基于Hedgehog信号通路的野黄芩苷抑制HT-29细胞源性结肠肿瘤干细胞体外自我更新的研究

目的:研究半枝莲中主要成分野黄芩苷对结肠肿瘤干细胞(CSC)自我更新的影响,并从Hedgehog信号通路阐明其作用机制。方法:从HT-29人结肠腺癌上皮细胞株中分拣出结肠肿瘤干细胞(HT-29CSC),并对其进行无血清悬浮培养。用CCK-8试验研究野黄芩苷对HT-29CSC活性的影响;用干细胞球形成试验研究野黄芩苷对HT-29CSC体外自我更新的影响;用qRT-PCR研究野黄芩苷对结肠肿瘤干细胞标记物基因CD133和增殖基因ki-67表达的影响,和对结肠肿瘤干细胞中Hedgehog信号通路基因Ptch1和Gli1表达的影响。结果:终浓度为40μg/ml、80μg/ml和160μg/ml的野黄芩苷可以浓度依赖性地抑制HT-29CSC体外活性,抑制HT-29CSC体外自我更新,下调结肠肿瘤干细胞标记物基因CD133和增殖基因ki-67 mRNA水平,抑制结肠肿瘤干细胞中Hedgehog信号通路基因Ptch1和Gli1 mRNA转录。结论:野黄芩苷可以抑制结肠肿瘤干细胞活性和自我更新,其机制在于抑制Hedgehog信号通路的活性。     

白花蛇舌草通过Wnt信号通路抑制结肠肿瘤干细胞分化

目的:研究白花蛇舌草对结肠肿瘤干细胞(CSC)分化的影响,从Wnt信号通路阐明其作用机制。方法:制备白花蛇舌草乙醇提取物,从人结肠肿瘤组织中消化、分拣出结肠CSC。用干细胞球形成试验研究白花蛇舌草对结肠CSC活性的影响,用含胎牛血清的DMEM/F-12培养基诱导CSC分化,并研究白花蛇舌草对结肠CSC分化的影响,以及对结肠CSC中CK20和CD133 mRNA水平的影响,用软琼脂克隆形成试验研究白花蛇舌草对结肠CSC体外转化的影响,用qRT-PCR研究白花蛇舌草对结肠CSC中Wnt信号通路基因β-catenin和TCF4表达的影响。结果:终浓度为125μg/ml、250μg/ml和500μg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物可以剂量依赖性地抑制结肠CSC球形成,抑制结肠CSC分化,下调结肠CSC中CK20和CD133 mRNA水平,抑制结肠CSC体外转化,并降低结肠CSC中β-catenin和TCF4 mRNA水平。结论:白花蛇舌草可以抑制结肠CSC分化,其机制在于抑制Wnt信号通路的活性。     

半枝莲通过Hedgehog信号通路抑制结肠肿瘤干细胞自我更新

目的:研究半枝莲对结肠肿瘤干细胞(CSC)自我更新的影响,从Hedgehog信号通路阐明其作用机制。方法:制备半枝莲乙醇提取物,从HT-29人结肠腺癌上皮细胞中分拣出结肠CSC,用Aqueous法,研究半枝莲对结肠CSC体外活性的影响,用干细胞球形成试验研究半枝莲对结肠CSC自我更新的影响。用qRT-PCR研究半枝莲对结肠CSC标记物基因CD133和Lgr5表达的影响,和对结肠CSC中Hedgehog信号通路基因Ptch1和Gli1表达的影响。结果:终浓度为125μg/ml、250μg/ml和500μg/ml的半枝莲乙醇提取物可以剂量依赖性地抑制结肠CSC体外活性,抑制结肠CSC自我更新,下调结肠CSC标记物基因CD133和Lgr5 mRNA水平,降低结肠CSC中Hedgehog信号通路基因Ptch1和Gli1 mRNA转录。结论:半枝莲可以抑制结肠CSC自我更新,其机制在于抑制Hedgehog信号通路的活性。     

野黄芩苷和野黄芩素制备研究进展

野黄芩苷是灯盏细辛中主要生物活性的黄酮类成分,具有扩张脑血管、降低脑血管阻力、增加脑血流量、改善微循环、抗血小板聚集等多种药理作用,目前已广泛用于临床治疗各种心、脑血管疾病。野黄芩素是其苷元及活性代谢物,相比野黄芩苷具有更好的活性。野黄芩苷和野黄芩素也就成为治疗心脑血管疾病等问题研究的热点。本文对野黄芩苷和野黄芩素的制备方法进行了综述,为它们进一步开发利用提供依据。     

