用单克隆抗体分析约氏疟原虫抗原的研究 Ⅰ.约氏疟原虫红内期与人疟原虫的共同抗原

用粗提的约氏疟裂殖子免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp 2/0瘤细胞融合,获得13株分泌抗约氏疟红内期单克隆抗体的杂交瘤。这些McAb分别属于小鼠:IgG_1,IgG_(2a),IgG_(2b)及IgG_3亚类。据免疫荧光观察,13株McAb可分为4类:1.与红内期各发育阶段的原虫能出现荧光反应;2.针对晚期滋养体及裂殖体;3.抗裂殖体及裂殖子;4.单纯抗裂殖子。有5株McAb与人疟原虫发生荧光反应,其中4株只与恶性疟原虫交叉,M_(26-32)则不仅与恶性疟原虫且与间日疟原虫均有强的交叉反应,,表明约氏疟与人的两种疟原虫间有共同抗原,并提示恶性疟原虫与间日疟原虫间也有共同抗原。共同抗原在不同种间的分布和含量不尽相同。用未经固定的感染红细胞加McAb作间接荧光试验,在感染红细胞表面未观察到荧光反应。     

用单克隆抗体对约氏疟原虫抗原的分析 Ⅰ.约氏疟原虫红内期与人疟原虫具有共同抗原

用粗提的约氏疟原虫裂殖子免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与S_p2/0瘤细胞融合,获得13株分泌抗约氏疟红内期的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤。这些McAb分别属于小鼠IgG_1,IgG_(2a),IgG_(2b),及IgG_3亚类。根据免疫荧光观察,13株McAb可以分为4类:(1)抗红内期各发育阶段的原虫;(2)抗晚期滋养体及裂殖体;(3)抗裂殖体及裂殖子;(4)单纯抗裂殖子。有5     

约氏和夏氏疟原虫红细胞期的免疫电泳分析

当原虫血症为70～90%时,从约氏和夏氏疟原虫感染的Balb/c小鼠取压积血0.1ml与0.5ml pH7.4 PBS混合,再加0.3ml弗氏完全佐剂乳化后,分4次肌肉注射免疫家兔,每2周一次,末次注射后1周采血。每ml血清用5×10~8正常鼠红细胞及3mg冻干的正常鼠血浆吸收。感染约氏或夏     

约氏疟原虫动合子的体外纯培养

目的　探讨提纯的约氏疟原虫合子培养形成动合子的方法。　方法　经黄尿酸刺激体外诱导感染鼠血中的约氏疟原虫雌雄配子形成、受精 ,采用梯度离心法分离得到纯净的合子 ,并在 MEM培养基中培养。　结果　从 10～ 15只感染小鼠血液可分离到 10 6数量级的约氏疟原虫合子 ;在 2 2℃条件下 ,经 2 2 h～ 2 4 h培养有动合子形成。　结论　可以直接从感染鼠血诱导形成并分离到约氏疟原虫合子 ,所得合子经培养可发育为动合子。     

约氏疟原虫血淋巴子孢子诱导斯氏按蚊免疫基因分析

目的对约氏疟原虫感染后8、 11和14 d的斯氏按蚊进行转录组测序,分析约氏疟原虫血淋巴子孢子诱导斯氏按蚊的免疫信号通路及效应机制。方法约氏疟原虫BY265株按常规腹腔接种感染健康昆明小鼠,3 d后选择血液内有配子体的小鼠供斯氏按蚊雌蚊吸血,于吸血感染后8、 11和14 d各取斯氏按蚊20只,提取总RNA进行高通量转录组测序,分析按蚊基因表达情况;使用统计算法Bray Curtis进行层级聚类,分析各样本间基因表达的差异;根据每百万转录本(TPM)值进行差异基因分析;使用gplots package软件绘制聚类热图,分析感染后8、 11和14 d, Toll信号通路(Toll)、免疫缺陷信号通路(Imd)、信号转导和转录激活因子(STAT)和c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)通路,效应分子如含硫酯蛋白家族分子(TEP)、抗菌肽、一氧化氮合酶(NOS)、硝化反应相关分子等的表达情况;利用实时荧光定量PCR (qPCR)扩增Rel1、 Rel2转录因子、含硫脂蛋白分子(TEP1)和血红素过氧化物酶(HPX8)进行验证。结果层级聚类分析显示,斯氏按蚊感染后11 d与8 d和14 d的基因表达变化差异较大。差异基因分析结果显示,斯氏按蚊感染后11 d与8 d相比,有1 109个基因上调,257个基因下调;感染后14 d与8 d相比,有62个基因上调,136个基因下调;感染后14 d与11 d相比,有174个基因上调,196个基因下调。聚类热图分析结果显示,在感染后11 d与8 d和14 d的比较中,斯氏按蚊Rel1转录因子、 Toll5A和Toll1A受体分别上调约1.9、 1.8和2.1倍;双过氧化物酶和双氧化酶均上调约2倍;HPX8上调约1.5倍。qPCR验证结果显示,感染后11 d Rel1、 Rel2和HPX8的相对表达量为3.43、 3.95和4.01,与对照组的0.82、 0.88和1.01差异有统计学意义(P 0.01)。结论约氏疟原虫血淋巴子孢子可诱导斯氏按蚊Toll信号通路通过直接或协调其他通路调控硝化反应相关分子表达。     

