铜绿假单胞菌重组Ef-LasR疫苗的构建、鉴定及表达

目的构建以粪肠球菌为载体的铜绿假单胞菌重组Ef-LasR疫苗,并研究其表达效率。方法采用PCR扩增铜绿假单胞菌标准株PA01的LasR基因,然后克隆至pGEX-1λT载体,构建重组质粒pGEX-LasR。将重组质粒电穿孔转化感受态粪肠球菌构建重组Ef-LasR疫苗,抽提质粒进行PCR和双酶切鉴定。重组疫苗用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 PCR扩增出717 bp的LasR基因;双酶切和PCR证实重组疫苗(rEf-LasR)构建正确;SDS-PAGE显示rEf-LasR能够高效表达分子质量单位为53 ku的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被铜绿假单胞菌感染的鼠血清识别。结论成功构建了重组Ef-LasR疫苗,其表达产物具有反应原性,为铜绿假单胞菌疫苗的进一步研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I构建、鉴定及其在大肠埃希菌中的表达效率

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,观察其在大肠埃希菌中的表达效率。方法以铜绿假单胞菌PA01株的DNA为模板,PCR扩增OprF和OprI抗原编码基因,采用基因拼接法(gene SOEing)剪切OprF和OprI得到OprF-I融合基因,酶切后与表达载体pGEX-1λT连接,构建重组质粒pGEX-OprF-I并转化入大肠埃希菌中,抽提质粒进行双酶切和PCR鉴定。重组菌用异丙硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot分析和鉴定表达产物。结果基因拼接法获得1289 bp的OprF-I融合基因;其连接产物经双酶切和PCR鉴定证实该基因成功插入pGEX-1λT中。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测显示重组菌表达预期约68×10~3的融合蛋白,该蛋白约占菌体总量的18%。Western blot检测Pa感染的鼠血清可特异性识别该融合蛋白。结论成功构建并鉴定了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,转化大肠埃希菌后高效表达OprF-I融合蛋白,该蛋白具有反应原性。     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF的构建及其表达

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株总RNA为模板,自行设计引物,采用RT-PCR方法扩增OprF抗原编码基因,经酶切、连接后定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1 016 bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切和测序鉴定证实OprF基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析表达产物分子质量单位约为61 ku,与预期结果一致,表达的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别。结论成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,该质粒在E.coliBL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb) OprF疫苗。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株提取总RNA为模板,自行设计引物,RT PCR扩增获得OprF抗原编码基因,经酶切、连接定向克隆入大肠埃希菌 双歧杆菌穿梭表达载体pGEX 1λT,构建重组质粒pGEX OprF。转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒行酶切电泳和测序验证后,电穿孔转化到Bb中,构建铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT PCR扩增出1 016bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切鉴定,切出4 947bp的载体片段和10 16bp的目的基因片段;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1 016bp的oprF基因片段。结论成功构建了铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定基础。     

结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达效率的研究

目的构建结核分枝杆菌（MTB）重组质粒pGEX-ESAT-6，分析ESAT-6抗原在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达效率。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因；将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因的高效原核表达载体pGEX-1λT，经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ESAT-6／GST融合蛋白；SDS—PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出288bp的ESAT-6基因；双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中，构建了pGEX—ESAT-6穿梭表达载体。SDS—PAGE分析重组质粒pGEX-ESAT-6表达产物的分子质量单位为35ku，表达效率为20％，Western blot检测该蛋白能被活动性结核病人血清特异识别。结论结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6在大肠埃希菌中获得了高效融合表达，表达的ESAT-6重组蛋白具有抗原特异性。     

猪带绦虫TSOL18基因的表达、纯化和兔抗血清的制备

目的 构建猪带绦虫重组质粒pGEX-TSOL18,表达纯化TSOL18重组蛋白,制备兔抗重组蛋白血清。方法 全基因合成猪带绦虫TSOL18抗原编码基因,定向克隆到pGEX-1λT表达载体,构建重组质粒pGEX-TSOL18;转化大肠埃希菌ArcticExpress(DE3), IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况;亲和层析纯化获得重组蛋白,免疫兔制备抗血清;ELISA测定抗血清的效价,Western blot鉴定抗血清的特异性。结果 全基因扩增出393 bp的TSOL18抗原编码基因,酶切和测序鉴定证实TSOL18基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达重组蛋白相对分子质量(Mr)约为41 kDa,经亲和层析后可获得纯度为75%的重组蛋白;ELISA测定抗血清的效价为1∶256 000,Western blot证实该抗血清能与重组蛋白发生特异性反应。结论 猪带绦虫TSOL18基因能在大肠埃希菌中高效表达,成功制备了高纯度的TSOL18重组蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清,为猪带绦虫的疫苗研制奠定了基础。     

