恶性疟原虫HRPⅡ基因的克隆与表达

采用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）富含组氨酸蛋白Ⅱ基因,经基因序列测定后克隆于ｐＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌ＴＧ１。在不同菌体浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＨＲＰⅡ融合蛋白的表达。采用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析对表达产物进行鉴定。结果显示ＨＲＰⅡ基因与ｐＷＲ４５０－１重组后在大肠杆菌ＴＧ１中表达一６８ＫＤａ的融合蛋白,当工程菌ＯＤ５９０为１．０～１．２时,加入终浓度１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导,表达量较高。Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明ＨＲＰⅡ基因表达产物能被抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体所识别     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白（HRP—Ⅱ）的表达和分离纯化

为获得大量具天然抗原活性的恶性疟原虫HRP-Ⅱ抗原,用摇瓶发酵工程菌,诱导β-半乳糖苷酶-HRP-Ⅱ融合蛋白表达;裂菌后,洗涤沉淀2-3次,用6M脲溶解;取上清经Sephacryl-200柱层析分离纯化目的蛋白,然后复性。结果重组蛋白以包涵体的形式高效表达;Sephacryl-200柱层析后,目的蛋白纯度达86%,91.48%被复性,被Dipstick即ParsSight-F识别,表明该重组抗原纯度高,复性效果好,可用于恶性疟原虫HRP-Ⅱ抗体的制备等研究。     

恶性疟原虫丝氨酸重复抗原部分基因的克隆及其表达

采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫云南株(PFD-3/YN)丝氨酸重复抗原基因片段,经基因序列测定后克隆于pWR450-1融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌TG1。在不同菌体浓度及不同剂量IPTG诱导下检测SERA融合蛋白的表达。采用dot-ELISA及Western-blot分析对表达产物进行鉴定,结果显示SERA基因与pWR450-1重组后在大肠杆菌TG1中表达一72kDa的融合蛋白,当工程菌OD590值为0.8～1.2时,加入终浓度1mmol/LIPTG进行诱导,表达量较高。dot-ELISA和Westernblot分析表明SERA基因表达产物能被抗SERA单克隆抗体所识别。     

抗恶性疟原虫HRP—Ⅱ单链抗体的筛选与特性分析

目的：筛选抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白2（HRP－Ⅱ）单链抗体（SeFv)并对其进行鉴定。方法：从抗恶性疟原虫HRP－Ⅱ ScFv库中，挑取单菌落鉴定重组噬粒，采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP－Ⅱ结合的阳性噬粒，采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP－Ⅱ结合的阳性克隆，并选其中2株强阳性克隆进行序列分析。结果：筛选到8株具有HRP－Ⅱ结合活性的阳性克隆，所测2株克隆的基因序列一致，其重链及轻链分别属于鼠抗体基因家族中第I及kVI亚群。结论：从抗体库中成功地筛选出阳性克隆，为基因工程抗体在恶性疟诊断试剂中的应用奠定了基础。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1羧基端编码基因真核表达重组克隆的构建

目的构建以恶性疟原虫红内期重要的疫苗候选抗原——裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）羧基端编码分子量４２０００蛋白的基因片段为外源基因的可用作候选核酸疫苗的真核表达载体。方法目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟，将恶性疟原虫ＦＵＰ株裂殖子表面蛋白１羧基端编码４２０００蛋白的基因片段用常规分子克隆方法，分别克隆入非分泌性真核表达载体ＶＲ１０１２和改建后的分泌型载体ＶＲ１０１２／ＴＰＡ中，通过ＰＣＲ和酶切鉴定出重组克隆。结果成功地构建了真核表达载体ＶＲ１０１２／ＭＳＰ１－４２和ＶＲ１０１２／ＴＰＡ／ＭＳＰ１－４２。结论目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟红外期，该研究对研制有效的恶性疟原虫红内期核酸疫苗是一个有益的尝试。其免疫保护作用待进一步研究。     

恶性疟原虫丝氨酸重复抗原部分基因的克隆及其鉴定

根据恶心疟原虫丝氨酸重复抗原基因的保守序列。设计并合成了一对寡核苷酸引物，用PCR方法扩增恶性疟原虫云南株(PFD-3／YN）与海南株(FCC-1／HN)丝氨酸重复抗原部分基因片段．经基因序列测定后，将该片段用SmaI SaⅡ双酶消化，克隆于表达载体pR1T2T，并转化大肠杆菌N4830-1，用PCR及酶切法鉴定pR1T2T-SERA重组质业，为丝氨酸重复抗原的表达奠定基础。     

