NF-κB圈套性寡核苷酸诱导骨髓DC疫苗的实验研究

目的 体外诱导、培养大鼠(Lewis大鼠)骨髓来源改良树突状细胞(DC),为进一步研究核苷酸圈套技术抗移植排斥反应作准备.方法 Lewis大鼠骨髓造血干细胞,体外经重组大鼠细胞因子GM-CSF、IL-4诱导成DC;核因子-κB(NF-κB)圈套寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)用于阻止DC的成熟,降低细胞表面分子的表达,制备改良的DC;LPS用于刺激DC的成熟.流式细胞仪检测DC表面分子CD11c、CD80、CD86等的表达情况,分析DC的细胞特性.结果 体外GM-CSF和IL-4诱导的大鼠骨髓来源DC纯度高、数量丰富.NF-κB decoy ODN能明显降低DC表面分子(CD11c、CD80、CD86等)的表达,表现为非成熟状态;经LPS刺激仍能保持非成熟状态.结论 经NF-κB decoy ODN处理的大鼠骨髓来源DC,其状态稳定,低表达表面分子和共刺激分子,可作为进一步研究的DC疫苗.     

NF-κB在急性移植肾排异中的作用

目的研究转录因子NF-κB在肾移植急性排斥反应中的作用.方法ACI大鼠为供体,LEW大鼠为受体建立急性排斥动物模型,将移植肾分离制成核蛋白提取液,采用gelshift方法观察移植肾组织NF-κB与炎性基因启动子中特殊基因序列的结合能力,并以LEW大鼠同为供受体的移植肾作为对照.结果在急性排斥反应移植肾中,NF-κB的结合能力明显高于无排斥反应的同系移植肾.结论NF-κB在同种异体移植物中的强表达可能是急性排斥中的关键因素,提示可通过抑制NF-κB活性来降低移植物的排斥反应.     

儿童过敏性紫癜发病中NF-κB对树突状细胞的调控与T辅助细胞分化失衡的关系

目的 了解儿童过敏性紫癜发病中NF-κB对树突状细胞的调控与T辅助细胞分化失衡的关系.方法 收集我院2008年6月至2009年3月肾脏免疫科收治的过敏性紫癜(henoch-schonlein purpura,HSP)患儿36例和过敏性紫癜肾炎(henoch-schonlein purpura nephritis,HSPN)患儿32例,以及门诊体检的健康儿童27例,抽取外周血,诱导培养树突状细胞(dendritic cells, DC),于第5天分别抽取7例以上3组外周血诱导培养的DC加入NF-κB抑制剂5 μg,分别采用ELISA、流式细胞技术、RT-PCR和细胞免疫化学方法,检测患儿血浆IL-4、INF-γ和DC培养上清IL-12、IL-10水平;DC表面CD86、CD80、CD83、CD-209的表达;DC内NF-κB亚型p50、p65 mRNA表达量和NF-κB活化情况.结果 与对照组比较,HSP组和HSPN组血浆中Th2类细胞因子IL-4升高(P<0.05),Th1类细胞因子INF-γ降低(P<0.05);DC培养上清中IL-10升高(P<0.05),IL-12降低(P<0.05);CD86、CD83升高(P<0.05),CD80降低(P<0.05);细胞内NF-κB p50、p65 mRNA 表达量也升高(P<0.05);NF-κB活化表达数量增多.但HSP组与HSPN组以上检测指标2组比较差异无统计学意义(P>0.05).加入NF-κB抑制剂后以上各项异常指标可逆转,且逆转后与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 HSP发病与DC异常调控Th1/Th2细胞失衡密切相关,NF-κB是DC免疫功能的关键性调控基因,抑制NF-κB的活化是阻断DC功能和依赖于T细胞免疫反应的一个有效靶点.     