从黄芩茎叶粗提物中制备野黄芩苷的研究

目的以黄芩茎叶粗提物为原料,制备野黄芩苷。方法运用单因素试验考察碱提pH、酸沉pH、固液比等提取条件对黄芩茎叶总黄酮含有量和浸膏得率的影响。结果碱提pH为7.5,酸沉pH为0.5,固液比为1∶12,所得沉淀中总黄酮质量分数为80%以上。同时,以甲醇为溶剂进行重结晶从总黄酮中分离得到野黄芩苷,经高效液相色谱检测,野黄芩苷质量分数为93.7%。结论本实验采用的方法操作简单,得到的野黄芩苷纯度较高,适合于工业化生产。     

姜黄素通过激活cAMP-PKA-CREB信号通路促进诱导多功能干细胞神经分化

目的探讨姜黄素促诱导多功能干细胞（iPSCs）定向神经分化的作用及机制。方法将分化的神经干细胞（NSCs）及神经元细胞分为空白组、姜黄素组及姜黄素+H89组，其中空白组采用维甲酸（RA）诱导培养，姜黄素组在上述基础上加入1μmol/L姜黄素，姜黄素+H89组加入1μmol/L姜黄素和20μmol/LH89（PKA抑制剂）。采用免疫荧光染色观察各组NSCs及神经元细胞的分化情况，ELISA法测定各组cAMP含量，WesternBlot法测定各组PKAc、pCREB、CREB、Nestin及MAP2蛋白表达。结果免疫荧光染色显示iPSCs经RA诱导可分化为NSCs并进一步分化为神经元细胞。在分化的NSCs及神经元细胞中，姜黄素组及姜黄素+H89组cAMP含量较空白组增加（P<0.05）；NSCs中姜黄素组Nestin、PKAc、pCREB表达较空白组均增加（P<0.05）；姜黄素+H89组Nestin、PKAc、pCREB表达较空白组及姜黄素组均减少（P<0.05）。神经元细胞中，姜黄素组MAP2、PKAc、pCREB表达较空白组均增加（P<0.05）；姜黄素+H89组MAP2、PKAc、pCREB表达较姜黄素组均减少（P<0.05）。结论姜黄素可以促进iPSCs分化为NSCs，并进一步分化为神经元细胞，而这一促进效应可能是通过激活cAMP-PKA-CREB信号通路实现。     

野黄芩苷镇痛作用的实验研究

目的:研究野黄芩苷的镇痛作用.方法:采用小鼠热板和小鼠扭体试验模型,观察药物对疼痛反应的影响.结果:腹腔注射200mg/kg野黄芩苷30～90min,小鼠对热刺激的痛阈值明显升高(与溶媒组比较P＜0.01或0.05),镇痛强度与阿司匹林相近(P＞0.05),但弱于25mg/kg吗啡(P＜0.01).皮下注射50～200mg/kg 野黄芩苷皆可显著抑制醋酸所致小鼠的扭体反应(与溶媒组比较P＜0.01或0.05),各剂量组间差异不显著(P＞0.05),镇痛强度弱于5mg/kg吗啡(P＜0.01);1.5mg/kg野黄芩苷侧脑室给药亦可显著抑制小鼠的扭体反应(与溶媒组比较P＜0.05).结论:野黄芩苷具有显著的镇痛作用,其机制与中枢作用有关.     

HPLC法测定清肝散结颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素

目的对清肝散结颗粒(猫人参、石见穿、白花蛇舌草、半枝莲及黄芩等)中所含的黄酮类化学成分黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素同时进行测定,建立制剂质量控制方法。方法采用高效液相色谱法,Waters Xterra Rp-C18色谱柱(3.0 mm×100 mm,3.5μm),流动相为乙腈(A)与0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱,体积流量0.4 mL/min,柱温20℃,紫外检测波长为275 nm,进样量5μL,运行时间60 min。结果 5个待测化合物与周围干扰峰达到基线分离,线性范围分别为黄芩苷4.604⁴60.4μg/mL(r=0.999 9);汉黄芩苷0.770 4460.4μg/mL(r=0.999 9);汉黄芩苷0.770 4⁷7.04μg/mL(r=0.999 6);野黄芩苷0.415 777.04μg/mL(r=0.999 6);野黄芩苷0.415 7⁴1.57μg/mL(r=0.999 8);黄芩素0.845 641.57μg/mL(r=0.999 8);黄芩素0.845 6⁸4.56μg/mL(r=0.999 9);汉黄芩素0.799 284.56μg/mL(r=0.999 9);汉黄芩素0.799 2⁷9.92μg/mL(r=0.999 7),日内/日间精密度均小于3%(n=3),平均回收率在97%79.92μg/mL(r=0.999 7),日内/日间精密度均小于3%(n=3),平均回收率在97%¹02%之间(n=6)。清肝散结颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素的含有量分别为3.798、0.829 9、0.180 5、0.158 9、0.0726 mg/g。结论该法简便、快捷、结果准确、重复性好、实用性强,可用于清肝散结颗粒中的质量控制。     