恶性疟原虫顶端膜抗原-1(P.f AMA-1)基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

本文采用PCR方法自 P.f 基因组中扩增了编码AMA-1完整胞外域及其相应结构域的基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-16b和pET-30a(+),经测序确证后将重组子转入BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS PAGE鉴定,对可溶性和包涵体形式的重组蛋白分别采用天然状态和变性状态下的Ni离子亲和层析进行纯化,变性蛋白再在GSH/GSSG氧化还原条件下经透析重新折叠复性.所得纯化产物为进行有关AMA-1功能和免疫保护特性的研究提供了条件.     

恶性疟原虫已糖转运体编码基因的体外扩增及克隆

目的：体外扩增恶性疟原虫海南分离株的已糖转运体基因(PfHT1)，并将该基因克隆至pEGFF真核表达载体内使其高效表达，为研究DNA疫苗创造条件。方法：特定PCR引物的设计；恶性疟原虫FCC1／HN株的体外培养；提取基因组DNA；PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析；酶切、连接及PCR分析鉴定。结果：从恶性疟原虫簿南分离株基因组DNA中扩增出特异性的编码FfhTl的基因序列．片段太小为1516bp，克隆鉴定结果表明插人片段大小正确。结论：体外成功扩增出恶性疟原虫PfHTl编码序列，与预期长度相符，并成功构建pEGFF-Htl真核表达载体。为研究其结构、功能和免疫原性奠定基础，     

恶性疟原虫六个保护性抗原表位基因的化学合成及克隆

本文设计并化学合成一条含有恶性疟原虫裂殖子表面抗原（ＭＳＡ１、ＭＳＡ２）、环子孢子蛋白（ＣＳＰ）、环状体感染红细胞表面抗原（ＲＥＳＡ）等不同生活史期的４种抗原，共６个表位的复合基因（ＰｆＣＭＲ）。该基因含２个粘性未端，共分８个片段，采用“缺口填补法”接成双链ＤＮＡ，再与噬菌体Ｍ１３ｍｐ１８分别经ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ双酶切后回收、纯化、重组，并转化ＥｃｏｌｉＪｍ１０９，经ＰＣＲ和酶切鉴定，ＤＮＡ序列分析测定，证实阳性克隆子Ｍ１３ｍｐ１８－Ａ４与预设计基因顺序完全一致。     

含恶性疟原虫Pf70基因片段表达载体DNA的免疫学特性

目的 研究恶性疟原虫Pf70 DNA片段作为DNA疫苗候选抗原基因的可能性。方法 应用PCR方法从含有恶性疟原虫Pf70基因DNA片段的质粒pGEX-Pf70中扩增出包含Pf70 DNA片段的长度为957bP的PCR产物。将其插人带有乙肝表面抗原基因的真核表达载体pCMV-S中，构建出重组质粒pCMV-S-pf70。用提纯的重组质粒pCMV-S-Pf70作为DNA免疫制剂，以质粒pCMV-S DNA和经过谷胱甘肽亲和层析法纯化的融合蛋白GST-Pf70作为对照，免疫昆明种小白鼠。每隔14d加强免疫1次，加强免疫2次后第7天采小鼠全血，用流式细胞仪检测CD8 T淋巴细胞和CD4 T淋巴细胞的水平，以检测体液免疫和细胞免疫状况。结果 接种了重组质粒pCMV-S-Pf70小鼠CD8 T淋巴细胞的绝对量增加，其百分比含量增加了39％；CD4 T淋巴细胞的相对含量保持恒定，绝对量稍有增加。用ELISA法分别检测经重组质粒pCMV-S-Pf70免疫的小鼠和经融合蛋白GST-Pf70免疫的小鼠血清中抗Pt70蛋白质的抗体滴度，发现前者抗体滴度约为1：800，远远低于后者的滴度(1：5000)。研究结果证明，重组质粒pCMV-S-Pf70 DNA可以诱导小鼠产生很强的细胞免疫和相对于蛋白质免疫而言较弱的体液免疫；Pt70蛋白质可以诱导小鼠产生很强的体液免疫。结论 恶性疟原虫红内期Pf70 DNA片段是有前景的红内期DNA疫苗候选抗原基因片段。     