影响约氏疟原虫孢子增殖的因素

作者对影响约氏疟原虫——斯氏按蚊系统鼠疟模型中孢子增殖因素的观察结果显示,小鼠切脾后,输血接种约氏疟原虫,原虫血症出现早,并维持在较高水平,动物死亡数增加。正常小鼠输血感染后第2～4天对斯氏按蚊的感染力最高,以后开始下降;但切脾小鼠输血感染后至第10天供蚊叮咬尚获得较高的腺感染率。以0.05％对氨基苯甲酸(PABA)在蚊血餐前后饲蚊,蚊胃的卵囊感染数均增加。约氏疟原虫的输血接种时间对斯氏按蚁的感染力有显著的影响,接种时间在12:00时,感染高峰在夜间20:00～24:00;而接种时间在24:00时,则感染高峰在上午8:00～12:00时。     

约氏疟原虫动合子的体外纯培养

目的 探讨提纯的约氏疟原虫合子培养形成动合子的方法。方法 经黄尿酸刺激体外诱导感染鼠血中的约氏疟原虫雌雄配子形成、受精，采用梯度离心法分离得到纯净的合子，并在MEM培养基中培养。结果 从10～15只感染小鼠血液可分离到10^6数量级的约氏疟原虫合子；在22℃条件下，经22h～24h培养有动合子形成。结论 可以直接从感染鼠血诱导形成并分离到约氏疟原虫合子，所得合子经培养可发育为动合子。     

大鼠感染约氏疟原虫后的保护性免疫

前已报道,约氏疟原虫子孢子入侵大鼠肝细胞与枯氏细胞的吞噬活性水平呈正相关,而与其异化代谢水平呈负相关。体外试验证明,伯氏疟原虫子孢子可主动侵入小鼠腹腔巨噬细胞 在正常情况下,巨噬细胞很快死亡而子孢子则完好无损,但在免疫血清条件下,巨噬细胞中子孢子迅即退化。大鼠感染伯氏疟原虫急性期,其血清在体外有抑制腹腔巨噬细胞的吞噬作用。以往研究提示红内期感染条件下有可能通过抑制或刺激单核巨噬细胞系统而影响子孢子的入侵。现用对约氏疟原虫子孢子敏感的Wistar大鼠,观察其在感染约氏疟原虫急     

差异显示逆转录PCR鉴定约氏疟原虫红前期发育相关基因及其特征分析

目的 寻找约氏疟原虫红前期发育相关基因,进行序列分析并推测其功能.方法分别提取约氏疟原虫感染人鼠(IL)和正常大鼠(UL)肝脏总RNA,根据疟原虫基因A+T含昔高(＞70%)的特点,设计可选择性扩增约氏疟原虫基因的G+C含量为40%的引物,采用差异显示RT-PCR(differential display RT-PCR,DD-PCR)技术进行扩增,筛选筹异片段,经TA克隆后测序并进行序列分析. 结果获得6个约氏疟原虫红前期发育相关基因 PyHs4、PyHs5、PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9;其中PyHs4与约氏疟原虫乙酰葡糖胺磷酸变位酶(phosphoacetylglucosamine mutase,AGM,ID:PY02130)基因具有91%的柑似性,PyHs5与约氏疟原虫红细胞膜蛋白3(erythrocyte membrance prontein 3.PyEMP3,ID:PY05500)基因具有100% 的同源性,PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9经Blast序列分析为疟原虫基因,但功能未知.结论应用DD-PCR技术成功扩增了约氏疟原虫红前期发育相关基因,为进一步进行重组表达、功能及疫苗研究奠定了基础.     

