脐血单个核细胞分离方法的比较及形态学改变

目的:探索一种简便、高效的脐血单个核细胞分离方法。方法:以Ficoll密度梯度离心法与羟乙基淀粉(HES)分离法进行对比.比较两种分离方法分离脐血所得的单个核细胞(MNC)细胞数,并观察两组单个核细胞不同培养时间下形态学变化。结果:两种分离方法在分离脐血MNC方面存在着显著性差异,其中以HES法效果较好,但HES法所得细胞培养后生长状态欠佳。结论:HES法是一种高效的脐血单个核细胞分离方法,但该法所得细胞的生长状态欠佳,需进一步实验证实。     

无菌塑料袋分离单个核细胞

目的:研究适合用于人体的利用无菌塑料袋分离单个核细胞(MNC)的方法。方法:随机抽查20份样本,单份采集量65～400ml,分为2组,15～58岁为第1组(n=15),59～76岁为第2组(n=5)。将Ficoll淋巴细胞分离液加入一次性无菌塑料袋内,将采集的血液或骨髓样本缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上,离心,收集MNC层,然后洗去Ficoll淋巴细胞分离液,根据临床需要调整MNC的液体悬浮量。结果:第1组分离后MNC的细胞数为(4.90±2.69)×108,回收率为(71.96±12.43)%,CD34+细胞占MNC的比率为(2.31±0.93)%。第2组分离后MNC的细胞数为(1.11±0.74)×108,回收率为(69.98±2.23)%,CD34+细胞占MNC的平均比率为(0.98±0.04)%。结论:利用无菌塑料袋分离MNC,分离效果和MNC、CD34+回收率均能满足临床需要。     

人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用

目的探讨人胎盘源问充质干细胞（PMSCs）对脐血单个核细胞（MNCs）体外生长的支持作用。方法将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁培养获得人PMSCs，用流式细胞仪检测细胞表面标志。以密度梯度离心法分离脐血MNCs和传代后的PMSCs进行共培养，通过细胞计数和流式细胞仪分别检测细胞的生长情况。结果从人胎盘组织中成功分离和培养PMSCs，经流式细胞仪检测其表型为CD29^＋,CD44^＋,CD105^＋、CD106^＋、CD166^＋、CD34^-,CD45^-、HLA—DR^-。人PMSCs＋脐血MNCs共培养组的细胞总数和CD45^＋细胞数在各培养时间点均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。在培养第7天，CD45^＋、CD14^＋及CD19^＋细胞数共培养组也明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论人PMSCs可以作为滋养层细胞有效支持脐血MNCs的体外生长。     

密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞方法的优化

目的:对密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞的方法进行优化,以提高该方法分离骨髓单个核细胞的收率。方法:骨髓血40份,100 ml/份,分为常规组和优化组,每组20份。常规组骨髓与NS 1∶1混合稀释后,直接通过Ficoll分离液分离单个核细胞;优化组通过先将骨髓血洗涤一次,加入等量NS充分吹打混匀,200目筛网过滤,保持细胞悬液和Ficoll分离液1∶1的体积比进行分离操作。对每份分离得到的骨髓单个核细胞通过白细胞稀释液稀释后计数,计算单个核细胞的回收率。结果:常规组,分离后的白膜层有12份界面不清晰,同时均混有少量的红细胞。优化组,分离后的白膜层有3份界面不清晰,仅有极少的红细胞混入。两种方法收集的骨髓单个核细胞数比较,优化组多于常规组(P﹤0.01)。结论:通过对密度梯度离心法的步骤进行优化,可提高骨髓单个核细胞的分离效果。     

外周血单个核细胞DNA不同抽提方法比较

用经典酚醇法、盐析法、碘化钾法、煮沸法提取外周血单个核细胞DNA ,比较这四种方法所获得的DNA模板对PCR检测肿瘤坏死因子 (TNF)的影响 ,结果显示除了煮沸法 ,其余三种方法提取的DNA均有较高的纯度和浓度 ,其中以碘化钾法操作最为简便可靠 ,适合临床推广应用。     

