鲍曼不动杆菌外膜蛋白研究进展

鲍曼不动杆菌是医院获得性感染主要致病菌之一,其外膜蛋白是指肽聚糖外脂质双层中间镶嵌的一些特殊的蛋白质.CarO、33-to-36-kDa、OprD等外膜蛋白丢失与细菌耐药有关,而OmpA外膜蛋白是重要的致病因素.其研究技术分为提取、分离和鉴定3个方面,超声物理法、双向凝胶电泳、质谱技术及免疫印迹是目前常用技术.     

鲍曼不动杆菌DsbC蛋白的原核表达及纯化

目的克隆鲍曼不动杆菌二硫键形成蛋白C(DsbC)基因,制备重组DsbC蛋白,为研究其活性奠定基础。方法通过NCBI获得DsbC蛋白序列,分析其生物学性质。采用PCR方法扩增无信号肽DsbC基因,并将其连接到表达质粒pET28a,构建重组质粒pET28a-DsbC,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后用IPTG诱导DsbC蛋白的表达,采用镍离子亲和层析法纯化目的蛋白。结果 DsbC具有一个信号肽,由2个相同的DsbC蛋白分子构成二聚体。PCR扩增去掉信号肽的DsbC基因大小为636bp,构建的重组质粒pET28a-DsbC经PCR测序验证正确。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导,表达分子质量单位为26.1×10~3的DsbC蛋白,经镍柱纯化得到单一电泳条带的重组蛋白。结论使用基因工程的方法表达并经镍柱层析得到高纯度的鲍曼不动杆菌DsbC蛋白,为进一步研究其活性奠定了基础。     

鲍曼不动杆菌UspA蛋白的克隆表达及生物信息学分析

目的克隆表达及纯化鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)普遍应急蛋白A(Universal stress protein A,UspA),并进行生物学预测和分析。方法查询鲍曼不动杆菌UspA基因序列,设计特异性PCR引物,以提取的鲍曼不动杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UspA片段。回收目的片段,连接到质粒pET28a,转化大肠埃希菌,37℃培养后,进行PCR扩增并测序。将重组质粒转入表达菌,加入IPTG诱导重组UspA蛋白表达,并经Ni~(2+)亲和层析纯化。采用生物信息学软件分析UspA蛋白的生物学特性。结果获得全长为444bp的鲍曼不动杆菌UspA基因,且成功构建了重组质粒pET28a-UspA,得到纯度较高的相对分子质量17×10~3的重组UspA蛋白。该蛋白为细菌的胞质蛋白,其α-螺旋占51%,延伸链占27%,无规卷曲的含量占31%。由2个同源UspA蛋白分子构成二聚体。结论成功克隆表达了鲍曼不动杆菌UspA蛋白,该蛋白可能含B细胞表位,而具有免疫原性,为其生物学活性及耐药机制研究提供了理论基础。     

鲍曼不动杆菌耐药性与生物被膜及外膜蛋白基因ompA相关性研究

目的 对鲍曼不动杆菌耐药性与生物被膜及外膜蛋白基因ompA的相关性进行研究.方法 收集非重复鲍曼不动杆菌126株,采用琼脂扩散(K-B)法进行体外药敏实验;改良平板法测定生物被膜形成能力;采用聚合酶链反应(PCR)法扩增外膜蛋白基因ompA;采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量法测定生物被膜形成的不同阶段外膜蛋白基因ompA表达水平的变化.结果 126株鲍曼不动杆菌中,多重耐药菌分离率为62.70％ (79/126);PCR检测到多重耐药鲍曼不动杆菌中ompA基因的检出率为87.34％ (69/79);RT-PCR检测到浮游菌、生物被膜3d、生物被膜5d外膜蛋白基因表达的相对灰度值分别为0.557 3±0.305 3、0.820 8±0.095 7、1.097 5±0.208 6,统计学分析显示,外膜蛋白基因ompA在生物被膜生长的不同时期其表达水平的差异有统计学意义.结论 鲍曼不动杆菌耐药情况严峻,多重耐药菌分离率呈升高趋势;多重耐药性可能与生物被膜形成及外膜蛋白基因ompA高表达有关.     

