多药耐药大肠埃希菌老年患者分离株抗菌制剂11种外排泵基因研究

目的了解多药耐药大肠埃希菌中外排泵基因的存在情况。方法微量稀释法检测耐药菌株的药敏结果,采用聚合酶链反应（PCR）扩增法,检测11种抗菌制剂外排泵基因：emrB、emrD、emrE、mdfA、sugE、mdtI、tehA、oqxA、qacE△1、qacEs、mr-2等11种抗菌制剂外排泵基因,扩增产物纯化后基因测序。结果大肠埃希菌对阿米卡星耐药率为60%,对复方新诺明耐药率为95%,对第三代头孢菌素耐药率为100%（均为产ESBLs菌株）,外排泵基因检出率分别为emrB 95.0%、emrD 75.0%e、mrE 50.0%、mdfA 80.0%、sugE 70.0%、mdtI 80.0%、qacE△1 80.0%、tehA 80.0%、oqxA 15.0%,qacE、smr-2基因均未检测到,最少者检出1种基因,最多1株检出9种基因。结论本组分离的大肠埃希菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素等抗菌药物呈多重耐药,可能与细菌携带多种抗菌制剂（包括灭菌剂、消毒剂、抗菌药物等）外排泵基因相关。     

乙肝病毒PreS2基因在大肠埃希菌中的表达

目的在大肠埃希菌(Escherichiacoli)中表达乙肝病毒前S2(HBVPreS2)蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2基因克隆至pMAL-C2x[融合表达载体含麦芽糖结合蛋白(maltosebindingprotein,MBP)标签蛋白]质粒中,构建pMAL-C2/S2表达载体,转化至E.coli,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式,依据其不同的表达形式采取适当的纯化方案,纯化产物经Westernblot和ELISA法检测反应原性,经Xa因子切割去除MBP标签蛋白。结果成功构建了表达载体pMAL-C2/S2,目的蛋白为PreS2-MBP,以包涵体和可溶性2种形式表达。纯化产物能与anti-HepatitisBvirusPreS2Antigen发生特异性反应。融合蛋白经Xa因子切割去除了MBP标签蛋白。结论在E.coli中成功表达了HBVPreS2蛋白,为进一步研制新型HBV预防及免疫治疗制剂打下了基础。     

大肠埃希菌中细胞分裂抑制子的潜在调控基因筛选

目的筛选大肠埃希菌中细胞分裂抑制子(Sdi A)的潜在调控基因。方法将大肠埃希菌E. coli SM10λpir野生株、E. coli SM10λpir Sdi A敲除株、E. coli SM10λpir Sdi A过表达回复株分别加入N-酰基-L-高丝氨酸内酯(AHLs)信号分子处理,记为AHLs处理组;对应三种菌株分别加入等量DMSO处理,记为非AHLs处理组。两组菌株基因转录组测序后,通过R语言edgeR软件包筛选差异表达基因。选取两组内E. coli SM10λpir Sdi A敲除株与E. coli SM10λpir野生株之间、E. coli SM10λpir Sdi A过表达回复株与E. coli SM10λpir Sdi A敲除株之间同时出现差异性表达的基因,即为有/无AHLs信号分子时Sdi A的潜在调控基因,并进行组间比对,观察有/无AHLs信号分子时Sdi A潜在调控基因的变化。结果非AHLs处理组中,E. coli SM10λpir Sdi A敲除株与E. coli SM10λpir野生株之间、E. coli SM10λpir Sdi A过表达回复株与E. col...     

迟缓爱德华菌eha基因对大肠埃希氏菌溶血基因clyA转录的调控

目的研究迟缓爱德华菌溶血活化基因eha是否能影响大肠埃希氏菌DH5α溶血素基因clyA的转录。方法将重组eha表达质粒pED101转入DH5α中,以载体质粒pACYC184为对照,观察其溶血情况。并用RT-PCR分别检测受体菌DH5α,含pED101的DH5α菌以及含载体的DH5α菌中clyA基因的转录情况。结果eha基因表达质粒的转入,可以使DH5α出现clyA基因阳性条带,且和载体无关。结论迟缓爱德华菌eha基因能正性调控DH5αclyA基因的转录,从而使其表现为溶血。     