常用实验动物血液中单个核细胞分离条件的观察

为了寻找分离实验动物[家兔、大鼠和杂系与纯系(SW_1、C57BL)小鼠]末梢血单个核细胞的最适比重,观察了在6种不同比重(1.080～1.105)分层液中单个核细胞的回收率、分离细胞中所混红细胞的百分率以及分层级别。结果表明,单个核细胞回收率随分层液比重的升高而增加,其间呈线性关系。在家兔、豚鼠和大鼠,末梢血单个核细胞的回收率和分层液的比重间呈明显相关,其直线回归方程分别为Y=12.5X-13.17;Y=4.29X-44.5和Y=12.86X-13.47。其回归系数均极其显著。因为三个品系的小鼠只试验了四个比重,相关系数不显著,未作回归分析,在分层液比重和回收细胞中混红细胞百分率之间也呈线性关系。分层液比重低时分层级别以Ⅰ级为主,随着比重的升高,Ⅱ级和Ⅲ级逐渐增加。在家兔和豚鼠直到比重1.090,甚至1.095,分离仍满意。在大鼠和小鼠,在1.085时分离满意,随后则比重越高,分层级别越差。     

实验树鼩外周血单个核细胞分离的方法探讨

目的:建立从实验树鼩外周血中分离单个核细胞的可靠方法.方法:使用不同密度的Percoll?分离溶液对树鼩的静脉血进行密度梯度离心,并通过Wright-Giemsa染色和细胞计数分析树鼩的单核细胞的最佳分离密度.结果:采用60％和67％Percoll?分离溶液的不连续密度梯度离心方法可以分离出树鼩粒细胞.60％～63％的...     

体外诱导人脐血单个核细胞向肝细胞样细胞的分化

目的:探讨人脐血单个核细胞（MNC）能否在体外诱导分化为肝细胞样细胞。方法:采集正常产妇脐血,淋巴细胞分离液分离MNC,流式细胞仪检测其表面标志。分别用肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF4)、HGF+FGF4、无生长因子4种处理因素 进行诱导培养,于诱导前及诱导后的第7、14、21、28天采用RT-PCR检测AFP、白蛋白及C-met、FGFR₂ mRNA的表达,免疫细胞化学法检测肝细胞抗原和CK18的表达,PAS 法进行糖原染色。结果:诱导前检测到C-met、FGFR₂ mRNA的表达,诱导后第7和21天分别检测出AFP和白蛋白mRNA的表达,第28天检测出CK18、肝细胞抗原的表达及糖原染色阳性细胞,无生长因子诱导组未检测到肝系细胞标志。HGF+FGF4诱导组肝系细胞标志阳性率均高 于单独生长因子诱导组(P<0.05)。结论：HGF、FGF4均能在体外诱导人脐血MNC分化为肝细胞样细胞,且二者在一定程度上有联合作用。     

人足月胎盘滋养细胞分离培养方法的改良

目的:建立一种经济、高效的人足月胎盘滋养细胞分离培养方法。方法:收取正常足月剖宫产患者胎盘组织,DNA酶联合胰酶反复消化、网筛过滤、不连续密度梯度分离液分离纯化细胞;免疫细胞化学法鉴定细胞来源;对所培养的滋养细胞进行形态学观察;CCK-8增殖实验分析细胞体外增殖活力。结果:利用此法可成功体外培养胎盘滋养细胞,一次操作可获得大于107个细胞。体外培养时,滋养细胞增殖能力低下,3h开始贴壁,24h后逐渐开始融合成合体滋养细胞。结论:本研究改进了既往足月胎盘滋养细胞原代培养的方法,简化操作步骤,缩短操作时间,并且一次性可获得大量且纯度较好的胎盘滋养细胞。     