多房棘球绦虫重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)表达效率的研究

目的研究多房棘球绦虫(Em)重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率。方法通过PCR扩增EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接EmⅡ/3和Em14-3-3,得到EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;将该融合基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的高效原核表达载体pGEX-1λT,经酶切鉴定后以IPTG诱导表达EmⅡ/3-Em14-3-3/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR成功扩增出2 554 bp的EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;双酶切证实EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因插入pGEX-1λT中,成功构建了pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3重组质粒;SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了能被活动性泡球蚴病鼠血清识别的EmⅡ/3-Em14-3-3/GST融合蛋白,分子质量单位119 ku。结论多房棘球绦虫EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因在大肠埃希菌中获得了高效融合表达,表达出的EmⅡ/3-Em14-3-3重组蛋白具有特异的抗原性。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。     

空肠弯曲菌AhpC蛋白的克隆表达及抗原性分析

目的构建空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶（ahpC）基因的原核表达系统,克隆表达AhpC蛋白,用Western blot以及ELISA方法检测表达蛋白的抗原性,为筛选空肠弯曲菌感染后特异性抗体检测试剂的制备奠定基础。方法用PCR方法从中国分离菌株ICDCCJ07001的染色体DNA中扩增出ahpC基因,将目的基因插入表达载体pGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E.coliBL21（DE3）,IPTG诱导重组质粒pGEX-ahpC的表达。SDS-PAGE分析表达产物,采用GST标签亲和层析柱纯化表达蛋白。应用兔免疫血清、临床感染者血清以及健康无感染者血清,利用Western blot以及ELISA的方法分析AhpC蛋白的抗原性并初步评价其在ELISA检测方法中的应用。结果 PCR扩增及双酶切鉴定证实重组质粒构建成功。重组表达蛋白经飞行质谱鉴定为空肠弯曲菌AhpC蛋白,Western blot及ELISA检测结果显示AhpC具有特异抗原性。结论成功构建了ahpC重组表达载体pGEX-4T-1/ahpC,并在大肠杆菌中高效表达。空肠弯曲菌AhpC蛋白具有抗原性,可以作为空肠弯曲菌感染后血清抗体检测的特异抗原。     

幽门螺杆菌重组Bb-hpaA-vacA疫苗的构建

目的 构建幽门螺杆菌( Hp) 重组双歧杆菌( Bb) Bb-hpaA-vacA疫苗。方法 通过 PCR 分别扩增hpaA和vacA抗原编码基因, 然后采用gene SOEing 剪接hpaA和vacA, 得到hpaA-vacA融合基因;将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT, 构建重组质粒 pGEX-hpaA-vacA,电穿孔法将该质粒导入Bb, 构建幽门螺杆菌重组hpaA-vacA 疫苗。结果 PCR成功扩增出分子量约为1500 bp的 hpaA-vacA融合基因,双酶切证实hpaA-vacA融合基因成功插入pGEX-1λT中,并成功转化入双歧杆菌,构建rBb-hpaA-vacA疫苗。结论 成功构建螺杆菌rBb-hpaA-vacA疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定了基础。     

猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及其表达

目的构建猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,分析猪带绦虫TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。方法采用PCR方法从重组质粒pGEX-TSOL18中扩增TSOL18基因,克隆入pMV361载体,构建pMV361-TSOL18穿梭质粒,经酶切和测序鉴定后电穿孔法转化入耻垢分枝杆菌,进行单克隆菌落筛选及PCR鉴定。构建的猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗经热诱导后,以SDS-PAGE分析及Western blot分析TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。结果成功扩增出TSOL18目的基因,大小约为393 bp,与预期值相符;经酶切验证,pMV361-TSOL18穿梭质粒构建成功;PCR鉴定猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗构建成功。SDS-PAGE电泳检测重组菌表达的目的蛋白TSOL18,相对分子质量为15×10~3与预期相符;Western blot分析该蛋白能被TSOL18兔抗血清识别。结论成功构建了猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,猪带绦虫TSOL18基因在耻垢分枝杆菌中成功表达,表达蛋白具有反应原性,其免疫原性有待进一步研究。     

结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗的构建、鉴定和表达及其保护力

目的构建和鉴定结核分枝杆菌(MTB)重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-ESAT-6疫苗,研究该疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因;将该基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-ESAT-6;用电穿孔法将该质粒导入Bb及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗。用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达ES-AT-6/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。65只BALB/c雌性小鼠,随机分为5组:A组(SC)、B组(IM)、C组(IN)、D组(Bb)、E组(PBS)。分别于免疫后8周用5×105CFU MTB H37Ra减毒株悬浮于10μL PBS中进行鼻腔粘膜接种感染。攻击感染后6w剖杀各组小鼠8只,计数肝、肺组织荷菌量,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE,MTT法检测特异性脾淋巴细胞增殖。结果PCR成功扩增出288bp的ESAT-6基因;双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6疫苗构建成功。免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-ESAT-6的表达产物在相对分子量(35kDa)处有明显的蛋白表达条带,表达效率为20%,且能被活动性结核病人血清特异识别。鼻腔内接种组的肝、肺组织荷菌量明显低于其他免疫组。疫苗接种组IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b明显升高,IgG3和IgE无明显变化;疫苗接种组的脾淋巴细胞明显增殖。结论成功构建了结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗,重组Bb-ESAT-6疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有一定免疫保护作用。     

