一起诺如病毒GⅡ.17型引起的急性胃肠炎病原学诊断及基因特征分析

目的对长沙市2014年12月某厂区暴发的一起急性胃肠炎疫情进行病原学诊断及对其致病原进一步的基因分型研究。方法共采集6例病人肛拭子标本和可疑水源标本4份,提取核酸后,诺如病毒GI/GII型real-time RT-PCR试剂盒检测;阳性标本普通RT-PCR扩增VP1基因片段,产物测序后BLAST比对确定其型别,并构建进化树分析其进化关系。结果 10份标本real-time RT-PCR扩增结果显示为诺如病毒GII型,VP1区片段RT-PCR扩增后产物测序,BLAST比对发现与2014年香港诺如病毒株GII/Hu/HKG/2014/GII.17/CUHK-NS-463同源性最高,达99%,证实为诺如病毒GII.17型;构建系统进化树分析显示本次疫情分离的毒株与日本、香港、台湾等亚洲地区的毒株亲缘关系更为接近,而与美国、法国等地区的毒株亲缘关系则较远。结论诺如病毒是引起此次急性胃肠炎疫情的病原体,且引起暴发的病毒株属于GII.17型。     

GII.P16-GII.2型诺如病毒VLPs的纯化研究北大核心CSCD

目的诺如病毒(Norovirus)是一种重要的人畜共患病病毒,可感染人、猪、牛、犬等多种动物,引起诺如病毒病,每年给全球造成巨大的经济损伤。本研究基于AKTA纯化系统探索诺如病毒VLPs的纯化工艺。方法将诺如病毒重组杆状病毒接种到SF9细胞中培养,通过Western blot、间接免疫荧光试验以及SDS-PAGE进行鉴定,对鉴定正确的细胞培养产物采用阴、阳离子柱进行病毒的层析纯化,并对层析柱的选择、层析缓冲液的pH值、洗脱液NaCI浓度等进行优化。基于优化后的参数或条件通过AKTA纯化系统纯化诺如病毒VLPs,分析纯化效果。结果经Western blot、间接免疫荧光、以及SDS-PAGE等鉴定,诺如病毒重组杆状病毒转染SF9细胞后表达诺如病毒VLPs。采用阴、阳离子柱进行病毒的层析纯化,优化的纯化参数或条件为:阴离子纯化柱,层析缓冲液pH值为6.0,洗脱液NaCI浓度为0.2 mol/L。结论诺如病毒重组杆状病毒转染SF9细胞后表达诺如病毒VLPs。优化的AKTA纯化系统可用于诺如病毒VLPs的纯化。     

多重荧光RT-PCR同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒方法的建立

目的建立可同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的双重荧光RT-PCR快速检测方法,并应用于临床标本的检测。方法使用针对GI型和GⅡ型诺如病毒各亚型代表株保守序列设计的特异性引物和TaqMan探针,通过调整引物、探针浓度优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系。对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行评估,并对临床粪便标本进行检测,与已有的单重荧光RT-PCR方法进行比较。结果实验结果表明,该检测方法特异性强,对GⅠ型、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒进行检测,均无交叉反应;对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达1pg/mL和10pg/mL,并且重复性好;对101份临床标本分别用已有的单重荧光RT-PCR和本文建立的多重荧光RT-PCR进行检测,结果显示本文建立的多重荧光RT-PCR方法对GⅠ型诺如病毒的检测能力优于前者。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR方法能同时对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒进行快速检测,并且灵敏度高,特异性好,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速检测。     

673例急性腹泻患儿诺如病毒GⅠ、GⅡ型感染快速筛查结果分析

目的?分析西安市儿童医院收治的急性腹泻患儿诺如病毒感染的流行病学特征,为西安市儿童诺如病毒防控提供科学依据。方法?采用胶体金法检测2021年1月—2022年12月西安市儿童医院收治的673例急性腹泻患儿的粪便样本诺如病毒GⅠ、GⅡ型。结果?673例样本中,诺如病毒检出率为20.51%（138/673）,138例诺如病毒阳性样本中GⅠ型占34.06%（47/138）、GⅡ型占46.37%（64/138）、GⅠ型/GⅡ型占19.56%（27/138）;诺如病毒阳性样本集中在第1季度;男女急性腹泻患儿诺如病毒检出率分别为21.63%（85/393）、18.93%（53/280）;年龄＜3岁和≥3岁急性腹泻患儿的诺如病毒检出率之间差异有统计学意义（χ2＝3.852,P=0.001）,其中0～6个月、7～12个月、1～岁、2～岁急性腹泻患儿诺如病毒检出率较高,依次为32.53%、30.48%、23.23%、30.43%;3～岁急性腹泻患儿主要发生诺如病毒GⅠ型/GⅡ型混合感染,占80%。结论?西安市急性腹泻患儿感染诺如病毒基因型主要是GⅡ型,春冬季节是高发期,年龄＜3岁婴幼儿是诺如病毒易感人群。     