野黄芩苷对LPS诱发巨噬细胞炎症模型中MAPK信号通路及细胞因子基因表达的影响

目的通过构建巨噬细胞炎症模型,研究中药单体野黄芩苷对MAPK信号通路及细胞因子基因表达的影响。方法培养巨噬细胞RAW264.7,利用脂多糖构建细胞炎症模型,并在不同时间收集细胞。Western blot与RT-PCR法分别检测野黄芩苷对MAPK信号通路及细胞因子基因表达的影响。结果野黄芩苷能够显著抑制细胞炎症模型中JNK/SAPK与p38 MAPK信号通路的磷酸化水平,并且能够降低炎症因子TNF-α的基因表达水平,及提高抗炎细胞因子IL-10、TGF-β的基因表达水平来发挥其抗炎作用。结论野黄芩苷主要是通过抑制JNK/SAPK与p38 MAPK信号通路的磷酸化水平及提高抗炎细胞因子的基因表达水平来发挥其抗炎作用。     

Notch和BMP信号通路介导红景天苷促进小鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化研究

目的探讨BMP和Notch信号通路介导红景天苷诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞定向分化的分子机制。方法实验分为对照组、红景天苷诱导组和阻断组。利用细胞免疫荧光化学方法、Real-Time PCR方法和Western blotting方法分别研究了红景天苷对MSCs的增殖、形态以及对BMP和Notch信号通路的影响。结果红景天苷影响MSCs的增殖且促进其形成神经元样细胞;细胞免疫荧光结果显示,红景天苷可降低Notch1和Jadge1阳性表达率(P0.05);红景天苷诱导细胞12~72 h时,Notch1和Hes1 m RNA表达丰度明显下调(P0.05);特异性阻断剂DAPT阻断Notch信号通路后,神经元细胞标志分子NSE、MAP-2和β-tubulin III m RNA和NSE、β-tubulin III蛋白的表达水平与阻断前比较显著上调(P0.05)。12 h时Smad5和Smad8 m RNA的表达水平显著上调(P0.01),且12和24 h时Smad1/5/8蛋白表达上调(P0.05);Noggin阻断BMP信号通路后,NSE、MAP-2和β-tubulin III m RNA的表达丰度与诱导组比较明显下调(P0.05);DAPT和Noggin同时阻断Notch和BMP信号通路后,与单独阻断BMP信号通路后比较,MAP-2和β-tubulin III m RNA的表达上调,NSE和β-tubulin III蛋白的表达水平上调(P0.05)。结论红景天苷通过抑制Notch信号通路、激活BMP信号通路诱导MSCs向神经元细胞定向分化。     

Genistein inhibits nasopharyngeal cancer stem cells through sonic hedgehog signaling

Genistein, a soy derived isoflavanoid compound, exerts anticancer effects in various cancers. Nasopharyngeal cancer stem cells (NCSCs) are a small subpopulation of cancer cells which are responsible for initiation, progression, metastasis, and recurrence of nasopharyngeal cancer. The present study aimed to investigate the suppressive effects of genistein on NCSCs and its underlying mechanism. NCSCs were enriched from human nasopharyngeal cancer cell lines CNE2 and HONE1 through tumorsphere‐forming assay. It was shown that genistein inhibited the tumorsphere formation capacity, decreased the number of EpCAM⁺ cells, downregulated the expression of NCSCs markers, suppressed cell proliferation, and induced apoptosis of NCSCs. Genistein suppressed the activity of Sonic hedgehog (SHH) signaling, which was important for the maintenance of NCSCs, while activation of SHH signaling by purmorphamine diminished the inhibitory effects of genistein on NCSCs. Our data suggested that genistein inhibited NCSCs through the suppression of SHH signaling. These findings support the use of genistein for targeting NCSCs.     