恶性疟原虫海南分离株FCC1/HN有性期特异抗原Pfs48/45基因的克隆与表达

采用基因工程技术,将编码恶性疟原虫有性期特异抗原Ｐｆｓ８／４５的基因克隆到真核表达质粒ｐｃＤ－ＮＡ３,并进行ＤＮＡ序列测定,再通过磷酸钙—ＤＮＡ共沉淀转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｐＦＳ４８／４５导入ＨｅＬａ细胞,建立稳定分泌Ｐｆｓ４８／４５蛋白的阳性克隆株。结果显示,我国海南ＦＣＣ１／ＨＮ株Ｐｆｓ４８／４５抗原基因序列与ＮＦ５４株者高度同源,提示该基因在不同虫株间高度保守,是研制疟疾疫苗的理想靶抗原;在ＨｅＬａ细胞中表达的Ｐｆｓ４８／４５蛋白分子量约为４６／４３．５ｋＤａ双联体蛋白,其表达量占细胞培养上清蛋白总量的１８．２７％。经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析显示,表在蛋白能被配子体免疫鼠血清特异性识别,提示表达的重组蛋白Ｐｆｓ４８／４５具有免疫活性。真核表达系统ｐｃＤＮＡ３／Ｐｆｓ４８／４５／ＨｅＬａ的建立为进一步研究重组Ｐｆｓ４８／４５抗原的免疫原性和保护性奠定基础。     

恶性疟原虫FCC-1／HN株EBA-175基因特异序列的克隆及其鉴定

根据恶性疟原虫红细胞结合抗原EBA-175基因编码序列设计并合成一对引物，通过聚合群链反应(PCR)技术对恶性疟原虫FCC-1／HN株的EBA-175基因进行扩增，用HindⅢ和BarnHⅠ同时消化扩增产物，定向克隆PCDN3载体，转化至感受态大肠杆菌TG1，经抗性筛选和质粒大小快速凝胶电泳鉴定初步获得重组克隆，再经PCR鉴定和HindⅢ／BarnHⅠ酶切鉴定，证实所得的重组克隆含有编码恶性疟原虫FCC-1／HN株EBA-175基因部分序列。     

恶性疟原虫疫苗研究VIPfCMR基因与人白细胞介素-2基因的连接与克隆

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ｐＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点。重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出正向插入的重组载体ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。     

恶性疟原虫海南株var2csa基因的克隆、表达及免疫识别研究

目的克隆、表达恶性疟原虫海南株HN（2）var2csa基因DBL4、DBL5、DBL6区,通过ELISA方法比较其与硫酸软骨素A（CSA）的亲和能力差异,以及人体对恶性疟原虫海南株HN（1）、（2）VAR2CSA不同DBL区的免疫应答差异。方法根据DBL区序列设计3对引物,PCR扩增目的片段,并与pMD18-T克隆载体连接。经PCR、酶切、测序鉴定正确后克隆至表达载体pET-22b,通过转化、诱导、纯化表达重组蛋白质,SDS-PAGE和Western blot检测。通过ELISA方法进行重组蛋白质与CSA的粘附实验以及与患者血清的免疫识别实验。结果酶切及DNA测序结果均表明表达载体构建成功,表达并纯化3个DBL区重组蛋白质,分子量与预计大小相同,Western blott检测目的蛋白质具有免疫反应性,ELISA显示不同蛋白浓度条件下DBL5区均明显比其它两个DBL区有更高的OD405值,并且DBL5区被妊娠相关疟疾病人血清识别水平显著高。结论 var2csa基因3个DBL区重组蛋白质表达成功,DBL5区与CSA的粘附能力较强,人体对DBL5区的免疫应答反应可能在抗病免疫过程中起到关键作用。     

恶性疟原虫红内期PF332抗原基因未知片段的体外扩增与克隆

根据恶性疟原虫FCCI／NH株PF332基因片段5’端巳知序列，设计台成了一条特异引物(SP)；报据PF332基因的结构特点，又设计合成了一条非特异引物(NSP)。应用低严谨PCR技术(LSPCR)，从恶性疟原虫FCC1／FN株基因组DNA中扩增出一系列PF332基因未知片段。利用T-A克隆法将一560bp大小的片段克隆入测序用PMD-18T载体。限制性内切酶酶切及PCR扩增鉴定表明重组正确。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面抗原2(MSA-2)基因在卡介苗BCG中的表达