鲍曼不动杆菌UspA蛋白的克隆表达及生物信息学分析北大核心CSCD

目的克隆表达及纯化鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)普遍应急蛋白A(Universal stress protein A.UspA).并进行生物学预测和分析。方法查询鲍曼不动杆菌UspA基因序列,设计特异性PCR引物,以提取的鲍曼不动杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UspA片段。回收目的片段,连接到质粒pET28a.转化大肠埃希菌.37℃培养后,进行PCR扩增并测序。将重组质粒转入表达菌,加人IPTG诱导重组UspA蛋白表达.并经Ni2+亲和层析纯化。采用生物信息学软件分析UspA蛋白的生物学特性。结果获得全长为444 bp的鲍曼不动杆菌UspA基因,且成功构建了重组质粒pET28a-UspA.得到纯度较高的相对分子质量17X103的重组UspA蛋白。该蛋自为细菌的胞质蛋白,其a-螺旋占51%,延伸链占27%,无规卷曲的含量占31%。由2个同源UspA蛋白分子构成二聚体。结论成功克隆表达了鲍曼不动杆菌UspA蛋白。该蛋白可能含B细胞表位,而具有免疫原性,为其生物学活性及耐药机制研究提供了理论基础。     

鲍曼不动杆菌感染的诊断与治疗

鲍曼不动杆菌是人体正常菌群成员,近年来,该菌所致的特殊人群感染日益增加。该菌感染的诊断要符合感染性疾病诊断的一般原则,但在具体不同部位的感染,其诊断也有特殊要求;在耐药方面,要考虑异质性耐药;在治疗方面,该菌的泛耐药株对治疗构成了挑战,在预防用药、经验治疗、抢先治疗、靶向治疗等方面有一系列进展和共识。本文对上述进展作一综述。此外,本文还介绍了国内治疗最常见的两类药物舒巴坦制剂和替加环素的应用进展。     

鲍曼不动杆菌耐药性与噬菌体的相关性

<正>关于Ab形态结构与耐药性关系鲜有报告,噬菌体是感染细菌的病毒,具有溶原性和裂解性两种生长方式〔1〕,根据与宿主菌的相互关系,分为温和噬菌体、毒性噬菌体两种类型。过去人们关注毒性噬菌体裂解宿主菌,期待发挥治疗性应用,但长期研究并未取得实质性进展〔2〕。鲍曼不动杆菌(Ab)为非发酵革兰阴性杆菌,广泛分布于外环境中,它黏附力极强,是引起医院内感染的重要条件致病菌之一,在住院病人尤其是重症监     

布鲁氏菌外膜蛋白Omp2a抗原的克隆表达及其抗原性鉴定

目的构建和原核表达布鲁氏菌膜蛋白Omp2a,并进行抗原性鉴定。方法将布鲁氏菌外膜蛋白Omp2a基因连接到pET-30α原核表达载体上,转化到大肠埃希菌菌株BL21内。重组蛋白rOmp2a经IPTG诱导,亲和层析纯化后用SDS-PAGE凝胶电泳分离,确定目的蛋白的大小和表达丰度。通过Western blot与患者血清反应,确定重组rOmp2a的抗原性及诊断价值。结果成功构建布鲁氏菌外膜蛋白Omp2a的原核表达系统,测序表明阅读框架正确。用IPTG可诱导高表达Omp2a,SDS-PAGE显示其分子质量单位为38.4 ku,且其表达蛋白以包含体形式存在。Western blot显示rOmp2a能被布鲁氏菌感染患者血清识别,而不与细粒棘球绦虫和单纯疱疹病毒感染者血清反应。结论大肠埃希菌原核表达系统可高效表达不可溶的rOmp2a蛋白,该蛋白具有反应原性,对布鲁氏菌感染患者具有潜在的诊断价值。     

鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1受体结合蛋白gp37的克隆表达

目的 为进一步了解噬菌体与宿主菌之间的相互作用机制,对鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1受体结合蛋白gp37进行克隆表达。方法 原核表达噬菌体ZZ1重组受体结合蛋白gp37,从分子质量、抗原性以及对ZZ1吸附竞争干扰的功能等对表达的重组受体结合蛋白gp37进行鉴定。结果 PCR扩增ZZ1gp37基因后,成功诱导表达了含6×His标签的ZZ1重组受体结合蛋白gp37,SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量约为140×10³;使用0.5 mmol/L IPTG 16℃诱导过夜较37℃诱导4 h,蛋白可溶性表达增多;Western blot显示纯化蛋白可分别被his标签抗体和小鼠抗ZZ1多克隆抗体识别;竞争吸附试验显示,在重组ZZ1gp37蛋白存在的情况下,ZZ1对鲍曼不动杆菌AB09V的吸附效率与对照组的63.5%相比下降39.5%。结论 成功表达了噬菌体ZZ1的重组受体结合蛋白gp37,蛋白的分子质量、反应原性以及对ZZ1吸附的竞争干扰作用均符合预期,为噬菌体ZZ1与宿主菌相互作用机制研究奠定了基础。     