NF-κB在急性移植肾排异中的作用

目的研究转录因子NF-κB在肾移植急性排斥反应中的作用。方法 ACI大鼠为供体，LEW大鼠为受体建立急性排斥动物模型，将移植肾分离制成核蛋白提取液，采用gelshift方法观察移植肾组织NF-κB与炎性基因启动子中特殊基因序列的结合能力，并以LEW大鼠同为供受体的移植肾作为对照。结果 在急性排斥反应移植肾中，NF-κB的结合能力明显高于无排斥反应的同系移植肾。结论 NF-κB在同种异体移植物中的强表达可能是急性排斥中的关键因素，提示可通过抑制NF-κB活性来降低移植物的排斥反应。     

核转录因子-κB在同种异基因小鼠角膜移植排斥反应中的表达

目的:检测小鼠角膜移植后核转录因子κB(NF-κB)活性变化.方法:建立以C57BL/6小鼠为供体,以BALB/c小鼠为受体角膜移植实验模型,随机分为A、 B、 C三组,A组为正常小鼠组,B组为自体角膜移植作为对照组,C组同种异基因角膜移植作为实验组,ELASA方法检测小鼠角膜移植后 3 d、 5 d、 7 d 角膜NF-κB的活性变化.结果:组织学检查证实,同种异基因小鼠角膜移植后 14 d 见明显淋巴细胞浸润. 3 d、 5 d 角膜NF-κB的活性升高, 7 d 达到高峰,与原位移植组有显著差异(P＜0.01).结论:小鼠同种异基因角膜移植后,角膜NF-κB的活性升高,可能参与移植排斥.     

树突状细胞对大鼠牙移植后组织学及Th1/Th2细胞因子影响的研究

目的研究不同来源树突状细胞(dendritic cell,DC)对大鼠同种异体牙移植后免疫排斥反应的抑制效果。方法用BN大鼠60只、Lewis大鼠80只分别作为供、受体建立牙移植模型,将动物完全随机分为4组,每组各20只:A组为同基因牙移植组,将Lewis大鼠牙移植到Lewis大鼠;B、C、D组为同种异体牙移植组,将BN大鼠牙移植到Lewis大鼠;A、B组于术前7 d通过尾静脉输注PBS 0.5 ml于受体大鼠体内,C组于术前7 d通过尾静脉输注1×106/只的供体致耐受DC于受体大鼠体内,D组于术前7 d通过尾静脉输注1×106/只的受体致耐受DC于受体大鼠体内。各组于术后第1、2、4、8周随机处死5只大鼠,行移植牙病理学检查和ELISA检测外周血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10浓度。结果 C、D组IL-2、IFN-γ在各时间点均高于A组低于B组,IL-4、IL-10在各时间点均高于A、B组(P<0.05)。C组IL-2在第1周时低于D组,到第8周时则高于D组(P<0.05)。C组IL-4、IL-10在第1、2周时高于D组,到第8周时则低于D组(P<0.05)。C、D组牙根吸收较B组有所减少但仍高于A组(P<0.05),C、D组牙根吸收在2、4周时没有差异,在8周时D组低于C组(P<0.05)。C、D组炎性细胞浸润较B组均明显减轻但重于A组。结论供、受体致耐受DC均可抑制大鼠同种异体移植牙的排斥反应,减轻排斥反应程度。供体致耐受性DC对早期急性排斥反应抑制更明显,受体致耐受性DC对晚期慢性排斥反应抑制更明显。     

