PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变，同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以72．35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR—SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到巾0B碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中，PCR—SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱，PCR—SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88．6％（31／35）和100％（23／23）。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析，在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91．4％（32／35）和100％（23／23）。卡方检验，PCR—SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异（P〉0．05）。若以DNA测序为标准，则PCR—SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93．1％（54／58），96．9％（31／32）和100％（23／23）。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。     

用PCR—SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的突变

目的：了解本地区结核分枝杆菌对利福平（RFP）耐药基因的突变情况，探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的试验方法。方法：针对rpoB基因设计一对引物（扩增产物为189bp)，采用聚合链酶反应－单链构象多态性银染（PCR－SSCP）方法，以标准结核分枝杆菌H38Rv为对照，检测临床分离的35株结核分枝杆菌rpoB基因突变情况并以药敏试验结果做对照分析。结果：以药敏试验结果为对照，35株临床分离株中有9株RFP敏感株的SSCP带与结核分枝杆菌标准株（H37Rv)相同，26株RFP耐药株中有24检测到突变图谱，与药敏试验结果对照阳性率为92．3％，特异性为100％，结论：RpoB基因是一种高度保守序列，结核分枝杆菌耐RFP是由于rpoB基因突变所致。本研究针对其高突变区域设计一对引物，运用PCR－SSCP法具有简便，快速、准确的特点，可以对临床标本中结构分枝杆菌进行检测，以满足临床早期诊治的需要。     

用PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的突变

目的了解本地区结核分枝杆菌对利福平(RFP)耐药基因的突变情况,探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的试验方法.方法针对rpoB基因设计一对引物(扩增产物为189bp),采用聚合链酶反应-单链构象多态性银染(PCR-SSCP)方法,以标准结核分枝杆菌H38Rv为对照,检测临床分离的35株结核分枝杆菌rpoB基因突变情况并以药敏试验结果做对照分析.结果以药敏试验结果为对照,35株临床分离株中有9株RFP敏感株的SSCP带与结核分枝杆菌标准株(H37Rv)相同,26株RFP耐药株中有24检测到突变图谱,与药敏试验结果对照阳性率为92.3%,特异性为100%.结论 RpoB基因是一种高度保守序列,结核分枝杆菌耐RFP是由于rpoB基因突变所致.本研究针对其高突变区域设计一对引物,运用PCR-SSCP法具有简便、快速、准确的特点,可以对临床标本中结核分枝杆菌进行检测,以满足临床早期诊治的需要.     

检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

结核分枝杆菌利福平耐药基因的检测

以药物敏感试验为标准，应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析方法对６８例利福平耐药菌株和２０例利福平敏感菌株进行测定，结果８８例结核分枝杆菌均扩增出目标ＤＮＡ条带，１０例非结核分枝杆菌和８例非分枝杆菌未出现目标ＤＮＡ条带，所用引物扩增ｒｐｏＢ基因２１５ｂｐ片段为结核分枝杆菌复合群异性的。     

结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：了解结核分枝杆菌乙胺丁醇(EMB)耐药的临床分离株embB基因突变的情况，并探索快速检测结核分枝杆菌EMB耐药性的实验方法。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术和PCR扩增产物测序方法。分析结核分枝杆菌EMB耐药和敏感各30株的embB基因。结果：以结核分枝杆菌H37RV标准株为对照。发现30株EMB耐药株中有11株(36．7％)embB基因扩增产物SSCP泳动异常，部分耐药菌株测序分析证实为306位密码子突变；而30株敏感株的embB基因扩增产物SSCP泳动均无异常。结论：embB基因突变是结核分枝杆菌EMB耐药的重要机制之一；PCR-SSCP技术可能成为一种检测结核分枝杆菌EMB耐药性的准确和快速的实验方法。     

建立结核分枝杆菌耐药基因的检测方法

目的了解耐药结核分枝杆菌基因突变情况,建立结核分枝杆菌耐药基因的检测方法.方法108例临床痰标本分离株均做PCR-SSCP和传统梯度药敏试验.结果耐SM(rpsl)、RFP(rpoB)、INH(katG)基因突变率分别为78.5%,78.2%,70.5%.其中高耐SM、REP、INH分离株突变率分别为86.9%,89.3%,84.3%.低耐分离株突变率分别为28.5%,16.6%,7.1%.结论结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药水平联系是密切的,且结核耐药分枝杆菌基因突变绝大多数易发生在高耐药株中,也有少部分在低耐药株发生突变.     