立氏立克次体外膜蛋白B基因片段的克隆与表达

目的立氏立克次体(Rickettsiarickettsii)外膜蛋白B(OmpB)基因(ompB)片段的克隆与表达。方法采用PCR方法,从立氏立克次体基因组中扩增其ompB基因片段,将该基因片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组原核表达质粒pQE30/ompB;将pQE30/ompB转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果获得长为1188bp的ompB基因片段,SDS-PAGE分析发现pQE30/ompB转化菌表达了一44kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫兔血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,与其它立克次体免疫血清反应呈阴性,用该重组蛋白免疫血清做间接免疫荧光,检测立氏立克次体结果为阳性,而检测贝氏柯克斯体、恙虫病立克次体和普氏立克次体的结果为阴性。结论pQE30/ompB转化的大肠杆菌表达了ompB基因片段,所产生的重组蛋白具有立氏立克次体抗原特异性和良好的免疫反应性。     

鲍曼不动杆菌耐药与生物膜形成关系的研究进展

<正>鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)为革兰染色阴性非发酵菌,被全球医疗机构视为最难控制的细菌之一。鲍曼不动杆菌常在危重患者中引发肺炎(尤其是呼吸机相关性肺炎)、尿道感染、血液感染、皮肤感染等。据统计,约10%的院内感染由鲍曼不动杆菌所致~([1-2])。然而,由于鲍曼不动杆菌的广泛耐药,其所致的感染很难得到有效控制。鲍曼不动杆菌极易获得抗性决定簇的能力,使它成为当前抗生素时     

鲍曼不动杆菌生物膜形成与耐药的相关性初探

目的探索鲍曼不动杆菌生物膜的形成与耐药的相关性。方法采用96孔板培养法模拟体内生物膜形成,结晶紫染色法鉴定各菌株生物膜生长情况。将鲍曼不动杆菌于黑色聚碳酸酯膜上形成生物膜,其上覆盖药敏纸片,然后将此结构置于涂有大肠埃希菌ATCC25922菌株的M-H平板上,通过测量抑菌圈直径观察生物膜对氯霉素和氧氟沙星的渗透限制作用。结果结晶紫染色测定各菌株均能于体外形成生物膜。除85号菌株外,各菌株与对照组相比,对氯霉素均有明显渗透限制作用,而对氧氟沙星无明显作用。结论生物膜对某些药物的渗透限制作用是细菌耐药的重要机制之一。     

2007-2010年医院鲍曼不动杆菌感染的耐药分析

目的 了解医院鲍曼不动杆菌感染的分布及耐药情况.方法 分析鲍曼不动杆菌菌株的标本来源和临床分布情况,用最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)法结合纸片扩散法(K-B法)检测其对抗菌药物的敏感性.结果 2007-2010年共分离鲍曼不动杆菌62株,其中53株(占85.5%)分离自痰标本,21株(占33.9%)分离自重症监护室(intensive care units,ICU).62例患者中54.8%(34例)的患者患有严重的肺部感染疾病.分离菌对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率为20.0%、敏感率为73.3%,对其他抗菌药物的耐药率超过60.0%.泛耐药菌占33.9%(21株),其中52.4%(11株)的泛耐药鲍曼不动杆菌感染发生在ICU病房.结论 鲍曼不动杆菌的耐药率较高,且呈多重耐药趋势.加强菌株的耐药性监测,以药敏结果指导临床用药有助于减少耐药菌株的出现.

Abstract：

Objective To investigate the prevalence and antimicrobial resistance of Acinetobacter baumannii in nosocomial infection.Methods Clinical features and the origin of A.baumannii samples were analyzed retrospectively.The minimal inhibitory concentration(MIC)and Kriby-Bauer diffusion test(K-B)were used to determine the Susceptibility to the antimicrobial agents.Results A total of 62 strains of A.baumannii were isolated from 2007 to 2010.Fifty-three strains(85.5%) of specimens were separated from respiratory tract.The isolation rate of A.baumannii was the highest in intensive care units(ICU)(21 strains,33.9%).54.8%(34/62)of patients suffered from severe lung infection.The resistance rate of cefoperazon/sulbactam was 20.0%.and the susceptible rate was 73.3%.The resistance rate to other antimicrobial agents is above 60.0%.The prevalence of multi-drug resistance of A.baumannii Was about 33.9%,and 52.4% of this kind of A.baumannii were occured in ICU.Condusion The infection of A.baumannii is more and more severe and tends to be resistant to multiple-drug and pan-drugs.The susceptible testing should be conducted to help the clinic to decrease the resistance rate.     