Rv2653c在大肠埃希菌中的克隆与表达研究

目的从H37Rv标准株克隆出结核菌Rv2653c基因并进行表达与初步分析。方法根据H37Rv基因组序列合成引物,以PCR方法钓取Rv2653c基因,克隆到pGEM-T上,挑取阳性克隆进行测序,将正确编码基因克隆到pET24b载体上,在BL21大肠埃希菌菌株中以IPTG诱导表达重组蛋白。以金属螯合层析初步分离纯化重组蛋白,采用western blot方法对重组抗原进行抗原性初步分析。结果首先获得了重组的Rv2653c编码的蛋白,表达产率不低于20%,初步纯化纯度约90%,以人血清进行的western blot分析发现,Rv2653c重组蛋白有较好的抗原性。结论获得了Rv2653c重组蛋白为进一步寻探讨其功能及应用价值奠定基础。     

外排泵抑制剂羰酰氰间氯苯腙对多重耐药大肠埃希菌的耐药性影响

目的 探讨外排泵抑制剂羰酰氰间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)对多重耐药大肠埃希菌的耐药性影响.方法 采用纸片扩散法(K-B法)进行71株大肠埃希菌对6种抗菌药物的药物敏感性检测,用PCR技术检测受试菌株携带的acrA和acrB基因,用常量肉汤稀释法测定2种氟喹诺酮类抗菌药物对大肠埃希菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations,MICs),并对比加入CCCP前后的MICs值.结果 71株大肠埃希菌对3类6种抗菌药物耐药,其中对环丙沙星耐药率最高(73.24％),对氨曲南耐药率最低(30.99％),耐药模式以多重耐药为主(52.11％);外排泵基因acrA和acrB在多重耐药菌株中阳性率高达91.89％和81.03％;加入CCCP前后多重耐药菌株和敏感菌株的MICs值变化差异有统计学意义.结论 主动外排泵抑制剂CCCP能够降低氟喹诺酮类抗菌药物对多重耐药大肠埃希菌的MICs.     

致肾盂肾炎大肠埃希菌毒力的研究

目的了解致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)毒力因子的致病性,为研究UPEC的致病机制奠定基础。方法用PCR方法扩增41株UPEC菌株和40株健康人粪便分离的大肠埃希菌6种毒力因子基因。取24只雌性BALB/c小鼠,随机分为A、B、C 3组,A、B组分别用UPEC J96和E.coli K-12p678-54(无菌毛株)菌液经尿道逆行感染,C组为空白对照,经尿道注入无菌PBS。感染5d后比较3组小鼠尿液和肾脏菌落计数(RCD)以及肾脏组织病理学检查结果。结果PCR检测UPEC和健康人粪便分离大肠埃希菌6种毒力因子基因papC、fimH、hly、cnf1、aer和R049的检出率分别为100%和2.50%,53.66%和5.00%,63.41%和10.00%,34.15%和5.00%,60.98%和35.00%,40.00%和7.50%,差异均有统计学意义(P均<0.01)。A组(UPEC J96感染)小鼠尿液和肾组织培养均有细菌生长(细菌鉴定为papC阳性),菌落计数RCD值绝大多数>3+;B组(E.coli K-12p678-54感染)小鼠中有1只尿液和肾组织细菌培养阳性(细菌鉴定papC阴性),菌落计数为1+。C组(空白对照)小鼠尿道与肾脏均无细菌生长。A组与B组小鼠尿道和肾脏RCD均值(x±s)分别为4.25±0.707、5.75±1.669和0.125±0.354、0.125±0.354,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。病理检查A组有4只小鼠肾组织出现较为明显的炎症变化,B组肾组织未发现明显病变,C组肾组织结构清晰,无病理变化。结论 6种毒力因子与UPEC致病性相关,建立的UPEC感染小鼠模型对UPEC致病机制的研究具有重要意义。     

大肠埃希菌药敏分析及qnr基因分布情况研究

目的了解衡水地区大肠埃希菌的药敏情况以及qnr基因的存在情况。方法采用肉汤稀释法测15种抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）并计算其MIC50和MIC90;采用聚合酶链反应（PCR）检测qnr基因。结果15种抗菌药物中仅亚胺培南、哌拉西林／他唑巴坦和头孢哌酮／舒巴坦对大肠埃希菌敏感,245例大肠埃希菌中检出5株存在qnrB基因,占2．O％,1株存在qnrS基因,占0．4％。结论我院检出的大肠埃希菌存在多重耐药。少数菌株中,存在qnrB和qnrS基因,临床应加强监测。     