约氏疟原虫与伯氏疟原虫侵入期抗原的初步研究

目的　用针对鼠约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii)侵入期的8种单克隆抗体,对约氏疟原虫和伯氏疟原虫(P.berghei)侵入期即动合子、裂殖子和子孢子棒状体和表面抗原检测分析。　方法　间接免疫荧光实验(IFA)对各侵入期抗原进行亚细胞结构定位,SDSPAGE及Western印迹对两种鼠疟原虫的不同侵入期进行抗原组分分析。　结果　经上述两种方法检测发现,顶端复合体抗原成分复杂,约氏疟原虫和伯氏疟原虫的棒状体有共同的抗原表位,约氏疟原虫的动合子与其自身的裂殖子有类似成分,也有各自独特的抗原。两种鼠疟原虫动合子抗原有类似成分。约氏疟原虫的子孢子具有与裂殖子、动合子不同的抗原成分。　结论　疟原虫侵入期棒状体和表面抗原在同一虫种的不同侵入期和不同虫种中有共同的抗原表位,也有各自的独特组分。     

一种简易的分离约氏疟原虫方法

以国产泛影酸及葡甲胺制成密度梯度进行离心,分离除去未感染红细胞及宿主白细胞,再用氯化铵水溶液破红细胞,可在较短时间内制得去除95～98％宿主红细胞及白细胞的约氏疟原虫样品。     

一种简易的分离约氏疟原虫方法

<正>本文报告以上海淮海制药厂产的泛影酸及葡甲胺,在较短时间内制得去除95～98%宿主红细胞和白细胞的约氏疟原虫样品。实验所用约氏疟原虫系1976     

约氏疟原虫红内期的体外培养

本文作者应用Eagle改良的最小基本培养基MEM,内含5%胎牛血清,葡萄糖含量为RPMI 1640培养基的5倍,所用的气体含10%CO_2。针对约氏疟原虫偏爱侵入网织红细胞,因此在培养中使用两种来源的网织红细胞。一种是苯肼(Phenylhydrazine)诱发者:即未感染的CBA小鼠自腹腔内给予盐酸苯肼2.5mg,8天后,小鼠血内即含有20～30%的网织红细胞;另一种称之为“危象后期”(post-crisis)者:即小鼠接种感染后,用药物清除疟原虫,血内即含有40～60%未感染的网织红细胞。培养在37℃和20℃两种温度下进行。     

抗药性约氏疟原虫株的诱发和克隆

用诱变剂N-甲基-N＇-硝基-N-亚硝基胍在体外处理约氏疟原虫感染鼠红细胞,然后种回小鼠体内,在药压下选出抗药性虫株,经数次克隆化分离得到高度抗氯喹(AC-1)和抗酮替芬(AK-1,AK-2)等抗药性虫株。AC-1对氯喹的耐受力比原敏感株高145倍,AK-2对酮替芬的耐受力则提高7倍。在AC-1与AK-2之间不呈现交错抗药性。经去药压下传30～50鼠代,抗药性仍稳定,因而可用于疟原虫遗传基因等的分析研究。     

约氏疟原虫感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用

目的观察约氏疟原虫17XL虫株感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用。方法取C57BL/6小鼠20只,腋下注射传代培养的B16F10黑色素瘤细胞;次日,将小鼠随机分为约氏疟原虫(P.y)感染组和对照组2组,10只/组;P.y感染组小鼠每只腹腔注射1×106个含虫红细胞率为20%的小鼠红细胞;对照组小鼠腹腔注射等量的C57BL/6小鼠正常红细胞。观察两组小鼠黑色素瘤出瘤时间并测量肿瘤的体积。结果 P.y感染组小鼠黑色素瘤出瘤时间为注射黑色素瘤细胞后(11.30±0.21)d,晚于对照组[(10.40±0.22)d](P0.05);自可精确测量瘤体起至实验终点,2组小鼠肿瘤均不断增长,P.y感染组瘤体体积均显著小于对照组(P均0.05);P.y感染组瘤体生长速度为(71.10±6.29)mm3/d,明显慢于对照组[(302.80±49.94)mm3/d](P0.05),且P.y感染组肿瘤每日生长速度亦明显慢于对照组(P均0.05)。结论约氏疟原虫感染可以延缓肿瘤出瘤时间,且对小鼠黑色素瘤瘤体的增长具有明显的抑制作用。     

