空肠弯曲菌hipO基因的Real-time PCR检测研究

目的建立基于新型Taqman荧光探针的荧光实时(Real-time)PCR方法用于空肠弯曲菌的筛选检测与快速鉴定。空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是近十几年来在世界范围内广泛重视的人畜共患病原菌,可以导致人类的急性肠炎与食物中毒,并能引发格林-巴利综合征等并发症。为更好地利用分子生物学技术对空肠弯曲菌进行快速、准确的基因检测,本研究从样品增菌液与单菌落中提取细菌DNA,建立了针对空肠弯曲菌特异的hipO(hippuricase,马尿酸酶)基因的Real-time PCR方法,用于空肠弯曲菌的快速筛选检测与可疑菌落快速鉴定。试验结果表明,该方法检测细菌的灵敏度为1~10CFU,人工布菌鸡肉的检测灵敏度为1~10CFU。本研究所建立的空肠弯曲菌荧光实时PCR方法具有准确、可靠、快速的特点。     

动物及其产品中空肠弯曲菌PCR检测方法的建立

目的建立快速检测空肠弯曲菌的PCR方法。方法从鸡猪样品中分离培养获得空肠弯曲菌,以该菌特异的VS1基因保守序列为模板自行设计引物,扩增产物为516bp片段,同时进行特异性、灵敏度试验。结果显示该方法只对空肠弯曲菌有扩增产物出现,而其它细菌如大肠杆菌、沙门氏菌、无乳链球菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ATCC、腐生葡萄球菌等均不能扩增出特异性片段,检测灵敏度达6 CFU/ml。结论该方法具有灵敏、高效、特异、稳定的特点。     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的建立一种快速廉价的检测空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR方法。方法根据空肠弯曲菌flaA、gyrA基因设计引物,建立空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法。结果以flaA基因引物对空肠弯曲菌DNA进行实时荧光定量PCR,扩增曲线呈S形指数增长,大肠埃希菌等对照菌扩增阴性。方法的灵敏度为10CFU/ml菌悬液。结论建立的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、准确等特点,具有一定的使用价值。     

EMA-qPCR检测空肠弯曲活菌方法研究

目的 建立一种快速定量检测食品中“活的”空肠弯曲菌的技术方案。方法 通过对10³ CFU/m~10⁶ CFU/mL的空肠弯曲菌进行叠氮溴化乙锭(EMA)的前处理研究,建立区分死菌与活菌的EMA前处理技术,与荧光定量PCR检测弯曲菌的方法相结合,建立EMA-qPCR组合检测技术,并进行模拟食品标本的验证。结果 空肠弯曲菌在10³ CFU/mL~10⁶ CFU/mL内,EMA的最优使用浓度为5 μg/mL,5 μg/mL的EMA-qPCR可区分出死/活空肠弯曲菌混合物中的死菌和活菌,并成功应用于模拟食品标本中“活的”空肠弯曲菌的检测。结论 EMA-qPCR可作为快速定量检测样本中“活的”空肠弯曲菌的方法。     

变性高效液相色谱检测空肠弯曲菌

目的应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌的快速检测方法。方法以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因为靶基因,选择2对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌的多重PCR体系,扩增产物分别为287bp、159 bp。采用22株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到10 pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24 h可被检出。结果在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性。结论本研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌的快速检测。     

空肠弯曲菌蛋白抗原分析

超声粉碎和高速离心获得Ｃ．ｊ－Ｓ１３１ｌｙｓａｔｅ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示位于１０－９２ＫＤ间２４条蛋白条带，薄层扫描发现４３ＫＤ蛋白是菌体最主要成份，其次是１５ＫＤ和１７ＫＤ蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ发现Ｃ。ｊ－Ｓ１３１ｌｙｓａｔｅ中４３ＫＤ蛋白抗原性最强，也最早诱导相应抗体产生。用凝胶过滤和液相制备型等电聚焦分离获得了纯化的９２ＫＤ、４３ＫＤ、１５ＫＤ三种蛋白。本文结果为进一步研究空弯菌诱致自身免疫综合征的分子机理打下了基础。     