结核分支杆菌katG蛋白的高表达与纯化

目的 表达与纯化结核分支杆菌ｋａｔＧ蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法 将含有ｋａｔＧ基因的;ｐＥＴ２４ｂ－ｋａｔＧ表达载体转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,在异丙基硫代β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导下表达,分别对不同诱导时间的表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ以及考马斯亮蓝染色。获得稳定的高表达菌株后采用Ｘｐ;ｒｅｓｓ＾ＴＭ蛋白纯化系统对超声破菌液进行纯化。     

幽门螺杆菌外膜蛋白18的克隆表达及纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌（HP）外膜蛋白,为HP的疫苗开发及诊断试剂盒的研究奠定基础。方法用PCR方法从HP临床分离株9806的染色体DNA中扩增出OMP18基因片段,将目的基因插入表达载体pQE30中,重组载体pQE30-OMP18经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E．coli．M15,IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定其表达。结果PCR扩增出长度为537bp的OMP18基因,片段测序分析其与Gen—Bank公布的核苷酸序列相似性达99％;SDS—PAGE显示,重组工程菌经IPTG诱导表达了分子量为20．0kDa的目的蛋白,占总蛋白的20％,经纯化后,目的蛋白纯度达85％以上;Western blot结果表明,该蛋白可与兔抗HP的多克隆抗血清发生特异的抗原抗体结合反应。结论成功构建了OMP18表达载体pQE30-OMP18,并在大肠杆菌中获得高效表达,为HP疫苗有效抗原筛选及诊断试剂的开发奠定基础。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白A慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活

目的建立OmpA过表达慢病毒载体并观察其对RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活。方法以鲍曼不动杆菌ATCC 19606为模板,设计引物扩增OmpA基因,将其克隆至慢病毒表达载体pCDH-MSCV-copGFP中。将此表达质粒和辅助质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,浓缩病毒上清液并用GFP报告基因法测定病毒滴度;用包装病毒颗粒感染RAW264.7细胞48h,Real-time PCR法检测OmpA的mRNA表达水平,用Western blot法检测OmpA蛋白以及感染后NLRP3炎症小体相关蛋白。结果成功构建OmpA过表达慢病毒载体并在HEK293T细胞中包装得到病毒,经测定病毒滴毒为1.5×109 TU/mL;重组OmpA病毒感染RAW264.7细胞表达OmpA蛋白,该蛋白能引起NLRP3炎症小体激活。结论成功构建OmpA过表达慢病毒载体并证明OmpA可激活RAW264.7细胞NLRP3炎症小体。     

鲍曼不动杆菌ATCC17978中第二信使c-di-GMP相关代谢蛋白的生物信息学分析

目的采用生物信息学方法分析鲍曼不动杆菌ATCC17978中第二信使环鸟苷-磷酸(c-di-GMP)相关代谢蛋白,预测其性质和编码功能。方法通过在线数据库NCBI查找鲍曼不动杆菌基因组,从中筛选出含有GGDEF/EAL结构域的蛋白,通过MEGA4.0软件构建进化树进行分析,利用Swiss-Model软件分析该蛋白的三级结构。结果 Blast比对显示ATCC17978中含有GGDEF/EAL结构域和c-di-GMP代谢相关的候选蛋白12个,其中含有GGDEF结构域的蛋白10个,含有EAL结构域的蛋白5个,同时含有GGDEF结构域和EAL结构域的蛋白3个。蛋白序列分析含有GGDEF/EAL结构域的蛋白可以分为两类,其中5个蛋白质含有I位点。结构预测分析7个蛋白中含有1个或多个跨膜结构域,其中3个蛋白无跨膜结构域。三级结构预测出9个可信度较高的蛋白。结论鲍曼不动杆菌ATCC17978含有12个与c-di-GMP代谢相关GGDEF/EAL结构域蛋白,为探索c-di-GMP代谢网络奠定了基础。     

通过转录组学探讨外膜蛋白相关基因在多药耐药鲍曼不动杆菌生物被膜中的异常调控

目的 通过研究转录组学探讨外膜蛋白相关基因在多药耐药鲍曼不动杆菌生物被膜生成中的作用.方法 收集筛选我院多药耐药鲍曼不动杆菌菌株.高通量测序分析鲍曼不动杆菌在不同的生长状态下基因表达的差异.结果 多药耐药鲍曼不动杆菌生物被膜状态与快速生长期相比,确实存在基因表达差异.表达差异的基因中,106个基因表达上调,92个基因表达下调.其中,外膜蛋白的相关基因在生物被膜状态是显著表达的.结论 细菌的生物被膜状态是一种独特的存在形式.在生物被膜状态下,表达差异的基因集中于菌体外膜蛋白的表达和细胞内通路的因子调控.外膜蛋白是鲍曼不动杆菌生物被膜生成过程中表达最丰富的蛋白之一,在菌体生物被膜形成和成熟过程中发挥重要作用.     

产超广谱β-内酰胺酶鲍曼不动杆菌耐药机制的研究进展

广谱抗生素的广泛应用使鲍曼不动杆菌的耐药率不断升高，已成为日益严重的医疗事件和公共卫生问题，引起了人们的高度关注。目前在鲍曼不动杆菌已经发现了多种超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的基因型，特别是近年来新ESBL基因型不断地在该菌中被发现，如PER型、VEB型，但对其耐药机制仍不明确。因此，对于鲍曼不动杆菌产超广谱β-内酰胺酶的耐药机制深入研究势在必行。