约氏疟原虫某些生物学特性的实验研究

本文报告了约氏疟原虫(Plasmodium yoelii By 265 strain)有以下的生物学特性:1.血传和蚊传的小鼠分别于24～96h和2～8d首次查到原虫,见虫后的原虫血症和配子体血症,在消长过程中分别可见2～4和2～3个峰;2.无论接种虫血或子孢子.蚊媒感染高峰均出现于首次见虫的第3d或第4d;以蚊胃感染率为指标,未见配子体活力有明显的周期性,而感染度则显示上升期、高峰期和下降期三个不同时期;3.蚊媒感染高峰一般较接种子孢子时间晚7～8h;4.见虫后第10d,已“失活”的配子体经血传给健康小鼠12h后,可使90％的蚊媒获得感染,且卵囊指数高达63.6;5.在保种过程中,最佳血传时间为种源鼠见虫的第6～8d,至第25代,配子体对蚊媒仍有较强的感染力。     

抗约氏疟原虫血清控制鼠疟感染有效成分的分析

用约氏疟原虫(P.y.)裂殖体、裂殖子、全虫等抗原和淆虫免疫小鼠,制备多种免疫血清。小鼠体内被动转移上述血清发现只有活虫感染或经氯喹治疗恢复后的小鼠血清可以使受者获得保护,并可在体外抑制裂殖子侵入红细胞。实验表明氯喹治疗血清中起保护作用的成分是抗体。血清中的其它因子和可能残存的氯喹没有显示控制疟原虫感染的作用。用同位素标记、免疫沉淀、SDS-PAGE和自显影技术发现氯喹治疗血清和其它几种免疫血清沉淀的抗原有明显差异。氯喹治疗血清可以特异识别245、210、190、156和130KD抗原,因此这些特异抗体很可能是氯喹治疗血清中对约氏疟原虫感染有阻断作用的成分。     

青蒿琥酯钠对约氏疟原虫作用的流式细胞分析

用流式细胞术检测分析了青蒿琥酯钠对鼠约氏疟原虫的作用。结果表明实验组鼠的疟原虫DNA含量随着给药后时间的推移而逐渐减少,24h后,约氏疟原虫DNA的荧光分布几乎消失,提示青蒿琥酯钠能够抑制约氏疟原虫DNA的合成。     

蛋白激酶9在约氏疟原虫生长发育中的作用

目的探究蛋白激酶9 (PK9)在约氏疟原虫生长发育中的作用。方法基于疟原虫PlasmoDB数据库,查找约氏疟原虫致死株17XL (Py17XL)的PK9序列信息, BLAST比对Py PK9和恶性疟原虫PK9(Pf PK9)以及人蛋白激酶p78的同源性。提取Py17XL株野生型(WT)基因组DNA,设计引物, PCR扩增PK9基因。采用CRISPR-Cas9技术,将同源臂与sgRNA序列一起连接到PYC-MCS质粒中,构建PK9基因敲除(PK9KO)重组质粒。重组质粒电转至Py17XL虫株内,经乙胺嘧啶筛选、克隆,进行PCR鉴定和测序。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT感染组和PK9KO感染组,每组5只,重复3次实验。每鼠腹腔注射1×105个红内期疟原虫,每隔24 h取血检测小鼠原虫血症,观察小鼠存活情况。200只3～5日龄的斯氏按蚊随机分为WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组,每组100只。于吸血8 d后解剖蚊胃,每组随机选取15只斯氏按蚊进行解剖,测定蚊胃中卵囊的数量。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组,每组5只,重复2次实验。每鼠尾静脉注射1×103个子孢子,每隔12 h取血,涂片观察其原虫血症出现时间。结果Py PK9与Pf PK9的序列一致性为82.5%, Py PK9和人类蛋白激酶p78的一致性为39.4%。PK9基因PCR扩增产物的长度约为597 bp。经PCR鉴定、测序确定PK9KO重组质粒构建成功, Py17XL虫株成功敲除PK9基因。WT感染组小鼠迅速出现原虫血症,感染后5～6 d全部死亡, PK9KO感染组小鼠全部存活,原虫血症在感染后17 d消失。WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组的斯氏按蚊感染率分别为60.0%(9/15)和66.7%(10/15),差异无统计学意义(P 0.05)。WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组小鼠均于72 h查见原虫血症。结论PK9在红内期Py17XL的毒力中发挥了重要作用。