GⅡ-4型诺如病毒体外结合唾液HBGAs受体的检测与分析

目的建立诺如病毒（Norovirus,NoV）结合唾液HBGAs受体的实验方法、验证2株GⅡ-4型NoV毒株与我国人群唾液HBGAs的结合方武。方法收集健康志愿者唾液标本,采用凝集抑制实验法检测唾液中HBGAs血型物质,用EIA法检测NoV VLPs、阳性毒株与HBGAs的结合情况。结果63份标本检出O型21例（占33．3％）,B型14例（占22．2％）,A型和非分泌型各13例（分别占20．6％）,AB型2例（占3．2％）。rVA387、2株GⅡ-4型毒株均能结合分泌型,与非分泌型唾液不反应。结论本研究成功建立了NoV结合唾液HBGAs受体的实验方法,通过NoV毒株与HBGAs相互作用的研究有助于了解NoV的宿主适应特性及病毒进化和流行规律;同时为筛选防治我国人群的抗NoV药物提供技术平台。     

凋亡素VP3蛋白的原核表达及纯化

目的构建凋亡素VP3蛋白的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法采用PCR法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶将VP3基因插入线性pET15b,构建重组表达质粒pET-15b-VP3;经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达凋亡素VP3蛋白;经Ni-NTA树脂亲和层析,对纯化产物进行SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定。结果成功构建凋亡素VP3蛋白原核表达质粒,表达并纯化了分子量为13.6 kD的凋亡素VP3蛋白。结论凋亡素VP蛋白原核表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用凋亡素VP3蛋白进行抗肿瘤研究奠定了基础。     

贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法的建立

目的建立贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法。方法对比分析6株主要流行的GⅠ、GⅡ诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选保守区域引物,优化建立SYBR Green Ⅰ荧光定量检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证。结果引物P289/290可同时检测GⅠ、GⅡ诺如病毒,SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法在病毒浓度10~3～10~9 copies之间呈现良好的线性关系(R~2=0.993,P0.01),熔解曲线Tm值可区分GⅠ和GⅡ不同基因群的诺如病毒(F=7 507.60,P0.05)。120份贝类样品阳性检出率5.83%,其中阳性结果测序鉴定与快速分群方法结论一致。结论该方法成本低、检测快速、分群准确,具有良好重复性,适用于贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒的快速检测与分群。     

常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用

目的建立GI、GII型诺如病毒的常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法,并对两种方法进行应用。方法优化筛选出最佳PCR反应体系与反应条件,并从灵敏性、特异性、临床样品检测等方面对建立的方法进行比较与评价。结果该两种方法特异性强,与札幌病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应,同一体系内GI、GII型诺如病毒相互之间没有干扰;常规RT-PCR最低检测限为103copies/μL,荧光定量RT-PCR最低检测限为102copies/μL;对180份临床粪便样品进行检测,常规RT-PCR则检测率为5.56%(10/180),符合率达97.22%,荧光定量RT-PCR检测率为8.33%(15/180),符合率达100%;对15份阳性样品测序分析,证实均为诺如病毒。结论建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可用于诺如病毒的快速检测,荧光定量RT-PCR更为灵敏。     

VEGF121-DFF40融合蛋白原核表达、纯化及体外抗肿瘤活性

目的 在大肠杆菌中表达VEGF-DFF40基因并纯化融合蛋白,MTT法检测其体外抗肿瘤活性.方法 用RT-PCR法扩增目的基因,两基因连接并在PET28a中表达,对产物进行SDS-PAGE电泳及Western印迹分析;体外培养HepG2细胞,HUVEC细胞,用MTT法检测4种浓度VEGF-DFF40融合蛋白及PBS的细胞毒性.结果 成功构建了重组表达质粒,并纯化出高纯度的融合蛋白,MTT法融合蛋白对两种细胞的直接作用与PBS组均有显著性差异(P＜0.01),提示此融合蛋白对两种细胞均有直接杀伤作用.结论 本研究成功获得了高纯度的VEGF121-DFF40融合蛋白,并初步证明其具有免疫学活性,为更进一步研究其生物学活性奠定了基础.     