从脐血单个核细胞诱导树突状细胞

探讨了从脐血单个核细胞定向诱导 DC的方法以进一步研究树突状细胞的功能与特性。从脐血中获取单个核细胞 ,在培养液中加入 GM- CSF、TNF- α、IL- 3、IL- 4,培养 1 4d后流式细胞仪分析细胞表面标志 CD1 a;培养末期加入 LPS,流式细胞仪分析细胞表面标志 CD83及 HLA- DR。发现用 GM- CSF+TNF-α+IL - 4可获得 ( 3 6 .79± 3 .1 5 ) % CD1 a+ 细胞 ,LPS可使 CD83及 HLA- DR的比例从 ( 0 .5 7± 0 .5 6 ) %及 ( 40 .2 7± 6 .3 3 ) %分别升至 ( 3 2 .79± 1 2 .90 ) %及 ( 95 .5 2± 3 .45 ) %。实验证明脐血单个核细胞作为另一种主要来源 ,经特定细胞因子诱导可生成大量 DC,并能通过 LPS刺激 DC成熟     

体外分离子宫内膜干细胞3种方法的比较

目的:探索简便、实用、高效的体外分离、培养人子宫内膜干细胞的方法。方法:采用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和混合法3种体外细胞分离方法分离子宫内膜干细胞,并采用相同的方法进行培养。倒置显微镜下观察细胞消化、贴壁时间,纯化情况和细胞生长形态。绘制第2代细胞生长曲线。采用免疫细胞化学法检测第2代细胞CD90和CD146蛋白的表达,采用RT-PCR法检测CD90和CD146 mRNA的表达。结果:胶原酶Ⅰ法分离子宫内膜干细胞具有操作简便,获得细胞纯度高,细胞易于贴壁,生长良好的优势。胶原酶Ⅰ法分离的细胞经培养后获得的细胞符合正常人子宫内膜干细胞形态学特征和生物学特征;第2代细胞生长曲线均为近似的"S"形;第2代细胞CD90和CD146蛋白的表达为阳性,CD90和CD146 mRNA有表达。结论:胶原酶Ⅰ法较为简便、实用并具有较高的成功率,是一种培养子宫内膜干细胞的可行性方法。     

异种单个核细胞在体内分布及定植研究

目的：研究异种单个核细胞在机体内的分布及定植特点，为细胞疫苗的研究和改进提供理论基础。方法：经兔外周动、静脉输入＾９９ｍＴＣ标记处理和未处理的人单个核细胞，用单光子发射计算机断层仪（Ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｍｐｒｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，ＳＰＥＣＴ）扫描并做图像分析及γ－记数仪测定放射量。结果：异种单个核细胞主要定植在肺、肝、脾及骨髓，而胸腺、淋巴结、肌肉、肠壁等其它     

长期培养外周血单个核细胞的简易分离纯化方法

目的对长期培养的外周血单个核细胞(PBMC)进行纯化,为后续研究提供方便。方法用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法对长期培养的PBMC进行再次分离和纯化。结果用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法再次处理长期培养的PBMC,可以得到纯度较高的PBMC。结论聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法是纯化长期培养的PB-MC的一种简便、快捷、成本低的方法之一。     

两种从骨髓中分离人间充质干细胞方法的比较研究

目的比较Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesen-chymal stem cells,hBMMSCs)与常用的Percoll分离法之间的差异.建立一种简便、实用的hBMMSCs分离方法.方法分别应用上述两种方法分离hBMMSCs,比较用两种方法从骨髓中分离的有核细胞得率及死亡率、贴壁细胞克隆数、细胞形态以及细胞表面标志.结果两种方法获得的有核细胞得率无显著差异(P＞0.05);Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法获得的有核细胞死亡率显著小于Percoll分离法(P＜0.01);Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法获得的hBMMSCs原代培养5 d的贴壁细胞克隆数/37.5 cm2显著多于Percoll分离法(P＜0.05).Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法与Percoll分离法获得的hBMMSCs细胞形态均一,为纺锤形或三角形;Fieoll(1.073g/ml)密度梯度离心法与Percoll分离法获得的原代hBMMSCs CDl05阳性表达率[(94.0±2.0)%vs(95.8±1.5)%]及CD34阴性表达率[(96.0±1.2)%vs(97±1.0)%]无显著差异(P＞0.05).结论与Percoll分离法相比较,Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法分离hBMMSCs具有细胞死亡率较小,细胞得率较多的优点,是一种较好的hBMMSCs分离方法.     

