牛眼前房小梁细胞体外培养的建立

牛眼前房小梁细胞体外培养的建立杨新光，李美玉，张东杲（唐都医院眼科西安７１００３８北京医科大学北大医院眼科）关键词细胞培养；小梁网；牛眼中图号Ｒ７７５．２前房角小梁网是房水排出的主要途径，也是目前认为原发性开角型青光眼的主要病变所在．房水流出通道的大...     

转化生长因子β1对体外培养的牛眼小梁细胞肌动蛋白影响的研究

目的：了解转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对培养的牛眼小梁细胞微丝肌动蛋白的影响，探讨房水引流阻力在原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma,POAG)的病因和发病机制中的作用。方法：进行牛眼小梁细胞体外培养。以含不同浓度TGF－β1（终浓度为0，0．5，1，5ng.ml^-1）的培养液孵育传三代的小梁细胞24小时，SABC法对细胞进行actin染色，结果以计算机图像分析系统分析并进行统计学检验。结果：各浓度组与对照组相比，TGF－β1可增加小梁细胞actin的表达。结论：TGF－β1在一定范围内增加体外培养的牛眼小梁细胞actin表达，加强小梁细胞收缩能力，有利于降低小梁网房水引流阻力。     

压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响

目的：观察压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响．方法：对体外培养的牛眼小梁细胞施以不同程度的压力，用倒置相差显微镜，光镜，电镜观察细胞形态结构变化，台盼蓝染色观察比较各组细胞活力的差别．结果：当作用于细胞的压力为1．33和2．67kPa(1kPa＝7．5mmHg)，作用时间为48h时，与对照组比较，形态结构无明显变化，台盼蓝计数无显性差异(P＞0．05)，而当压力为5．33kPa作用时间为24h时，细胞形态结构有轻度的损伤，随着压力和作用时间的进一步增加，细胞的损伤程度也进一步加重。结论：小梁细胞承受压力的能力是有限的，压力过高或受压时间过长都会对细胞造成损伤。     

整合素β1在体外培养牛眼小梁细胞中的表达

目的 探讨体外培养小梁细胞表面整合素表达及其意义.方法 对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养,并行鉴定.对传三代的牛眼小梁细胞施加整合素β1一抗,后分别给予荧光和多聚辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗,并将细胞置于荧光倒置显微镜下观察摄像.结果 应用免疫荧光和免疫酶技术方法 均可观察到培养小梁细胞表面整合素β1阳性染色.结论 体外培养的牛眼小梁细胞表达整合素β1,为以后研究原发性开角型青光眼病因学提供良好实验基础.     

可见光对体外培养的牛眼小梁细胞的影响

目的：探索光线对小梁细胞的生物学影响。方法：用不同波长、不同功率的可见光照射体外培养的牛眼小梁细胞,观察小梁细胞的形态结构、增殖及吞噬功能的影响。结果：小功率的可见光对细胞无明显影响,当光的功率增加到1．12mw/cm^2时,出现细胞浆粗糙、细胞增殖减慢、细胞吞噬功能降低。这种光毒性作用以白光(混合波长光)最大,紫光和黄光次之,红光最小。结论：可见光在能量较高时对小梁细胞有光毒性损伤,提示我们在手术或眼部检查时尽可能避免强光长时间照射眼睛。     

体外培养的人眼小梁细胞的观察

自１９８６年，我们共培养９９只人眼的小梁组织，原代培养成活率为１８．２％，其中供体年龄小于２岁者成活率２２．５％；在２４ｈ内取材者为２７．３％。共传１４～１６代，细胞生长呈有限性。成活的小梁细胞在第３～７代生长最快，细胞形态与活体小梁细胞相似。研究这些细胞将有助于我们了解小梁细胞形态和功能变化的特点。     

丝裂霉素C对体外培养牛眼小梁细胞毒性的研究

向第3～4代牛眼小梁细胞（bovinetrabecularmeshworkcell，BTMcell）体外培养液内加入不同浓度的丝裂霉素C（MitomycinC，MMC），通过光镜、电镜等观察该药对细胞的形态、结构及吞噬功能的影响.发现MMC可以引起细胞皱缩变形，超微结构中出现线粒体及科面内质网扩张、核固缩或核碎裂等，细胞吞噬微球的数目也有所减少。苔盼蓝染色结果显示MMC不影响小梁细胞存活的浓度为1×10(-7)g／L，半数致死量为1×10(-4)～1×10(-3)g／L。MMC的临床应用是否会对小梁细胞造成损伤值得进一步研究。     