丙型肝炎病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及初步纯化

ＨＣＶＥ２抗体在慢性ＨＣＶ感染中有较高的检出率（８０％～９７％）,与病毒血症密切相关,抗体滴度与病毒复制、ＨＣＶＲＮＡ的滴度相关。本研究在大肠杆菌中高效表达了ＨＣＶＥＺ蛋白,并进行了蛋白的初步纯化。用分子克隆技术,将ＨＣＶＥ２基因连接到非融合蛋白的原核表达载体ＰＫＫ２２３－３上,并转化大肠杆菌,经扩大培养,提取质粒进行酶切鉴定而获得含有Ｅ２基因的阳性克隆（ｐＫＫＥ２）。挑取Ｅ２阳性克隆单个苗落接种于１ｍｌ培养基中,３７℃振摇培养,细菌生长至对数生长期时,加入ＩＰＴＧ诱导Ｅ２蛋白表达５小时。离心去…     

肠道病毒71型2C蛋白的异源表达及纯化

目的获得高纯度、性状均一的可溶蛋白肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)2C。方法截取2C蛋白的6个包含ATPase/解旋酶等核心结构域的基因片段,分别使用含有His标签和MBP促溶标签的表达载体在大肠埃希菌中进行异源表达,分子筛层析纯化2C蛋白,SDS-PAGE电泳检测表达产物和纯化蛋白。结果成功将EV71 2C蛋白的6个片段进行了克隆表达并纯化,获得了高纯度、性状稳定的可溶蛋白MBP-2C91aa-256aa和MBP-2C118aa-256aa。SDS-PAGE检测2C蛋白纯度达97%以上,分子质量与预期结果一致。纯化的2C蛋白浓度为8.8mg/ml。结论91aa-256aa和118aa-256aa片段的MBP-2C截短蛋白比包含其他片段的截短蛋白性状稳定、均一,MBP标签提高了2C的6个截短蛋白的可溶性。高纯度可溶蛋白的制备为其晶体结构和功能研究奠定了基础。     

肠道病毒71型结构蛋白VP1的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌表达系统表达EV71 VP1蛋白并对其抗原性进行初步鉴定;为EV71疫苗研制奠定基础。方法采用PCR扩增EV71 VP1基因2-274aa片段,并将其插入表达载体pET30a（＋）,转化Transetta（DE3）菌株,SDS-PAGE和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;探讨目的蛋白的最佳表达条件。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,Western Blot证实其抗原性良好;该蛋白的最佳表达条件是37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导表达4 h。结论表达并鉴定了EV71 VP1抗原;本研究为EV71疫苗研制及检测试剂盒的建立奠定了基础。     

肠道病毒71型VP1包涵体蛋白的复性与纯化

目的 利用原核表达系统,经优化诱导条件及变、复性将包涵体形式肠道病毒71型结构蛋白VP1进行纯化。方法 通过RT-PCR扩增VP1基因,并应用基因克隆技术将VP1基因与pET-28a原核表达载体连接,之后将重组载体转化至大肠埃希菌Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后对包涵体进行变、复性,采用His镍柱亲和层析对VP1蛋白进行纯化,利用SDS-PAGE和Western blot对VP1蛋白进行分析鉴定。结果 PCR扩增出891 bp的EV71-VP1基因,双酶切鉴定原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1构建正确。重组载体转化DE3后经IPTG诱导表达VP1蛋白,且以包涵体形式存在。将包涵体变、复性,经SDS-PAGE分离后进行镍柱纯化,得到较纯的目的蛋白,Western blot分析该蛋白能被相应抗体识别。结论 构建的原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1转化DE3后经IPTG诱导表达以包涵体形式存在的VP1蛋白,复性后纯化的VP1蛋白具有免疫原性,为EV71 VP1蛋白的研究与开发奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组19型VP1蛋白生物信息学分析

目的 分析柯萨奇病毒A组19型(coxsackievirus A19,CVA-19)VP1蛋白的理化性质、结构功能并预测其线性B细胞表位和T细胞表位。方法 应用ProtParam分析CVA-19 VP1蛋白的理化性质;ProtScale预测其亲疏水性;使用SignalP 6.0、DeepTMHMM、NetPhos-3.1和Motif Scan分别预测CVA-19 VP1蛋白的信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点和脂酰化位点;利用NetCGlyc-1.0、NetNGlyc-1.0和NetOGlyc-4.0分别预测CVA-19 VP1蛋白的C-甘露糖基化位点、N-糖基化位点和O-N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine, GalNAc)(粘蛋白型)糖基化位点;通过SOPMA和SWISS-MODEL在线工具分别预测CVA-19 VP1蛋白的二级结构和三级结构;使用网络服务器IEDB、Bepipred 3.0、ABCpred和SVTMrip联合预测其线性B细胞表位;应用IEDB和SYFPEITHI综合预测其T细胞表位。结果 CVA-19 VP1蛋白的分子质量为33.099 ku,...     