白细胞介素10和γ干扰素基因表达在大鼠肝移植排斥反应诊断中的意义

目的:研究探讨白细胞介素10和γ干扰素基因表达在大鼠肝移植排斥反应诊断中的意义。方法:以成年、健康的二级雌性SD大鼠、Wistar大鼠为研究对象,体重为(250±20)g,实施肝移植手术,术后采用RT-PCT技术对大鼠白细胞介素10(IL-10)和γ干扰素基因(IFN-γ)表达进行检测,并以组织病理学结果为急性排斥反应的诊断标准,将大鼠分为排斥组与非排斥组,对比观察两组大鼠的IL-10与血清IFN-γ含量及移植肝脏内IL-10与IFN-γ基因表达情况。结果:同系移植组肝移植后肝细胞、组织、结构轻微变化,同种异体移植组则变化显著,严重紊乱。同系移植组血清IL-10含量最高,显著高于同种异体移植组与对照组(P0.05);同种异体移植组IFN-γ含量最高,显著高于同系移植组与对照组(P0.05)。同系移植组肝脏IL-10 m RNA表达水平显著高于对照组与同种异体移植组(P0.05);同种异体移植组IFN-γm RNA表达水平显著高于对照组与同系移植组(P0.05)。结论:大鼠肝移植手术后发生排斥反应的IL-10表达显著降低,IFN-γ表达显著增高,两者表达的变化可作为早期诊断肝移植术后急性排斥反应的诊断指标,为临床诊断提供依据。     

灼烧技术治疗慢性扁桃体炎对患者免疫功能的影响

目的 探讨灼烧技术治疗慢性扁桃体炎(CT)对患者免疫功能的影响和作用机制.方法 选择2013年6月至2016年12月于西南医科大学附属中医医院耳鼻咽喉科门诊就诊并临床诊断为CT的患者20例为观察组,同期西南医科大学在校学生及西南医科大学附属中医医院招募的健康志愿者6例为对照组,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测观察组治疗前后Toll样受体(TLR)-核因子-κB(NF-κB)信号通路中的TLR2、TLR4、NF-κB在外周血的水平,同时检测部分关键细胞因子白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10及干扰素γ(INF-γ)、转化生长因子β(TGF-β)在外周血的水平.结果 观察组CT患者灼烧治疗前血清中TLR2、TLR4、NF-κB、IL-4、IL-5、IL-10、INF-γ及TGF-β水平均明显高于对照组(P＜0.05);与治疗前比较,观察组患者治疗后上述指标均明显降低(P＜0.05).观察组患者治疗前血清中TLR2、TLR4、IL-4、IL-5、IL-10、INF-γ及TGF-β表达水平与NF-κB无明显相关性(P＞0.05);灼烧治疗后血清中只有TLR2水平与NF-κB呈正相关(r=0.49,P=0.04),而其他检测指标与NF-κB无明显相关性(P＞0.05).结论 灼烧技术治疗CT后患者血清中免疫因子水平明显降低,其治疗CT的机制可能与TLR-NF-κB信号通路及该通路的关键细胞因子关系密切.     

靶向核因子κB的圈套核苷酸策略在疾病研究中的应用

圈套核苷酸技术是一种新型的抑制转录因子转录激活的基因操作技术,目前已广泛应用于疾病研究。核因子κB(NF-κB)圈套核苷酸是针对κB序列(5′-GGGACTTTCC-3′)设计的双链核苷酸序列,其可与活化的NF-κB二聚体结合而抑制目的基因的转录表达。NF-κB圈套核苷酸是目前研究应用最多的圈套核苷酸,已在肿瘤、心血管、神经、风湿、呼吸、肾脏和器官移植等相关疾病的治疗性研究中获得肯定的疗效。     