地塞米松抑制培养牛眼小梁细胞AQP1表达

目的测定地塞米松对体外培养牛眼小梁细胞水通道蛋白-1(aquaporin1,AQP1)表达的影响,探讨糖皮质激素性青光眼房水引流阻力的形成机制。方法将传3代的牛眼小梁细胞用数字表法随机分为对照和地塞米松处理组。将不同浓度的地塞米松(10-5、10-6、10-7mol/L)分别加入培养液持续培养14 d,免疫细胞化学方法检测小梁细胞AQP1表达水平,计算机图像分析软件测量细胞表面积。结果经不同浓度地塞米松处理后的小梁细胞AQP1表达量吸光度值A显著低于对照组(均P=0.000)。10-7mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著大于对照组,而10-6mol/L和10-5mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著低于对照组(均P=0.000)。结论地塞米松抑制牛眼小梁细胞AQP1表达,可能参与了糖皮质激素性青光眼的发生。     

大麻素WIN55，212-2对体外培养牛眼小梁细胞cAMP表达的影响

目的通过研究大麻素WIN55，212-2对体外培养牛眼小梁细胞（BTMC）环腺苷酸（cAMP）表达的影响，探讨其增加房水排出而降低眼压的机制。方法对BTMC进行体外原代培养及传代培养，应用免疫组化的方法鉴定细胞。然后用不同浓度的WIN55，212-2作用于BTMC，放射免疫法检测细胞上清液中cAMP的水平。结果WIN55，212-2浓度在0．1-20μmol／L范围内，培养液中cAMP水平随浓度增加而显著性升高，若WIN55，212-2浓度继续增高（40-60btmol／L），cAMP水平不再升高。结论WIN55，212-2可能通过提高BTMC内cAMP水平而起到降低眼压的作用。     

体外培养人眼小梁细胞吞噬乳胶微粒观察

应用体外培养的人小梁细胞,观察其吞噬乳胶微粒的能力。结果显示吞噬过程开始４小时内,吞噬功能随时间延长而增强;但吞噬过久细胞则出现变性或死亡。电镜示吞噬微粒后的细胞呈“激惹”状态。结合小梁细胞功能,对吞噬过程的重要性进行了讨论。     

人眼小梁细胞组织培养及超微结构观察

以体外组织块培养的方法成功地建立了三个人眼小梁细胞系标本。在倒置显微镜下观察了三代小梁细胞的生长过程，用透射和扫描电子显微镜观察了第三代融合的小梁细胞的超微结构。小梁细胞的生长潜伏期约为１周，原代和传代融合的小梁细胞呈单层细胞生长，单个细胞呈长而扁平状，核位于中央为椭圆形，细胞表面大部分平滑，偶有微绒毛突出，在某些部位可见邻近细胞和其胞突间紧密连在一起。另外，这些细胞还具有高代谢细胞的超微结构特征包括大量的线粒体，发达的Ｇｏｌｇｉ器，丰富的粗面内质网和明显的溶酶体。人小梁细胞体外培养为进一步研究小梁细胞的功能提供了非常有价值的实验物质基础，还可作为青光眼发病学和药物筛选等方面实验研究的基础。     

国人前房角小梁网超微结构观察

对一例意外急死的成年健康男性小梁网及施氏管进行了电镜观察。扫描电镜下可见角膜缘内表面小梁粗细不等并以分支连接成网,有的小梁为薄板状,其上可有孔洞。透射电镜观察,施氏管内侧壁为内皮,内皮细胞胞质内有巨大饮液泡及许多小饮液泡。小梁网的外侧部为内皮网区,由多突起细胞连接成网,网孔中有少量胶原原纤维,其内侧部为小梁区,由小梁及小梁间隙组成,小梁由内皮、基板、基质层、致密中轴组成。有的小梁内皮细胞有纤毛。本文对房水排出途径及小梁区、内皮网区电镜构造及相关功能进行了初步讨论。     

青光眼患者小梁网中一氧化氮合酶的表达

目的 检测正常人和急性闭角型青光眼(acute angle-closure glaucoma,AACG)患者小梁网中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelia nitric oxide synthase,eNOS)的表达,探讨小梁网中的一氧化氮合酶的变化及与青光眼的关系.方法 取5例正常人及15例AACG患者小梁网组织标本,应用免疫组织化学方法检测小梁细胞eNOS和iNOS的表达,并采用计算机图像分析系统对检测结果进行分析.结果 正常人的小梁网组织标本有eNOS的表达,阳性细胞分布均匀,iNOS呈弱阳性或不表达.AACG患者小梁网组织标本中,eNOS和iNOS均呈阳性表达,iNOS主要分布在邻管组织和Schlemm管.iNOS阳性表达比正常对照组增强(P＜0.05),而eNOS阳性表达比正常对照组减弱(P＜0.01).结论 AACG患者小梁网细胞eNOS表达减少而iNOS表达增多且主要分布在邻管组织、Schlemm管,提示一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)在青光眼发病中起重要作用,是导致或加重青光眼的因素之一.     