目的 :裂殖子表面抗原 2基因 (Merozoitesurfaceantigen 2 ,MSA2 )是恶性疟原虫的一种保护性抗原 ,为研究其重组BCG疫苗的保护作用 ,首先探讨携带有恶性疟原虫FCC 1 HN株MSA2基因的重组分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG MSA2在卡介苗 (BacillusCalmetteGuerin ,BCG)中的表达情况。方法 :采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG MSA2导入BCG中 ,通过卡那霉素抗性筛选并经PCR鉴定的重组BCG培养于Middlebrook 7H9Broth (M7H9)培养基 ,并添加 10 %M7H9EnrichmentADC和 0 0 5 %Tween80 ,4周后于 4 5℃进行诱导表达 ,表达产物进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS PAGE)及免疫印迹 (Western blot)分析。结果 :SDS PAGE及Western blot分析结果均显示在约 31kDa的位置上可见明显的蛋白条带 ,并与MSA2基因编码序列推断的分子量相符。结论 :恶性疟原虫裂殖子表面抗原 2可在BCG中表达 ,这些结果将为恶性疟原虫多价BCG疫苗的研制提供科学依据     

人源miR-185通过靶向恶性疟原虫var基因减弱感染红细胞粘附作用的研究

为了探讨人源miR-185对恶性疟原虫var(pfl1955w)基因表达调控并观察感染红细胞粘附所受到的影响,体外培养293T细胞和恶性疟原虫3D7,构建双荧光素酶报告质粒和表达质粒,再分别利用Lipofectamine 2000转染293T细胞和Cytomix电转恶性疟原虫3D7,流式细胞仪检测转染效率,用双荧光素酶报告验证人源miR-185对var(pfl1955w)的dbl区域直接调控作用,Q-PCR检测var(pfl1955w)mRNA的表达,细胞粘附实验检测感染红细胞的粘附.结果显示,293T细胞和3D7的转染效率在50％以上,过表达人源miR-185可显著抑制含var(pfl1955w)dbl的荧光素酶基因的表达;在293T细胞和3D7中,人源miR-185能够减少var(pfl1955w)mRNA的含量,并使感染红细胞粘附作用下降了39％.结果表明,人源miR-185对疟原虫var(pfl1955w)基因表达有下调作用,进而影响恶性疟原虫的粘附.     

恶性疟原虫红内期保护性抗原的分析

本文用7株单克隆抗体(McAb),疟疾流行区感染病人免疫血清和BALB/c小鼠免疫血清对用~(35)S—蛋氨酸和~(125)Ⅰ—表面标记的恶性疟原虫无性红内期保护性抗原进行了分析。实验结果表明,抑制性McAbs和不同来源的多价免疫血清巳鉴定出10余种功能性靶抗原。两种不同来源的多价免疫血清不但能识别由这7株McAbs所识别的靶抗原而且还能识别140和100KDa以及某些较小分子量的多肽。同时还用抗原竞争试验证实了免疫沉淀靶抗原的特异性。     

恶性疟原虫杂合抗原基因的表达及其产物免疫功能的研究

化学合成的人恶性疟原虫杂合多肽抗原 AB 基因,编码子孢子 CSP重复序列 NANP、CSPTh2R和红内期spf35.1、spf83.1、spf55.1、spf83.18、pf155/RESA-5’端重复区共7个不同免疫功能表位,与大肠杆菌质粒pWR450-1重组,构建成pWR450-1/AB表达载体。在乳糖操纵子调控下以β-半乳糖苷酶-恶性疟原虫杂合多肽抗原融合蛋白形式,在大肠杆菌中高效表达。表达产物经SDS-PAGE电泳分离纯化后,加福氏佐剂免疫家兔,诱导产生较高滴度的抗血清。抗血清对人恶性疟原虫体外生长有明显的抑制作用,24h抑制率为65.92％;72h的抑制率为72.63％。对照血清无抑制作用。分离纯化的表达产物能与鼠抗恶性疟原虫和疟疾患者抗血清起免疫反应。这些结果表明合成基因的表达产物具有较好的免疫原性。