姜黄素类似物D33对大鼠机体免疫耐受的影响及机制

目的 姜黄素类似物D33对同种异体肢体移植原位再植模型大鼠的免疫功能的作用及机制。方法 构建SD/Wistar大鼠的同种异体肢体移植原位再植模型,随机分为对照组和D33组,D33组每日腹腔注射20mg/kg D33,对照组注射等体积生理盐水。另选择正常Wistar大鼠作为正常组。流式细胞术分析各组T细胞亚型分布以及血液中炎性因子TNF-α、IL-1、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10 的含量。从D33组大鼠的胰岛和淋巴组织中分别分选受者来源DC细胞和供者来源DC细胞,Western blot法检测DC细胞中NF-κB、p38/MAPK、ERK/MAPK和Ⅰ型 IFN（IFN-α/β）通路的激活情况。结果 D33的大鼠的移植手术效果较佳。D33组受鼠血液中CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺的比例均低于对照组,但高于正常组。D33组中TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2和IL-5水平均低于对照组,而IL-4和IL-10水平高于对照组。受者来源DC细胞中,D33可明显抑制NF-κB、p38/MAPK、ERK/MAPK和Ⅰ型IFN（IFN-α/β）通路的激活,在供者来源DC细胞中,D33的影响并不明显。结论 D33通过抑制TLR4相关通路诱导机体免疫耐受。     

核因子-κB寡脱氧核苷酸策略对胶原诱导关节炎大鼠细胞因子调节研究

目的: 探讨核因子-κB(NF-KB)寡脱氧核苷酸(ODN)局部应用对Ⅱ型胶原诱导关节炎(CIA)大鼠的治疗作用及机制。方法: 建立Ⅱ型CIA大鼠模型,用NF-κB圈套ODN注射到大鼠右后踝关节腔内,并设空白对照组、CIA模型组和实验组。42 d后观察各组关节炎指数、病理指标,采用酶联免疫吸附试验法检测各组大鼠血清和关节液中白细胞介素(IL)-17、IL-12和转化生长因子-β(TGF-β)的水平。结果: 与空白对照组比较,CIA模型组大鼠血清和关节液中IL-17和IL-12水平均明显升高,而TGF-β水平显著降低(P<0.01),而实验组经NF-κB圈套ODN注射后,与CIA模型组比较,血清和关节液中IL-17和IL-12水平均明显降低,而TGF-β水平显著升高(P<0.01)。结论: NF-κB圈套ODN明显抑制CIA大鼠外周血和关节液中IL-17、IL-12的产生,促进TGF-β水平的增加,对CIA有较好的治疗作用。     

腺病毒介导人白介素-10转基因对大鼠同种异体移植血管IL-2、TNF-α的影响

目的:观察腺病毒介导人白介素-10(hIL-10)转基因对大鼠同种异体移植血管IL-2、TNF-α的影响及其可能的作用机制。方法:以Wistar大鼠为供体,SD为受体,采用颈动脉显微外科原位吻合技术,将经直接浸泡法转染腺病毒介导hIL-10的离体供血管植入受体血管。随机分为3组:I组(空白对照组,n=9),II组(空载体组,n=10),III组(基因转染组,n=10)。移植后5d,观察移植物病理组织学变化及免疫排斥级别;RT-PCR、ELISA、免疫组化染色检测移植血管hIL-10基因产物;免疫组化染色检测IL-2、TNF-α。结果:基因转染组移植血管有效地表达特异性hIL-10基因产物。与对照组比较,急性排斥级别降低(P<0.01);IL-2、TNF-α的表达量明显下降(P<0.01)。结论:腺病毒介导人白介素-10转基因能有效地下调IL-2、TNF-α表达,诱导移植血管局部免疫抑制状态,抑制同种异体移植血管的急性排斥反应。     