日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌(Bb)(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗。方法从本室保存的BL21(DE3)(pET28α-Sj26GST-Sj32)重组菌中抽提质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,PCR扩增Sj26GST-Sj32融合基因,将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32。将此重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,抽提质粒并进行BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切,鉴定载体片段及目的基因片段长度。用电穿孔法将重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32转化至Bb,构建重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32),抽提质粒,进行PCR鉴定。结果 PCR成功扩增出长度为1 991bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入质粒pGEX-1λT中;PCR证实从重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗中扩增出1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因。结论成功构建重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗。     

铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株的构建

目的 构建铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。方法 分别以质粒pUCGM和铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板PCR扩增庆大霉素抗性基因(GM)和铜绿假单胞菌clpP基因及其3'、5'侧翼序列,将clpP基因及其3'、5'侧翼序列克隆至pMD19T载体, EcoRV切除clpP基因37 bp~453 bp片段后,引入庆大霉素抗性基因,构建重组质粒pCKR2;EcoRⅠ/HindⅢ双酶切重组质粒pCKR2,回收FclpP-GM-clpPR片段,与自杀质粒pEX18Tc连接,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pCKR3;将pCKR3质粒转化大肠埃希菌SM10,与铜绿假单胞菌PAO1双亲杂交,庆大霉素筛选得到铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。结果 经酶切鉴定同源重组载体pCKR3构建正确;PCR和DNA测序鉴定铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株构建成功。结论 本研究成功敲除了铜绿假单胞菌clpP基因,为进一步研究clpP基因的生物学功能奠定了基础。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因;将该基因克隆至原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj32并转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为42ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

刚地弓形虫P30(SAG1)重组抗原的高效表达和体外纯化(英文)

目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础。方法PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+)构建重组载体,将其转化到DH5α中。经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。大量的诱导表达产物用SNBC3S NTA Resin方法纯化并进行复性。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组表达融合蛋白量单位为30ku,与理论值相符。结论成功构建重组体,获得纯化和复性的弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

嗜肺军团菌主要外膜蛋白与鞭毛亚单位蛋白双基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的构建嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)与鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建mompS与flaA基因完全融合的重组质粒,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌904bp的mompS及1432bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSF,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-LpSF在原核系统中得到了表达。结论成功构建了嗜肺军团菌mompS-flaA双基因的原核融合表达载体,并在大肠杆菌中得到了表达,为进一步研究嗜肺军团菌核酸双价疫苗提供研究基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析

目的原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重组蛋白的免疫反应性。方法参照GenBank中Ts8B2基因序列设计引物,以合成基因为模板获得预期DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1。将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α(E.coli DH5α),PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosstea,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。尿素法提取重组蛋白,然后以脑囊虫病患者血清为一抗,Western blot分析其免疫反应性。结果 Ts8B2基因PCR扩增产物为258 bp,与理论值一致。双酶切和测序鉴定重组表达质粒构建成功,SDS-PAGE分析重组质粒转化菌表达相对分子质量为3.5×10~3,以包涵体形式存在目的蛋白,Western blot分析尿素法提取的重组蛋白能被脑囊虫患者血清识别。结论成功构建Ts8B2基因重组表达质粒表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析北大核心CSCD

目的原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重组蛋白的免疫反应性。方法参照GenBank中Ts8B2基因序列设计引物,以合成基因为模板获得预期DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1。将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α(E.coli DH5α),PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosstea,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。尿素法提取重组蛋白,然后以脑囊虫病患者血清为一抗,Western blot分析其免疫反应性。结果 Ts8B2基因PCR扩增产物为258 bp,与理论值一致。双酶切和测序鉴定重组表达质粒构建成功,SDS-PAGE分析重组质粒转化菌表达相对分子质量为3.5×10~3,以包涵体形式存在目的蛋白,Western blot分析尿素法提取的重组蛋白能被脑囊虫患者血清识别。结论成功构建Ts8B2基因重组表达质粒表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。     

金葡菌野生株SEB基因的亚克隆及其原核表达

目的亚克隆金葡菌野生株S407030肠毒素B(SEB)基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中表达,以获得重组SEB(rSEB)蛋白。方法将含有SEB基因的质粒pMD-18T/SEB双酶切获得目的片段,插入表达载体pGEX-4T-2中构建重组子pGEX-4T-2/SEB,并转化E.coliJM109感受态菌,阳性克隆以双酶切和PCR法鉴定;含重组质粒的工程菌以IPTG诱导表达rSEB蛋白;表达产物进行SDS-PAGE分析,并采用B-PER GST融合蛋白试剂盒纯化重组rSEB,West-ern blot鉴定其免疫反应性。结果重组质粒经双酶切和PCR扩增鉴定均获得约705 bp的基因片段,与预期结果相一致;诱导表达的含GST的融合重组rSEB蛋白分子质量单位约为53 ku,纯化后作SDS-PAGE电泳显示一条蛋白带,Western blot显示rSEB能够被兔抗SEB抗体识别。结论金葡菌野生株SEB在大肠埃希氏菌中得到有效表达,并获得电泳级纯度的重组rSEB,重组蛋白具有一定的免疫活性,为进一步研究其生物毒性与开发诊断试剂提供了生物材料。