寨卡病毒prM蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的通过原核表达系统表达纯化寨卡病毒(zika virus,ZIKV)prM膜蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。方法在对寨卡病毒膜蛋白prM进行生物信息学分析的基础上,去除其跨膜域,对该蛋白的密码子进行优化,化学合成基因序列并连接到表达质粒pET32a,重组质粒转化E.coli.BL21(DE3),并对其进行测序,然后进行原核诱导表达,诱导产物进行SDS-PAGE鉴定并用His柱纯化。纯化的重组蛋白用于免疫BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法和Western blot检测血清抗体效价及特异性。结果原核表达系统成功表达了截短prM蛋白,相对分子质量(Mr)为37×10~3,与预期相符。经过His柱纯化后获得高纯度的目的蛋白;该蛋白免疫BALB/c雌鼠后诱导产生特异性多克隆抗体,ELISA效价为1∶819 200;Western blot显示制备的多克隆抗体能性识别prM蛋白。结论利用原核表达系统高效表达并纯化了prM膜蛋白,制备的多克隆抗体效价高,特异性强,为进一步研究该病毒的致病机制及建立ZIKV感染快速诊断方法奠定了基础。     

肠道病毒71型VP1蛋白研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)为手足口病的主要病原体。目前,手足口病的发病机制并不完全清楚,临床上缺乏有效的疫苗及特异性治疗药物。作为EV71主要衣壳蛋白,VP1在EV71的吸附和穿入过程中起着重要作用。另一方面,VP1上存在特异性中和性抗原表位,在EV71疫苗研究中占有重要地位。本文主要概括EV71 VP1结构、功能及与之相关疫苗的研究进展。     

常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用北大核心CSCD

目的建立GI、GII型诺如病毒的常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法,并对两种方法进行应用。方法优化筛选出最佳PCR反应体系与反应条件,并从灵敏性、特异性、临床样品检测等方面对建立的方法进行比较与评价。结果该两种方法特异性强,与札幌病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应,同一体系内GI、GII型诺如病毒相互之间没有干扰;常规RT-PCR最低检测限为103copies/μL,荧光定量RT-PCR最低检测限为102copies/μL;对180份临床粪便样品进行检测,常规RT-PCR则检测率为5.56%(10/180),符合率达97.22%,荧光定量RT-PCR检测率为8.33%(15/180),符合率达100%;对15份阳性样品测序分析,证实均为诺如病毒。结论建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可用于诺如病毒的快速检测,荧光定量RT-PCR更为灵敏。     

丙型肝炎病毒Core蛋白类病毒颗粒的表达及纯化

目的 通过PCR将丙肝病毒(HCV)Core与蜂毒素信号肽(Mel)进行融合,构建到pIZ/V5载体上获得pIZ/V5-Core-Mel表达载体.方法 将pIZ/V5-Mel-core稳定转染Sf9细胞,经Zeocin抗性筛选,获得单克隆抗性细胞株.RT-PCR检测结果表明获得稳定表达Mel-core的细胞系SO-Core.对稳定细胞系Sf9-Core的上清进行离心纯化并Western印迹检测.结果 在上清离心纯化的样品中有HCV Core形成的类病毒颗粒(VLPs).透射电镜显示Core蛋白能自组装成直径约30 nm的球形颗粒.结论该研究成功构建了HCV Core与蜂毒素信号肽的融合蛋白并在Sf9细胞稳定表达,在细胞培养的上清中获得了VLPs.     

我国诺如病毒流行及疾病负担研究进展

诺如病毒变异快、感染剂量低、传播途径多样,具有高传染性和快速传播的特征。诺如病毒感染是导致腹泻疾病的主要病因,近年来我国诺如病毒暴发疫情整体呈现上升趋势,主要发生在小学和托幼机构,给家庭和社会造成较大的疾病负担。本文就诺如病毒的病原学特征、流行情况和疾病负担等进行综述,为疾病监测和防控提供参考。