PCR-SSCP快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株的研究

目的：应用分子生物学方法快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株。方法：通过设计两对引物分别扩增16S rDNA两条片段，根据SSCP电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性鉴别结核、非结核分枝杆菌。结果：98株临床分离株中，经细胞学鉴定93株为结核分枝杆菌复合群，5株非结核分枝杆菌。用引物I、Ⅱ对结核分枝杆菌复合群进行PCR－SSCP析，有81株与标准株有相似图谱。用引物Ⅲ、Ⅳ对非结核分枝杆菌进行PCR－SSCP分析，均显示出与结核分枝杆菌标准株不同的电泳图谱。结论：PCR－SSCP可快速鉴别结核、非结核分枝杆菌。     

结核分枝杆菌耐多药的基因研究

目的 探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系。方法 用聚合酶链反应和聚合酶链反应单链构象多态性分析对128株结分村以杆菌临床分离析耐利福平（rpoB)、链霉素（rpsL)和异烟肼（KatG）基因检测。结果 38株 敏感株中,各有1株（206%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;90株耐多药析中,分别有81株（90.0%)、71株（78.9%)和63株（70.0%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;有77株（85.6%)同时测出2种以上耐药基因突变;10株耐其他药物株中,仅有1株测出KatG基因突变。结论 85.6%的耐多药结核分枝杆菌存在2种以上耐药基因突变,且耐药基因突变率与耐药浓度有关。     

实时荧光PCR分子信标检测耐利福平结核分枝杆菌印rpoB基因

目的 应用实时荧光PCR分子信标技术,建立快速检测临床标本中结核分枝杆菌利福平rpoB相关耐药突变点方法,探讨其缩短耐药实验报告时间的临床应用价值.方法 以分枝杆菌药物敏感性实验绝对浓度法为标准,12株非结核分枝杆菌、4株非分枝杆菌作对照,对174例结核患者临床分离株应用实时荧光PCR分子信标方法,检测利福平rpoB核心区域的耐药突变点并将结果与直接测序进行比较.结果 (1)实时荧光PCR分子信标方法:82例结核分枝杆菌利福平敏感菌株中,3例发生rpoB基因突变,特异度为96.3%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,82例检出耐药突变,敏感度为89.1%;准确性为92.5%.(2)DNA直接测序分析:82例结核分枝杆菌利福平敏感株中,1例发生rpoB基因突变,特异度为98.8%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,83例发生:rpoB基因突变,敏感度为90.2%;准确性为94.2%.检测174株结核分枝杆菌临床分离菌株,与实时荧光PCR分子信标方法检测一致性为98.3%(171/174).结论 实时荧光PCR分子信标方法检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变点可作为结核患者快速耐药检测的初筛方法之一.     

结核分枝杆菌稳定L型染色体DNA的PCR-SSCP分析

目的探讨结核分枝杆菌稳定L型变异的核酸分子基础。方法对结核分枝杆菌稳定L型纯培养物的染色体DNA特异性聚合酶链反应(PCR)扩增产物进行产物单链构象多态性分析。结果产物单链构象多态性分析显示稳定L型的染色体DNA保留了与其亲代细菌型一致的主要带型,但也显示出少数不同于其亲代细菌型的DNA条带。结论结核分枝杆菌稳定L型可保留与其亲代细菌型一致的特异性染色体基因,但也发生了染色体基因的点突变。     

聚合酶链反应-单链构象多态性检测rpoB基因突变对结核分支杆菌耐利福平诊断价值的Meta分析

目的系统评价聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)对结核分支杆菌rpoB基因突变耐利福平的诊断价值。方法计算机检索PubMed、Web of Science、h e Cochrane Library(2014年第2期)、CBM、VIP和WanFang Data,查找PCR-SSCP与金标准(常规体外药敏试验结果)比较检测结核分支杆菌rpoB基因突变的诊断性研究,检索时限均为从建库至2014年1月。由2位评价员按照纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料和方法学质量评价后,采用Meta-DiSc 1.4和Stata 12.0软件进行Meta分析。结果最终纳入10个研究,包括1 229例标本。Meta分析结果显示:①SEN合并=0.92[95%CI(0.90,0.94),P=0.019 3]、SPE合并=0.97[95%CI(0.95,0.98),P<0.000 1]、+LR合并=23.68[95%CI(8.71,64.37),P<0.000 1]、–LR合并=0.10[95%CI(0.06,0.15),P=0.023 1]和DOR合并=257.16[95%CI(96.82,683.02),P=0.020 0],SROC曲线下面积(AUC)为0.971 5,Q*指数0.922 3。②分别剔除样本量<100例、中文研究以及QUADAS评分>10分的研究行敏感性分析,结果显示剔除文献后各诊断结果稳定,提示结论较为可靠。结论 PCR-SSCP检测rpoB基因突变诊断结核分支杆菌耐利福平具有较高的临床应用价值。     

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平（RFP）和异烟肼（INH）耐药性。方法用PCR-SSCP技术分析，对35例耐INH（或含耐异烟肼）、63例耐RFP（或含耐RFP）的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性，其中46例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异。rpoB突变率为65．2％。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性。15例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异，突变率为42．8％。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