IDO基因转染延长同种异基因大鼠移植心脏的存活

目的:了解逆转录基因载体介导的吲哚胺-2,3-加双氧酶(IDO)基因转染能否延长同种异基因大鼠移植心脏的存活时间及机理。方法:把同种异基因大鼠心脏移植模型(Lewis→BN)分成4组,A组为对照组,同种异基因大鼠心脏移植(Lewis→BN);B组:IDO基因转染后的供体心脏移植给受体大鼠;C组:空载体转染供体心脏,再移植给受体大鼠;D组:同种异基因大鼠心脏移植 CsA组(CsA5mg/kg/d×7天)。观察记录移植心脏的存活时间及术后6天组织病理学检查明确排斥反应的诊断和分级,RT-PCR检测术后6天移植心脏TNF-α的mRNA表达,FCM检测外周血活化的T细胞(CD3 CD25 )、有核细胞CD86 表达等方法探讨其机理。结果:A、B、C、D组移植心脏平均存活时间为7.2±0.45、13.2±2.16、7.1±0.62和15.6±3.21天,其中B、D组术后6天CD3 CD25 、有核细胞CD86 表达、供心组织急性排斥反应的强度和TNF-α的mRNA表达较A、C组显著降低(P<0.05),A、C组具有典型重度急性排斥反应特征而B、D组最轻。结论:逆转录基因载体介导的IDO基因转染能够延长移植心脏存活时间的作用,其机理包括抑制反应性T细胞、抑制有核细胞共刺激信号CD86表达、抑制心肌组织表达TNF-α等。     

NF-κB P65在大鼠异种心脏移植后心肌中的表达及意义

目的 复制小鼠→大鼠异种心脏移植模型,探讨核转录因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)P65蛋白在异种移植心肌中的表达及NF-κB的DNA结合活性.方法 动物随机数字法分成2组:A组(对照组),n=6;B组(移植组),n=6.采用免疫印迹杂交法(Western blot)检测对照组及移植组心肌组织NF-κB P65表达,凝胶电泳迁移率实验检测NF-κB DNA结合活性.结果 移植组的NF-κB P65蛋白表达和NF-κB DNA结合活性均显著高于对照组(P＜0.05).结论 NF-κB的激活可能在大鼠异种移植心脏排斥反应中起着重要作用.     

NF-κB靶向性哑铃形"圈套"寡核苷酸抑制肾小球系膜细胞IL-6的表达

目的 设计合成靶向NF-κB的哑铃形“圈套”ODNs，并检测其对N-κB转录活性和’肾小球系膜细胞IL-6表达的抑制效应。方法 采用电泳迁移率改变实验(EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF-κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞，随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将2、4、8mg/L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞，6h后用LPS刺激，收集转染后8、12、18h上清和细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清IL-6蛋白表达，逆转录PCR(RT-PCR)法检测IL-6mRNA转录。结果 哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF-κB与其顺式元件的结合；4、8mg/L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞IL-6转录和表达。结论 靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF-κB的转录活性，从而对体外培养的肾小球系膜细胞炎性因子IL-6的表达具有抑制效应。     

干扰素-γ对急性胰腺炎大鼠NF-κB及细胞因子的影响

目的探索干扰素-γ（INF-γ）对胰腺炎细胞因子的影响。方法在建立大鼠急性胰腺（acutepancreatitis,AP）模型基础上,将SD大鼠随机分为Ap 6、12、24、48h组,INF-γ6、12、24、48h组及对照组,每组10只,进行干预实验。采用鲎试剂合成基质偶氮法和ELISA检测血清淀粉酶、内毒素、TNF-α、IL-18、IL-27;同时检测肠系膜淋巴结细菌移位、回肠黏膜病理学改变。通过免疫荧光双重染色观察胰腺组织中TNF-α、NF-κB、IL-18改变。结果血清淀粉酶在AP 6h时明显升高,术后48h下降,IFN组升高更明显。TNF-α在AP组有所上升,但IFN组上升不明显。IL-18在AP组和IFN组有不同程度上升,IFN 48h组升高更明显。IL-27在AP组和IFN组有不同程度上升,高峰在术后24 h,但与IFN 24 h组比较AP 24h组有一定程度下降。AP组胰腺组织呈急性胰腺炎病理改变,其中TNF-α、NF-κB和IL-18免疫荧光染色均增加。IFN组胰腺组织及其间隙水肿更加明显,血管充血,炎症细胞浸润,其中TNF-α免疫荧光染色强于对照组但低于AP 12h组,NF-κB和IL-18染色则均较对照组和AP组高。结论 IFN-γ可使血清IL-18升高、IL-27降低,胰腺组织NF-κB、IL-18升高,可通过影响胰腺炎细胞因子加重胰腺炎。采取措施控制IFN-γ水平,可能在一定程度上会减轻胰腺炎。     