扬州市区腹泻人群空肠弯曲菌和结肠弯曲菌流行状况及耐药性分析

目的了解扬州市区腹泻人群中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的感染流行和耐药性状况。方法采用多重PCR方法对扬州市区两所医院门诊部和住院部的腹泻人群进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌感染状况调查,采用琼脂扩散法测定分离株的耐药性。结果在2937份粪便样品中,142份空肠弯曲菌阳性、平均阳性率4.83%,10份结肠弯曲菌阳性、平均阳性率0.34%。不同医院间感染率差异不显著(P>0.05),门诊部感染率极显著高于住院部(P<0.01),7岁以下幼儿感染率极显著高于其它人群(P<0.01),6月-8月感染率显著高于其它月份(P<0.05)。93株空肠弯曲菌分离株对21种抗生素高度敏感的是:庆大霉素91.40%、阿齐红霉素89.25%、红霉素88.46%、阿莫西林87.10%、链霉素83.87%、头孢噻肟81.72%、卡那霉素81.72%,高度耐药的是:头孢哌酮100%、复方新诺明100%、头孢拉定97.85%、头孢克罗93.55%、环丙沙星91.40%、萘啶酸91.40%、左旋氧氟沙星88.17%、土霉素87.50%。耐药菌株耐药谱主要集中在9耐至14耐,达81.71%,两医院分离株多重耐药性无显著性差异(P>0.05),不同诊区分离菌多重耐药性存在显著性差异(P<0.05)。结论扬州市区腹泻人群空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的流行及耐药状况呈现多样化和复杂化,研究结果为正确评价腹泻人群弯曲菌的流行状况和制定切实可行的防控措施提供了科学依据。     

胎儿弯曲菌PCR检测方法的建立及其初步应用

目的 建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法。方法 以胎儿弯曲菌表面蛋白基因sapB2为靶基因,应用软件设计特异性引物,通过反应条件的优化,引物敏感性、特异性和灵敏度的试验以及模拟污染样品的检测,建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法并应用于临床样品检测。结果 该研究建立的PCR方法能特异性扩增胎儿弯曲菌sapB2(789 bp)基因片段,空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、唾液弯曲菌和豚肠弯曲菌以及其他17株参考菌如大肠杆菌、沙门菌等均未扩增出条带;胎儿弯曲菌纯培养物最低可检出0.23 pg/μL的DNA,模拟感染样品污水和奶牛粪便样品中胎儿弯曲菌的最低检出量分别为0.9 CFU/mL和20 CFU/g;临床样品检测中,400份奶牛肛门擦拭样品和125份产妇阴道擦拭样品的PCR检测结果均为胎儿弯曲菌阴性,与传统的平板分离方法同步检测结果一致。结论 所建立的胎儿弯曲菌PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、简便快速等特点,为胎儿弯曲菌的快速检测提供了技术支持,对识别该菌株的暴发流行,相关疾病的诊断和控制具有重要意义。     

江苏奶牛空肠弯曲菌和结肠弯曲菌流行状况及耐药性分析

目的了解江苏省奶牛空肠、结肠弯曲菌流行及耐药状况。方法采用多重PCR方法对10个奶牛场的产奶牛、育成牛和饲养环境进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌流行状况调查,采用琼脂扩散法测定分离株的耐药性。结果1531份样品中,119份空肠弯曲菌阳性,平均阳性率7.77%;3份结肠弯曲菌阳性,平均阳性率0.20%;空肠弯曲菌、结肠弯曲菌阳性率最高分别为30.91%、3.57%。在三类样品中,产奶牛空肠弯曲菌、结肠弯曲菌阳性率分别为5.02%、0.32%,育成牛空肠弯曲菌阳性率为8.70%、未检出结肠弯曲菌,环境样品空肠弯曲菌、结肠弯曲菌阳性率为10.28%、0.18%。35株奶牛空肠弯曲菌分离株对8大类21种抗生素高度敏感率的是:阿莫西林100%、阿齐红霉100%、链霉素97.14%、庆大霉素94.29%、红霉素91.43%、头孢噻肟82.86%、克林霉素82.86%;高度耐药率的是:头孢哌酮100%、恩诺沙星100%、环丙沙星97.14%、复方新诺明97.14%、左旋氧氟沙星94.29%、萘啶酸94.29%、头孢拉定94.29%、诺氟沙星91.43%、头孢克罗88.57%。菌株耐药谱显示,35株分离株的耐药主要集中在9耐到12耐,占88.57%,产奶牛分离株的多重耐药性较其它分离株更严重。结论我国奶牛群中空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的流行和耐药状况呈现多样化和复杂化,研究结果为正确评价我国奶牛群弯曲菌的流行状况和制定切实可行的防控措施提供科学依据。     

