反义HIF-1α基因治疗人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

摘要：目的:探讨反义HIF-1α基因对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的影响及其相关机制。方法:使用人原发性肝癌细胞株SMMC-7721建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤动物模型。待肿瘤生长至直径约0.4cm时，将荷瘤裸鼠随机分为3组，分别注射生理盐水、质粒PcDNA3和HIF-1α/PcDNA3B，质粒用脂质体DOTAP介导转染细胞。观察各组动物的肿瘤生长曲线；取肿瘤标本作免疫组织化学检查（SABC法）及蛋白质印迹检查，检测各组肿瘤的VEGF和HIF-1α表达及微血管密度（MVD）和细胞凋亡。结果:HIF-1α/PcDNA3B治疗组各时点的肿瘤体积，以及肿瘤组织中HIF-1α蛋白、MVD，VEGF表达均低于对照组，而细胞凋亡指数高于对照组，差异均有显著性（P＜0.05）。结论:通过阻断癌细胞的缺氧适应途径，反义HIF-1α基因治疗肝癌有抑制肿瘤生长、抑制肿瘤血管生成及诱导细胞凋亡的作用。     

敲减PPARG对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长影响的研究

目的：探讨敲减过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法：体外培养MCF-7细胞，将PPARG-si RNA和NC-si RNA转染进入MCF-7细胞。分别采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况。将转染后的细胞建立裸鼠移植瘤模型。28 d后处死裸鼠，分离瘤体并称重，计算抑瘤率。采用RT-PCR和蛋白印迹法分别检测瘤体中PPARG、β-catenin和MMP-9的m RNA表达和蛋白水平。结果：与空白对照组比较，NC-si RNA组各指标比较差异无统计学意义（P>0.05）；与空白对照组和NC-si RNA组比较，PPARG-si RNA组MCF-7细胞增殖率降低、细胞凋亡率增加（P<0.05）；与空白对照组和NC-si RNA组比较，PPARG-si RNA组移植瘤质量减少，PPARG、NF-κB和MMP-9的m RNA表达和蛋白水平均降低，抑瘤率增加（P<0.05）。结论：敲减PPARG能抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，促进MCF-7细胞凋亡，抑制裸鼠移植瘤生长，发生机制可能与PPARG调控能量代谢有关。     

靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响

目的研究靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响,探讨survivin在血管生成中的作用机制。方法采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2,Western blot检测细胞中survivin蛋白的表达;RT-PCR检测细胞中VEGF mRNA的表达;FCM检测细胞的凋亡率;利用皮下注射法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型;采用脂质体包裹survivin ASODN直接瘤内注射,观察其对移植瘤生长情况的影响;SABC法检测移植瘤组织MVD。结果400 nmol/L survivin ASODN转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达,但不影响VEGF mRNA表达;ASODN组HepG2细胞凋亡率显著高于空白对照组和SODN组(F=428.19,P<0.01);ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(F=12.63,P<0.01);ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(F=5.90,P<0.05);ASODN组MVD较空白对照组和SODN组明显降低(F=34.29,P<0.01)。结论survivin ASODN可以抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长,其机理可能是诱导HepG2细胞自发性凋亡和抑制肿瘤血管生成。     

Angiostatin基因治疗人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的:研究Angiostatin基因治疗对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其相关机理。方法:使用人原发性肝癌细胞株SMMC-7721建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,质粒用脂质体DOTAP介导转染细胞。将荷瘤裸鼠随机分为两组,分别注射质粒PcDNA3、Angiostatin/PcDNA3,观察两组动物的肿瘤生长曲线,检测肿瘤的Angiostatin、VEGF、HIF-1α表达和微血管密度(MVD),利用TUNEL染色法行原位细胞凋亡分析。结果:Angiostatin基因治疗在早期具有抑制肿瘤生长的作用,大约1周后肿瘤以更快的速度生长并迅速赶上空质粒对照组肿瘤;Angiostatin基因治疗组的肿瘤组织中有An-giostatin的局部高表达,MVD(24.8±2.8)低于空质粒对照组(30.2±4.1)(P〈0.05)。肿瘤组织中HIF-1α蛋白局部高表达,VEGF表达高于空质粒对照组,细胞凋亡指数(2.87±0.48)高于空质粒对照组(1.55±0.43)(P〈0.01)。结论:Angiostatin基因治疗对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有一定的抑制作用,肿瘤对Angiostatin基因治疗可以产生耐受性。     