日本血吸虫组织蛋白酶L1基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在原核表达体系大肠埃希菌中进行日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因表达。　方法　通过PCR从质粒pcDNA3-SjCL1中扩增得到SjCL1基因 ,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T -1中 ,构建重组质粒pGEX-SjCL1,将该重组质粒转化大肠埃希菌JM109,转化子经异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷诱导表达 ,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析SjCL1基因表达产物。　结果　获得长约 1kb的PCR片段 ,构建了pGEX-SjCL1质粒。SDS-PAGE和Westernblotting检测表达产物 ,相对分子质量为 62 0 0 0。　结论　SjCL1基因在大肠埃希菌中以融合形式得到表达。     

大肠埃希菌菌毛的电镜观察

目的通过电子显微镜观察大肠埃希菌菌毛结构,了解菌毛粘附与致病及耐药的关系。方法以临床细菌性腹泻患儿新分离的大肠埃希菌为材料,制备扫描电镜及透射电镜标本,对照菌分离自健康同龄儿童粪便。结果新分离的腹泻患儿大肠埃希菌普通菌毛遍布菌体,性菌毛呈分枝状,可见性菌毛多重接合。结论分离自腹泻患儿的大肠埃希菌菌毛普通菌毛多,性菌毛为分枝状,可见多向接合。     

聚集性大肠埃希氏菌与儿童腹泻

Huppert和他的同事将798名16岁以下的腹泻儿童送到德国维尔茨堡的两所医院住院治疗。其目的是为了评估肠内聚集性大肠埃希氏菌(EAggEC)引起儿童腹泻的作用。常规粪便培养表明只有169名为细菌性病原体感染,占21.2％。用PCR技术对粪便培养出的菌落进行     

融合基因CPA—LTB在大肠埃希菌中表达条件的优化

目的在构建含有CPA—LTB融合基因的重组菌株基础上,对其表达条件进行优化,以获得高效表达的CPA—LTB融合蛋白。方法采用限制性内切酶酶切鉴定含CPA—LTB融合基因的重组质粒pCPA—LTB,然后采用均匀设计法对影响目的蛋白表达的因素和水平进行优化：设计实验方案,分别以不同浓度的IPTG和乳糖为诱导剂诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE检测不同条件下融合蛋白的表达情况。结果双酶切鉴定重组质粒含有CPA-LTB融合基因（1700bp）,且阅读框架正确。以IPTG为诱导剂在pH7．5、诱导温度31℃、转化菌菌液A-500值为1．2、IPTG终浓度0．4mmol／L诱导6h,目的蛋白表达量最大,占菌体总蛋白相对含量的54％;以乳糖为诱导剂在pH6．5、温度34℃、转化菌菌液A-500值为0．6、乳糖终浓度0．1mmol／L诱导6h,融合蛋白的表达量最大,占菌体总蛋白相对含量的61％。优化前后两种诱导剂诱导表达的蛋白量分别增加63％和42％。结论CPA—LTB融合基因表达质粒转化大肠埃希菌在优化的表达条件下高效表达目的蛋白,为研制α毒素基因工程亚单位疫苗奠定了基础。     

结核抗原ESAT-6基因的克隆及在大肠埃希菌中的表达

目的：将结核分支杆菌ESAT抗原编码区基因克隆，并使其在大肠埃希菌中表达。方法：培养并抽提结核分支杆菌基因组，采用聚合酶链反应（PCR）扩增编码ESAT的全长cDNA，并插入到原核表达载体pGEX5T中，构建pGEX5T-ESAT重组质粒，IPTG诱导使该基因在k802菌中表达，并免疫印迹（Western blot)方法确证表达蛋白的特异性。结果：PCR扩增获得了单一的条带，大小约0.3kb；全自动测序与Genbank中登录的序列完全相同。获得了pGEX5T-ESAT重组子并在k802菌中表达，该蛋白可被结核病患者血清特异地识别。结论：扩增和克隆结核杆菌ESAT抗原的全长cDNA并在大肠埃希菌中获得表达，为进一步研究其在结核病诊断和防治中的应用打下了基础。     