两种分离大鼠心脏微血管内皮细胞方法的比较及改良

目的:比较两种分离成年大鼠心脏微血管内皮细胞的方法并进行改良.方法:分别采用组织块贴壁法和酶消化法分离大鼠心脏微血管内皮细胞,并对其进行表面特异性抗原CD31免疫荧光鉴定.结果:两种方法都获得了心脏微血管内皮细胞,CD31鉴定细胞阳性率在95％以上.两种方法相比,酶消化法具有获得所需的细胞时间相对短,稳定可靠,细胞纯度高等特点.结论:使用酶消化法可获得纯度高、状态良好的心脏微血管内皮细胞.     

不同分离纯化法建立人早孕滋养细胞模型的效果比较

目的：对4种建立滋养细胞的方法进行比较,以期寻求一种简便高效的人早孕滋养细胞的体外培养方法,为相关研究提供基础。方法早孕绒毛通过胰酶联合胶原酶消化分离后,分别采用直接接种、差速贴壁联合差速消化法、人外周血淋巴细胞分离液分离纯化法、完整绒毛消化联合简化的 percoll 密度梯度分离法4种方法纯化培养,倒置显微镜观察细胞形态,应用 HE 染色、免疫组化和免疫细胞化学法检测细胞纯度。结果直接接种、差速贴壁联合差速消化法、人外周血淋巴细胞分离液分离纯化法得到的细胞细胞角蛋白7（CK －7）表达阳性率不足60％;简化的 percoll 密度梯度分离法得到的细胞 CK －7表达阳性率达90％以上。结论完整绒毛消化联合简化的 percoll 密度梯度分离纯化可以得到大量较高纯度的滋养细胞以供后期实验。     

内皮培养条件下人外周血单个核细胞不同时段克隆成分的生物学特征

目的:探讨在内皮培养条件下人外周血单个核细胞不同时段克隆成分的生物学特征.方法:11名健康志愿者,由肘静脉取血50 mL,肝素抗凝,密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs),用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中,接种后每2 h去除1次未黏附细胞,共2次,然后隔日换液1次,第7 d计数早期克隆.每例血样均分为2等份,1份在获得早期克隆后持续培养,直到晚期克隆出现;另1份加入无血清培养基继续培养72 h,ELISA法测定上清液中血管内皮生长因子(VEGF)浓度.流式细胞技术检测细胞表面抗原CD14、CD45、CD146等的表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素.结果:早期克隆中心为圆形细胞,周边是放射状排列的纺锤形细胞,再种植不能形成第2代克隆.细胞表面主要表达CD14和CD45,培养上清液中VEGF浓度明显高于晚期克隆(P＜0.05).晚期克隆呈现典型的内皮细胞特征,再种植可形成第2代克隆.细胞表面CD146表达明显增加(P＜0.01),而CD45、CD14表达明显减少(P＜0.001).结论:人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,早期克隆属于单核细胞系列,可分泌VEGF但不能分化成内皮细胞,晚期克隆细胞具有内皮祖细胞的形态和生物学特征.     

两种分离胎盘间充质干细胞方法的比较

目的：寻找从胎盘组织中分离培养间充质干细胞的最佳方法。方法：分别采用外植块贴壁法和酶消化法从胎盘组织中分离间充质干细胞,并对其形态、免疫表型、生长动力检测和多向分化能力进行检测。结果：流式细胞术和诱导分化实验表明酶液消化法分离得到的贴壁细胞表型符合间充质多能干细胞特征,且在合适诱导条件下能向造骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化,而外植块贴壁法获得的贴壁细胞弱表达CD29和CD105,仅能向脂肪细胞分化。结论：酶消化法可有效的从胎盘组织中分离间充质干细胞,增殖能力强,具备多向分化能力。