RNA干扰靶向敲减ObR基因对MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的 探讨瘤内注射慢病毒介导的瘦素受体的特异性ObR- siRNA对MCF-7人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响.方法 建立荷MCF-7人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型,共30只,随机分为3组:ObR-siRNA慢病毒干预组、NC- siRNA阴性慢病毒对照组和空白对照组,同时在肿瘤部位周围皮下注射重组人瘦素.隔日测量并记录移植瘤的大小,Real-time PCR和Western blotting方法检测ObR的mRNA和蛋白水平的表达,测量肿瘤体积,计算肿瘤抑制率.结果 成功建立了具有高瘦素微环境的敲减ObR基因的荷MCF-7人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型.ObR- siRNA慢病毒干预组裸鼠移植瘤的体积与NC- siRNA阴性慢病毒对照组和空白对照组差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.01).ObR- siRNA慢病毒干预组中的ObR的mRNA和蛋白水平的表达明显降低,相对NC- siRNA阴性慢病毒对照组和空白对照组差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.01),其抑瘤率为88％.结论 利用慢病毒载体成功将ObR-siRNA导入移植瘤内,且能显著抑制MCF-7细胞裸鼠移植瘤的生长,提示瘦素受体有可能成为乳腺癌基因治疗的靶点.     

As2O3对人乳腺癌中NF-kB p65、survivin和caspase-3的作用及相关性研究

目的探讨As2O3对人乳腺浸润性导管癌裸鼠移植瘤组织中NF-kB p65、survivin及caspase-3表达的影响。方法复制人乳腺浸润性导管癌裸鼠移植瘤模型，共22只，随机分为3组：对照组、顺铂组及不同浓度（1．5、3．0mg／kg）的As2O3组（简称As2O3组）。用原位杂交法检测survivin mRNA的表达；用免疫组化法检测肿瘤组织NF-kBp65、survivin及caspase-3蛋白的表达。结果人乳腺浸润性导管癌裸鼠移植瘤中NF-kB p65蛋白及survivin mRNA和蛋白表达的阳性细胞密度As2O3组明显低于顺铂组和对照组（P〈0．01），顺铂组也低于对照组（P〈0．01）；而caspase-3蛋白表达结果则相反（P〈0．01）。NF-kB p65蛋白、survivin蛋白及survivinmRNA阳性表达间相互呈正相关，而三者的表达均与caspase-3蛋白表达呈负相关。结论As2O3可能通过抑制NF-rBp65的活性抑制survivin，从而激活caspase-3，诱导人乳腺浸润性导管癌细胞的凋亡，且呈剂量依赖性。     

Angiostatin基因联合反义HIF-1α基因治疗人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的研究Angiostatin基因联合反义缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因治疗人肝癌裸鼠皮下移植瘤的协同抑制作用。方法用人肝癌细胞株SMMC-7721建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤动物模型。四组荷瘤裸鼠分别注射质粒PcDNA3、Angiostatin/PcDNA3、HIF-1α/PcDNA3B、Angiostatin/ PcDNA3 HIF-1α/PcDNA3B。观察肿瘤生长曲线,检测肿瘤的Angiostatin、血管内皮生长因子(VEGF)、HIF-1α表达和微血管密度(MVD),利用TUNEL染色法行原位细胞凋亡分析。结果Angiostatin基因治疗在早期具有抑制肿瘤生长的作用;Angiostatin基因治疗组的MVD(24.8±2.8)低于空质粒对照组(30.2±4.1),VEGF表达高于空质粒对照组,细胞凋亡指数(2.87±0.48)高于空质粒对照组(1.55±0.43);联合治疗组有明显抑制肿瘤生长的作用,HIF-1α局部低表达,MVD (14.6±2.1)低于Angiostatin基因治疗组(24.8±2.8),VEGF表达低于单独治疗组,细胞凋亡指数(5.12±0.63)高于单独治疗组。结论肿瘤对Angiostatin基因治疗可以产生耐受性;反义HIF-1α基因阻断肿瘤的缺氧适应途径在一定程度上解决了抗血管生成治疗的耐药性问题。     

pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因靶向性治疗人原发性肝癌的实验研究

目的研究pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因对人肝癌细胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的靶向性治疗作用。方法建立人原发性肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分成肿瘤对照组、空质粒组、丙氧鸟苷（GCV）组、pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组5组。于瘤体内分别直接注射不同的质粒,同时于裸鼠腹腔内注射GCV,观察不同时段皮下肿瘤的生长情况并做病理学检查,免疫组化法检测肿瘤微血管密度（MVD）以及血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达量,原位末端标记（TUNEL）法检测细胞原位凋亡。放免法检测裸鼠血清甲胎蛋白（AFP）的变化,透射电镜观察肿瘤细胞超微结构的变化。结果裸鼠皮下成瘤率100%;pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、血清AFP含量、肿瘤MVD和VEGF表达强度均明显低于对照组、空质粒组和GCV组（P〈0.05）,细胞凋亡指数都明显高于后3组（P〈0.05）,可见较多的凋亡细胞。而pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、AFP、MVD及VEGF表达强度又明显低于pcDNA3/TK/An-gio组（P〈0.05）,凋亡指数高于后者（P〈0.05）。结论pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因系统可显著抑制肿瘤的生长,有望成为治疗原发性肝癌的新型生物制剂之一。     

Survivin反义寡核苷酸对乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用研究

目的探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法30只裸鼠建立人乳腺癌MCF-7细胞移植瘤动物模型。成瘤后动物随机分3组，每组10只。分别于瘤周及瘤体注射阳离子脂质体（1ipofectin，Lip），ASODN／Lip及NODN／Lip，每5天1次，共3次。观察肿瘤抑制率、肿瘤体积和裸鼠体重的变化。用TUNEL法，透射电镜观察体内瘤体的细胞调亡情况；用Western—blot检测各组肿瘤的survivin蛋白表达情况。结果成功建立了裸鼠皮下移植瘤模型。ASODN／Lip治疗组的肿瘤体积在治疗期内减少，抑瘤率达70．10％；而NODN／Lip治疗组和Lip对照组肿瘤体积增加。各组裸鼠体重无明显变化。ASODN／Lip组细胞凋亡率为38．6％明显高于其他两组，差异有显著性（P〈0．05）。ASODN／Lip组肿瘤的survivin蛋白表达明显降低。结论survivin反义寡核苷酸可有效地抑制人乳腺癌裸鼠皮下肿瘤的生长速度，并促进诱导肿瘤细胞的凋亡。     

血管生长抑素基因抑制胰腺癌裸鼠移植瘤血管生成的实验研究

目的:探讨人血管生长抑素基因对胰腺癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响。方法:建立人胰腺癌细胞株BXPC-3裸鼠移植瘤模型,应用人血管生长抑素基因质粒转染胰腺癌裸鼠移植瘤,观察移植瘤生长情况。采用免疫组织化学技术检测肿瘤血管内皮生长因子(VEGF)表达情况和微血管密度(MVD)差异,透射电子显微镜观察肿瘤细胞情况。结果:治疗组肿瘤体积明显小于空白对照组和空质粒组(P<0.01),VEGF主要表达在肿瘤细胞的胞质内,治疗组、空白对照组和空质粒组平均灰度分别为179.57±5.22、150.87±3.44和163.40±3.54;阳性单位分别为14.94±2.26、31.26±2.72和29.21±2.95;MVD分别为10.60±74.56、19.33±2.52和18.67±5.29,治疗组与空白对照组和空质粒组比较,差异有统计学意义(P均<0.05)。电子显微镜下治疗组可见大量肿瘤细胞坏死。结论:人血管生长抑素基因能明显抑制胰腺癌裸鼠移植瘤血管生成,促进肿瘤细胞坏死,进而抑制肿瘤生长。     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。