Echinatin induces reactive oxygen species-mediated apoptosis via JNK/p38 MAPK signaling pathway in colorectal cancer cells

Colorectal cancer (CRC) is a very common and deadly cancer worldwide, and oxaliplatin is used as first-line chemotherapy. However, resistance usually develops, limiting treatment. Echinatin (Ech) is the main component of licorice and exhibits various therapeutic effects on inflammation-mediated diseases and cancer, ischemia/reperfusion, and liver injuries. The present study elucidated the underlying molecular mechanism of Ech-induced apoptosis in both oxaliplatin-sensitive (HT116 and HT29) and -resistant (HCT116-OxR and HT29-OxR) CRC cells. To evaluate the antiproliferative activities of Ech, we performed MTT and soft agar assays. Ech reduced viability, colony size, and numbers of CRC cells. The underlying molecular mechanisms were explored by various flow cytometry analyses. Ech-induced annexin-V stained cells, reactive oxygen species (ROS) generation, cell cycle arrest, JNK/p38 MAPK activation, endoplasmic reticulum (ER) stress, mitochondrial membrane potential depolarization, and multi-caspase activity. In addition apoptosis-, cell cycle-, and ER stress-related protein levels were confirmed by western blotting. Moreover, we verified ROS-mediated cell death by treatment with inhibitors such as N-acetyl-L -cysteine, SP600125, and SB203580. Taken together, Ech exhibits anticancer activity in oxaliplatin-sensitive and -resistant CRCs by inducing ROS-mediated apoptosis through the JNK/p38 MAPK signaling pathway. This is the first study to show that Ech has the potential to treat drug-resistant CRC, providing new directions for therapeutic strategies targeting drug-resistant CRC.     

龙鳖胶囊含药血清通过调控Hippo-YAP信号通路促进骨髓间充质干细胞迁移研究

目的 探索龙鳖胶囊含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)迁移和Hippo-Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)信号通路的影响.方法 通过全骨髓贴壁法提取大鼠原代BMSCs,取第3代细胞,采用流式细胞术检测CD29、CD44、CD...     

基于Hedgehog信号通路的熊果酸诱导结直肠癌SW480细胞凋亡的机制研究

目的 研究熊果酸通过经典Hedgehog信号通路影响人结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的作用及其机制.方法 通过显微镜观察熊果酸对SW480细胞形态的影响;采用MTT比色法检测熊果酸对细胞活力的影响;细胞划痕实验检测熊果酸对细胞迁移的影响;Hoechest/PI染色法观察熊果酸对细胞凋亡的影响;荧光探针法检测熊果酸对细...     

基于Wnt信号通路研究黄芩汤干预炎症微环境下结肠癌细胞上皮间质转化与细胞周期进程的作用机制

目的 研究黄芩汤对炎症微环境下结肠癌HT-29细胞上皮间质转化与细胞周期进程的影响。方法 使用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导淋巴瘤THP-1细胞,取细胞上清液作为条件培养基,将条件培养基加入HT-29细胞培养体系中构建炎症微环境下结肠癌细胞模型,给予黄芩汤（500、250、125μg/mL）干预后,Transwell法检测细胞迁移与侵袭能力;Western blotting检测海马无翅基因3a(recombinant wingless type MMTV integration site family member 3a,Wnt3a)、β-连环蛋白（β-catenin）、E-cadherin、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthasc kinase-3β,GSK-3β)、细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表达;qRT-PCR检测Wnt3a、β-catenin、E-cadherin、GSK-3β、CDK4和cyclin D1的m RNA表达。结果 与对...     