结肠弯曲菌Real-time PCR检测方法的建立(英文)

目的建立结肠弯曲菌实时PCR检测方法并评价该方法的可行性。方法BLAST与Vector NTI Suite 6.0筛选出结肠弯曲菌的特异基因ceuE作为检测靶基因,Primer 5.0和Oligo6.0设计引物和探针,优化实时PCR反应体系并评价其最低检测限、特异性、可重复性。结果与结论在结肠弯曲菌的ceuE特异基因上设计引物和探针,经优化了的实时PCR反应体系最低检测限为5.62CFU,特异度为100%,变异系数为0.15%～1.30%,本研究为结肠弯曲菌的快速检测提供了一种参考方法。     

Campylobacter jejuni myocarditis

A case of Campylobacter jejuni (C. jejuni) myocarditis in a young man is described. C. jejuni was isolated from the patient's stools and he developed specific antibodies to this organism. Tests for other etiological agents (Salmonella, Shigella, Brucella abortus, β-hemolytic streptococcus Group A, Treponema pallidum and coxsackievirus B) proved negative.     

鸡肉生产链空肠弯曲杆菌的耐药性研究

目的 了解鸡肉生产链(养殖场-屠宰场-市场)中空肠弯曲杆菌分离株的耐药情况。方法 针对成都市及雅安市养鸡场、屠宰场和市场中分离的180株空肠弯曲杆菌,采用微量肉汤稀释法,检测鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌对8种抗菌药物的耐药情况;采用错配扩增突变分析PCR(MAMA PCR)技术,检测137株耐环丙沙星的空肠弯曲杆菌的gyrA基因第257位突变情况,对gyrA基因突变进行分析。结果 药敏试验表明,空肠弯曲杆菌分离株对环丙沙星、左氟沙星、四环素和克林霉素的耐药率较高,分别为94.44%、93.89%、91.67%和78.33%;对红霉素(20.00%)、链霉素(20.56%)、庆大霉素(17.78%)、氟苯尼考(12.22%)呈现不同的耐药率。从养殖场到市场,鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌对上述8种抗菌药物的耐药率呈持平或上升趋势。MAMA PCR 结果表明,95.62%(131/137)的环丙沙星耐药空肠弯曲杆菌在gyrA基因第257位发生点突变,10株环丙沙星敏感菌株均没有检测出gyrA基因的突变;gyrA基因耐药决定区的测序结果表明,环丙沙星耐药菌株MJF31和MJF53都在第257位碱基发生了ACA→ATA(苏氨酸到异亮氨酸)的突变,而对环丙沙星敏感的菌株JF9和JF136均未发生该类突变。结论 鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌耐药性比较普遍,对喹诺酮类药物耐药率较高,多重耐药菌株较突出,应加强对养殖场和食品源空肠弯曲杆菌耐药性的监测。     

猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。方法 根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR),进行了FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PCMV 感染临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了比对;对FQ-PCR检测结果为PCMV 阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测。结果 成功建立了PCMV 的FQ-PCR方法,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;检测灵敏度可达1 拷贝/μL,是常规PCR的100倍;特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好;对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行应用检测表明,其中有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。猪的内脏器管中PCMV含量最高为扁桃体,最低的为小肠。结论 成功建立了PCMV FQ-PCR方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测,对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。     

格林巴利综合征相关及单纯腹泻相关空肠弯曲菌细胞毒作用分析

目的分析格林-巴利综合征(GBS)相关空肠弯曲菌细胞毒素(CDT)作用。方法9株GBS相关空肠弯曲菌以及4株腹泻患者分离菌株的全菌蛋白分别以0.001μg～5μg/mL的浓度作用于HeLa细胞,通过观察细胞形态的改变,获得不同菌株对细胞作用的差异。结果不同菌株间产生细胞毒作用的浓度范围从0.01μg/mL到5μg/mL。结论GBS相关菌株对HeLa细胞的细胞毒素作用与腹泻患者分离株相比没有显著差异。不同空肠弯曲菌菌株对HeLa细胞的细胞毒素作用具有菌株特异性。