环孢素对心脏移植大鼠急性排斥反应及血清IDO活性的影响

目的 探讨不同剂量的强效免疫抑制剂环孢素(CsA)对同种异基因心脏移植大鼠急性排斥反应程度和血清吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)活性的影响.方法 分别以SD和Wistar大鼠为供、受体,建立同种异基因大鼠颈部异位心脏移植模型.18只受体大鼠随机分为对照组、低剂量CsA组(CsA 2 mg·kg-1·d-1)和高剂量CsA组(CsA 15 mg·kg-1·d-1),每组6只.术后第7天,所有受体大鼠经腹主动脉采集血样后处死,取移植心脏制备组织学检查标本.ELISA法检测血清白介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)水平;高压液相色谱法检测血清犬尿氨酸和色氨酸浓度,计算两者比值并以此估算IDO活性.移植心脏标本常规HE染色,采用Stanford标准进行急性排斥反应程度分级.结果 三组血清IL-2和IFN-γ水平以及IDO活性比较显示,对照组＞低剂量CsA组＞高剂量CsA组,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).三组移植心脏急性排斥反应程度分级结果显示,对照组＞低剂量CsA组＞高剂量CsA组,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 CsA可明显减轻同种异基因大鼠移植心脏急性排斥反应程度并降低血清IDO活性,两者变化趋势一致且与CsA的使用剂量有关.提示血清IDO活性监测有可能成为一种无创性移植器官急性排斥反应及其程度的预测和评估方法.     

茵陈承气汤对大鼠重症急性胰腺炎NF-κB活性及炎症介质表达的影响

摘要：目的探讨NF-κB在重症急性胰腺炎各器官中的表达及其介导的细胞因子TNF-a、IL-10表达的变化，并研究茵陈承气汤对NF-κB活性及炎症介质表达的影响。方法采用十二指肠乳头逆行插管注射牛磺胆酸钠法建立大鼠重症急性胰腺炎模型，60只健康SD大鼠随机分为对照组、模型组和中药治疗组，每组20只。采用免疫组织化学法检测胰腺、肺和空肠组织NF-κB的活性和放免法检测TNF-a、IL-10的表达，并取胰腺、肺和空肠组织甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木精-依红染色后光学显微镜下观测组织形态学变化。结果NF-κB的活性及TNF-a、IL-10的表达3组中差异明显；中药治疗组与模型组比较，胰腺、肺和空肠组织NF-κB的活性和TNF-a、IL-10的表达水平均明显降低（P〈O．05）；病理观察：胰腺、肺和空肠组织损伤对照组无明显形态学变化，模型组较重，中药治疗组明显改善。结论NF-κB在重症急性胰腺炎的胰腺病变、肺损伤、空肠损害中起重要作用；茵陈承气汤能有效改善病情，可能与抑制NF-κB的活性有关。     

大黄素对大鼠肝移植排斥反应相关细胞因子的影响

目的探讨大黄素对肝移植大鼠排斥反应中相关细胞因子表达的影响。方法采用大鼠原位肝移植模型,随机分为3组:对照组、移植组、大黄素组,于术后第5天取血。用ELISA法检测血清中白细胞介素-2(IL-2)、γ-干扰素(INF-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果移植组IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α表达明显升高,IL-4、IL-10表达显著降低,与对照组相比,差异非常显著(P<0.01)。大黄素组IL-2、IL-12、INF-γ、TNF-α表达显著降低,而IL-4、IL-10表达显著升高,与移植组相比,差异非常显著(P<0.01)。结论大黄素抑制肝移植排斥反应主要与其抑制IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α等Th1型细胞因子的表达,促进Th2型细胞因子IL-4、IL-10的表达,使免疫反应由Th1型向Th2型偏移有关。