中药对神经干细胞增殖分化信号通路的综合调控作用分析

寻找促进神经干细胞增殖与分化的有效方法是加速神经干细胞临床应用的途径之一。该文分析了近十年来中外文献关于调控神经干细胞增殖分化的中药及其作用靶点与信号通路的报道,发现中药对神经干细胞增殖分化信号通路具有综合调控作用。第一,中药能通过Notch,PI3K/Akt,Wnt/β-catenin,GFs等信号通路影响神经干细胞的增殖与分化。(1)黄芪、淫羊藿、龟甲、远志能通过调节Notch信号通路中的关键蛋白或基因Notch1,NICD和Hes的表达起调控作用;(2)人参、银杏叶、丹参能通过介导PI3K/Akt信号通路发挥调控作用,但对该通路中上下游靶标的具体作用机制尚无研究;(3)姜黄、蛇床子可以上调Wnt/β-catenin信号通路中的关键靶蛋白Wnt3a及β-catenin的水平从而介导Wnt/β-catenin信号通路起调控作用;(4)三七、川芎可以通过促进分泌性生长因子EGF,b FGF等的表达发挥作用。第二,一些中药能通过多种途径诱导神经干细胞的增殖或分化:黄芪中的黄芪甲苷可以通过Notch信号通路调控神经干细胞的增殖或分化,但黄芪多糖含药血清又可以通过调节VEGF含量,活化PI3K/Akt信号通路发挥作用;淫羊藿中的淫羊藿苷和淫羊藿黄酮类可以分别介导Notch或GFs信号通路来控制神经干细胞的命运转化;人参皂苷Rg1可以通过Notch和PI3K/Akt信号通路发挥调控作用;银杏内酯B可通过激活PI3K/Akt信号通路、上调HIF-1α表达来有效调节神经干细胞凋亡相关基因和促进细胞增殖与分化,进而起到神经保护作用,而银杏叶提取物也能通过上调多种细胞因子的释放促进神经干细胞的增殖与分化;姜黄素可以通过Wnt/β-catenin与Notch信号通路来调控神经干细胞的增殖与分化。第三,信号通路的串话(cross-talk)是一些中药发挥促NSCs增殖与分化的重要途径。Notch与GFs信号通路、GFs与PI3K/Akt信号通路、Notch与Wnt/β-catenin信号通路等在调控神经干细胞的过程中相互协调,相互制约,在中药促进神经干细胞增殖或分化中发挥着关键的作用。中药对调控神经干细胞增殖分化信号通路的串话研究有待进一步加深,阐明其多靶点和多途径的作用机制与综合调控作用。     

虎杖苷通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导人宫颈癌细胞凋亡的初步研究

通过观察虎杖苷对宫颈癌HeLa细胞体外生长的抑制作用,初步探讨其诱导凋亡的可能机制。不同浓度的虎杖苷(50,100,150μmol·L~(-1))处理HeLa细胞后,采用MTT法检测虎杖苷对HeLa细胞增殖的抑制作用,AO/EB染色法荧光显微镜观察HeLa细胞凋亡的形态学变化;Annexin/PI双标记法检测HeLa细胞凋亡率;流式细胞仪分析HeLa细胞周期分布;RTPCR和Western blot法检测HeLa细胞中PI3K,AKT,mTOR,P70S6K的mRNA和蛋白表达。结果显示,虎杖苷显著抑制HeLa细胞增殖,且具有一定剂量依赖性;虎杖苷能够引起HeLa细胞发生S期阻滞,促进细胞凋亡,显著下调HeLa细胞中PI3K,AKT,mTOR,P70S6K的mRNA和蛋白表达。表明虎杖苷具有抑制宫颈癌HeLa细胞增殖及诱导凋亡的作用,其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路及其下游基因蛋白表达有关。     

槲皮素对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响

目的 研究槲皮素对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响,并探讨其对肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor factor 6,Traf6)/转化生长因子β激活酶1(transforming growth factor-βactivated kinase-1,TAK1)信号通路的调控作用.方法 将细胞按随机数字表法分为对照组、16μg/ml槲皮素组、Traf6抑制剂组、16μg/ml槲皮素+Traf6抑制剂组,对照组常规培养,其余各组加入16μg/ml槲皮素和/或Traf6抑制剂20 nmol/L进行干预.培养24 h,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,采用免疫印迹法检测Traf6/TAK1信号通路蛋白及caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)及Bcl-2表达,采用RT-PCR技术检测Traf6 mRNA表达.结果 与16μg/ml槲皮素组比较,16μg/ml槲皮素+Traf6抑制剂组Traf6[(0.59±0.03)比(0.96±0.04)]、p-TAK1[(0.43±0.02)比(0.72±0.04)]、caspase-3[(0.59±0.03)比(0.70±0.04)]、Bax[(0.48±0.03)比(0.67±0.04)]表达降低,Bcl-2[(0.54±0.03)比(0.44±0.02)]表达升高(P<0.05),Traf6 mRNA[(0.38±0.24)比(0.82±0.08)]表达降低(P<0.05).结论 槲皮素可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,其作用机制可能与激活Traf6/TAK1信号通路有关.