武汉地区耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变分析

摘要：目的：探讨武汉地区结核分枝杆菌（MTB）利福平耐药株rpoB基因的突变特征。 方法：对76例MTB临床分离株包括rpoB核心区域81 bp碱基在内的428 bp碱基进行PCR测定,并进行DNA序列分析。 结果：76例临床分离MTB中利福平耐药株56例,敏感株20例。耐药株中92.9%（52/56）存在突变,共涉及10个密码子的18种突变类型。 531、526为常见突变位点,其突变率分别为57.7%(30/52)、19.2%(10/52);联合突变率为13.5%（7/52）;同时发现了509位（AGC→AGA）新的突变类型和国内少见的517位CAG缺失类型。 结论：rpoB基因突变在武汉地区利福平耐药MTB中广泛存在,并存在新的突变位点。     

核酸薄膜导流杂交技术快速检测结核分支杆菌rpoB基因片段及突变

摘要：目的：探讨用低密度核苷酸薄膜导流杂交技术快速检测结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）的可行性。 方法：根据MTB rpoB基因设计12个野生型及常见突变型寡核苷酸特异探针,制作低密度核苷酸薄膜微阵列,通过导流杂交技术与薄膜杂交鉴定,并与DNA测序法对比。 结果：81株MTB的耐药性试验及DNA测序结果显示,27株耐利福平MTB株中20株（74.1%）存在突变。以DNA测序结果为标准,31株标本（20株耐利福平MTB突变株,11株利福平敏感MTB野生株）低密度核苷酸薄膜导流杂交的敏感性为85%（17/20）,特异性为100%（11/11）,阳性预测值为100%(17/17),阴性预测值为78.6%(11/14);与DNA测序法的符合率为90.3%(28/31)。 结论：用低密度核苷酸薄膜导流杂交能快速、简便检测MTB,并可提示其是否对利福平耐药,指导临床合理用药。     

结核分支杆菌喹诺酮耐药基因的研究

[目的]了解结核分支杆菌耐喹诺酮耐药基因突变情况,建立快速分子药敏实验方法。[方法]通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR～DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。[结果]以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗做对照,30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常,测序分析与对照株相同。45株喹诺酮耐药株中,34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常;测序证实10株为90位密码子的突变,24株为94位密码子突变,符合率100％。[结论]gyrA基因突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制,PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌耐喹诺酮株的简便、快速的方法．并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

核酸薄膜技术快速检测结核分枝杆菌katG突变的研究

目的研制一种新的核苷酸薄膜,通过导流杂交技术检测结核分枝杆菌katG基因突变类型,以快速判断结核分枝杆菌对异烟肼的耐受性,寻找一种快速简便检测耐异烟肼结核病的方法。方法根据结核分枝杆菌katG基因序列设计1个野生型及2个常见突变型寡核苷酸特异探针,探针5’末端连接亚甲基(-CH2)。同时设计1个人类基因组探针以及1个生物素探针。制作低密度核苷酸薄膜微阵距列,通过导流杂交技术进行杂交,将杂交结果与DNA测序法对照。结果核酸测序显示,突变位点分别出现在包括315位点在内的7个位点,315位点突变占75.0%(18/24),最常见突变形式为AGC315ACC所致Ser315Thr氨基酸改变。杂交结果与测序结果符合率为93.9%(31/33),与DNA测序相比,其阳性预测值、阴性预测值、敏感度、特异度分别为90.0%、100%、100%、86.7%。结论核酸薄膜导流杂交技术能快速、简便、高效地检测临床标本中有无结核分枝杆菌,并可提示结核分枝杆菌有无异烟肼耐药性,指导临床用药。     

结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药表型及rpoB基因型分析

目的分析结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株利福平(rifampin,RFP)耐药表型及rpoB基因突变关系,阐明MTB RFP耐药株rpoB基因突变特征。方法采用改良罗氏培养基比例法检测387株MTB临床分离株对RFP敏感性,并进行rpoB基因测序。对经测序rpoB基因511位和533位密码子突变株进行RFP最小抑菌浓度(MIC)检测。结果比例法检测387株MTB临床分离株中1,98株RFP耐药株,189株RFP敏感株。rpoB基因测序结果表明1,98株比例法RFP耐药株中1,92株(96.97%)发生rpoB基因突变,涉及16种单位点和24种双位点密码子联合突变类型,单位点和双位点密码子联合突变率分别为84.34%(167/198)和12.63%(25/198),其中发现1种单位点和21种双位点密码子联合突变新类型。最常见的突变位点为531位(51.01%)、526位(21.21%)和516位(7.07%)密码子。6株(3.03%)耐药株在rpoB测序范围内未见突变。189株比例法RFP敏感株中,174株(92.06%)在rpoB基因测序范围内未见突变1,5株(7.94%)发生突变,其中7株CTG511CCG(Leu→Pro)突变和6株CTG533CCG(Leu→Pro)突变。511位和533位密码子突变株MIC检测结果提示其突变与低度耐RFP相关。结论所得数据及一些新的发现为进一步研究MTB RFP耐药机制、研制快速新型分子药敏试验方法提供理论和实际应用依据。