原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡的探讨

目的对比观察原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡数目与正常尸眼小梁网内皮细胞凋亡数目的变化,并探讨其可能的发病机制。方法对16例20眼原发性开角型青光眼（观察组）手术中所切取的小梁组织与17例30眼正常尸眼（对照组）所切除的小梁组织,分别采用流式细胞术进行小梁网内皮细胞凋亡数目的测定,比较原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡情况。结果通过实验发现原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡比例（16％）明显高于正常尸眼小梁网内皮细胞凋亡（5％）。二者相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论原发性开角型青光眼小梁网对房水的滤过率下降,可能与小梁网内皮细胞凋亡数目的增多导致小梁网组织滤过功能的下降有一定的关系．     

青光眼患者小梁网中ONOO^-的表达及与眼压升高关系的研究

目的检测正常人和原发性急性闭角型青光眼(primary acute angle closure glaucoma,PAACG)及原发性慢性闭角型青光眼(primary chronic angle closure glaucoma,PCACG)患者小梁网组织标本中过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)的表达,探讨小梁网中ONOO-的变化、分布及与青光眼的关系。方法取正常眼6例及PAACG患者14例18只眼及PCACG患者12例15只眼小梁网组织标本,应用形态学观察,免疫组织化学方法检测小梁细胞ONOO-的标志物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)的表达,并采用计算机图像分析系统对检测结果进行分析。结果正常人的小梁网组织标本NT的表达呈弱阳性或不表达,PAACG组小梁网组织中NT呈强阳性表达,PCACG组小梁网组织中NT呈阳性表达,3组间的差异均具有统计学意义(F=25.32,P<0.01),眼压与小梁网NT着色强度呈相关关系(P<0.01)。结论正常人的小梁网细胞ONOO-微弱表达而PAACG与PCACG患者小梁网细胞ONOO-大量表达且其表达量随眼压的升高而增多,表明眼压升高可导致ONOO-过量生成,从而损伤小梁网细胞,进一步加重青光眼眼压升高。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的:培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行鉴定,为进一步的研究打基础.方法:分别采用全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,并应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD29、CD90以及CD11b进行表型鉴定.结果:两种方法培养的细胞均为成纤维样细胞,呈集落式生长,全骨髓培养法培养的BMSCs表达CD34-(95.4%),CD44+(94.2%),CD45-(91.6%),CD29+(93.8%),CD90+(98%),CD11b-(87.6%),梯度离心法培养的BMSCs表达CD34-(96.9%),CD44+(97.3%),CD45-(97.5%),CD29+(99.4%),CD90+(99.8%),CD11b-(96%).结论:两种方法均可分离培养出较纯化的BMSCs,但全骨髓贴壁培养法简单易行,原代培养周期较短.     

大鼠胸主动脉内皮细胞培养方法的改进

目的：建立一种简单易行的SD大鼠胸主动脉的内皮细胞培养方法。方法：分离大鼠胸主动脉,清除血管外结缔组织,将其剪成厚约1.5mm的血管环,以15-20个血管环密度接种于25 cm^2培养瓶中,以含20%胎牛血清的DMEM液培养,60h后去掉血管环。待细胞生长达单层融合时,消化传代。对P2代细胞应用抗Ⅷ因子抗体进行鉴定。结果：60h后,细胞呈集落样散在分布于瓶底;7-9d细胞汇合成单层,呈铺路石状。经Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定,所培养细胞为内皮细胞。结论：血管环贴壁法培养SD大鼠胸主动脉内皮细胞简易可行。     

不同支架材料培养前列腺癌PC3细胞的比较

目的：比较海藻酸钠加明胶、胶原、琼脂糖、基质胶等4种支架材料培养前列腺癌PC3细胞效果.方法：将前列腺癌PC3细胞接种到海藻酸钠加明胶、胶原、琼脂糖、基质胶等4种支架材料中进行三维培养,然后采用实时荧光定量RT-PCR方法检测MMP9、MMP2、FN1、LAMA5、LAMC2、NKX3 1等6个前列腺癌相关基因在上述4种支架材料培养的PC3细胞的表达情况.结果：MMP9、MMP2在有支架材料培养的PC3细胞中表达高于无支架材料培养的PC3细胞;LAMC2、MMP9、MMP2在胶原组中上调,MMP9、MMP2在海藻酸钠加明胶组与琼脂糖原组中上调,基质胶组中只有MMP2上调.结论：①采用支架材料的三维培养体系优于不用支架材料的二维培养体系.②胶原为体外前列腺癌PC3细胞三维培养的最优支架材料.     

甲胎蛋白对Hela细胞增殖的促进作用

目的 :采用由脐带血血清中提纯的胎蛋白 (Alpha-fetoprotein,AFP)作用于体外培养的Hela细胞。方法 :通过对MTT计数 ,3H -TdR掺入以及细胞周期时相改变等指标的检测。结果 :发现AFP(浓度大于10mg/L)对Hela细胞增殖有明显的促进作用。结论 :AFP具有促Hela细胞增殖的生理功能