A (approximately 5 microM in AC), with intramuscular infusion of 1.5 mg/kg pilocarpine HCl (PILO) during the first 15 minutes of measurements. Pupil diameter was measured at 1 and 2 hours, and refraction was measured every 5 minutes from 1 to 2 hours, after intravitreal injection of 20 microl of 1.25 mM LAT-A (approximately 10 microM in vitreous), with intramuscular infusion of 1.5 mg/kg PILO during the first 15 minutes of measurements (all after topical 2.5% phenylephrine), and contractile response of isolated CM strips, obtained <1 hour postmortem and mounted in a perfusion apparatus, to 10 microM PILO +/- LAT-A was measured at various concentrations. RESULTS: Topical LAT-A of 42 microg dilated the pupil without affecting refraction. Intracameral LAT-A of 5 microM inhibited miotic and accommodative responses to intramuscular PILO. Intravitreal LAT-A of 10 microM had no effect on accommodative or miotic responses to intramuscular PILO. LAT-A dose-dependently relaxed the PILO-contracted CM by up to 50% at 3 microM in both the longitudinal and circular vectors. CONCLUSIONS: In monkeys, LAT-A causes mydriasis and cycloplegia, perhaps related to its known ability to disrupt the actin microfilament network and consequently to affect cell contractility and adhesion. Effects of LAT-A on the iris and CM may have significant physiological and clinical implications.     

人视网膜色素上皮细胞累积性氧化损伤的机制探讨

目的探讨累积性氧化损伤对培养的人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelium,RPE）细胞生长的影响及其影响机制.方法体外培养的人RPE细胞中加入600 μmol/L过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）,分别培养1、6、12、24、72 h,采用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测不同时段H2O2对人RPE细胞生长的影响,应用荧光素标记的连接素V-碘化丙锭（annexin V-fluorescein isothiocyanate-propidium iodium,Av-FITC-PI）双染色流式细胞法测定人RPE细胞凋亡.采用免疫印迹法检测衰老相关蛋白Clusterin的表达.结果（1）MTT法检测结果：600 μmol/L的H2O2作用6 h,即可抑制人RPE细胞生长,H2O2作用时间延长至24 h,其作用时间与人RPE细胞增长抑制率成正比.（2）Av-FITC-PI法检测结果：600 μmol/L的H2O2作用6 h,可诱导人RPE细胞凋亡,且随时间的延长而增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;而72 h后则引起细胞的坏死.（3）免疫印迹法检测结果：Clusterin蛋白在正常人RPE细胞呈弱表达,H2O2作用12 h可见Clusterin蛋白表达增强,24 h组表达开始减弱,72 h组仅见微弱表达.结论600μmol/L的H2O2长时间作用可抑制人RPE细胞生长,诱导人RPE细胞凋亡;同时诱导衰老相关蛋白Clusterin的表达;而更长时间的累积损伤则造成人RPE细胞的坏死.H2O2氧化损伤可以模拟人RPE细胞的老年性改变.     

视紫红质蛋白激酶抑制剂对兔增生性玻璃体视网膜病变的作用

目的 分析视紫红质蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y27632对兔增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的作用。方法 培养兔视网膜色素上皮（RPE）细胞。相差显微镜及免疫荧光染色检测Y27632对RPE细胞-平滑肌肌动蛋白（SMA）压力纤维形成的影响。体外Ⅰ型胶原凝胶收缩试验和噻唑蓝（MTT）试验来检测Y27632对细胞收缩力量和增殖的影响。用第6代兔RPE细胞建立兔PVR模型,玻璃体腔内给予50μmol／L Y27632,每周1次,持续28d,以牵拉性视网膜脱离的发生率来评估药物的体内效应。行视觉电生理和组织学检查以分析该药的毒性。结果 50μmol／L Y27632破坏了兔RPE细胞α-SMA压力纤维的形成,并减弱了RPE细胞产生的收缩力（P〈0．01）;RPE细胞的增殖不受Y27632的影响。Y27632用药组的牵拉性视网膜脱离的发生率降低（P〈0．01）。在用药组中,未发现明显的视网膜组织结构和功能的损害。结论 特异性ROCK抑制剂Y27632可减弱RPE细胞产生的收缩力,并且可阻止兔PVR的发展。该药无明显的副作用,有可能成为一种防治PVR的有效方法。