泌尿系患者感染大肠埃希菌的耐药基因分布特征

目的了解泌尿系感染中大肠埃希菌的耐药情况,以及产ESBLs大肠埃希菌携带β-内酰胺酶基因类型,为泌尿系感染大肠埃希菌防治提供依据。方法收集2017年1月-2018年6月大肠埃希菌致泌尿系感染病例。采用K-B纸片法筛选和确认产ESBLs大肠埃希菌,并测定大肠埃希菌对临床常见14种抗生素耐药情况。采用碱裂解法提取大肠埃希菌DNA,并通过PCR检测产ESBLs株β-内酰胺酶基因类型。结果共分离出197株大肠埃希菌,其中产ESBLs大肠埃希菌116株,占58.88%。产ESBLs大肠埃希菌对头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢西丁、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、诺氟沙星、环丙沙星、美罗培南、哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦等抗生素耐药情况为14种抗生素耐药情况为:116株(100.00%)、116株(100.00%)、116株(100.00%)、22株(18.97%)、72株(62.07%)、61株(52.59%)、15株(12.93%)、69株(59.48%)、57株(49.14%)、1株(0.86%)、116株(100.00%)、81株(69.83%)、19株(16.38%)和8株(6.90%)。非产ESBLs大肠埃希菌耐药情况为:6株(7.41%)、0株(0.00%)、3株(3.70%)、4株(4.94%)、31株(38.27%)、27株(33.33%)、0(0%)、35株(43.21%)、27株(33.33%)、0(0%)、43株(53.09%)、22株(27.16%)、4株(4.94%)和3株(3.70%)。116株大肠埃希菌中β-内酰胺酶基因携带blaTEM、blaSHV、blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-8和blaCTX-M-9组基因情况分别为:21株(18.10%),6株(5.17%),9株(7.76%),3株(2.59%),0株(0%),61株(52.59%),2株(1.72%),2株(1.72%)和89株(76.72%)。其中单一基因型65株,占56.03%;31株检测到2种基因,占26.72%;14株同时检测到3种基因,占12.07%;6株同时检测到3种以上基因,占5.17%。讨论四川泸州地区产ESBLs大肠埃希菌中blaCTX-M是主要流行型别。他唑巴坦能够有效的抑制β-内酰胺酶,能够使哌拉西林更好发挥其抗菌活性。     

大肠埃希菌CRISPRs间隔序列的来源研究

目的研究大肠埃希菌全基因组中规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)的间隔序列分布及来源规律。方法通过BLAST、CRISPRs finder、ClustalX和CRISPRTarget分析CRISPR/Cas、间隔序列及其来源。结果 203株大肠埃希菌中74.4%含有I-E CRISPR/Cas,9.4%含有I-F CRISPR/Cas,17.2%存在CRISPR3-4;CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3和CRISPR4的间隔序列数目范围分别为1-25、1-27、4-7和2-22;其独特间隔序列数目分别为339、346、57和66。CRISPRTarget分析I-E和I-F CRISPR/Cas的间隔序列分别匹配816条质粒和293条噬菌体,2 428条质粒和139条噬菌体,差异有统计学意义(χ~2=319.30,P0.01)。结论大肠埃希菌中CRISPR/Cas分布广泛,I-E和I-F CRISPR/Cas可能发挥不同的免疫功能。     

江苏省肠出血性大肠埃希菌O157的基因PCR-RFLP分型研究

目的对历年从江苏省不同地区分离的肠出血性大肠埃希菌O157（以下简称：O157）进行分型分析。方法采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法对108株O157分子分型,比较不同地区、不同年份菌型差异。结果根据EcoRV限制性酶切图谱可将菌株分成JS01-JS10十个不同的型别。主要菌型JS01占64.9%,JS02型与JS01型菌株酶切图谱相似度很高,JS03和JS04型菌株数目较少（12株）,但近一半属于人源菌株。从时间方面看,1999年分离的菌型最多;从地区方面看,铜山县分离到的菌株型别最为多样化。结论不同菌型之间的致病性存在差异,菌株与地理来源的关系密切。PCR-RFLP方法操作简便、重复性好,为O157的流行病学研究提供了一条全新途径。     

肠出血性大肠埃希菌感染的诊治

大肠埃希菌(E.coli)是人类和动物肠道内的正常菌群之一.肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic E.Coli,EHEC)是大肠埃希菌的一个亚型,分为157、26、111血清型,主要致病菌株为O157∶H7,可引起严重的腹泻、血便并出现溶血尿毒综合征(haemolytic uraemic syndrome,HUS),是近年来发现的严重危害人类健康的肠道传染病,因能引起人类的出血性肠炎而得名.     

乙型脑炎病毒E蛋白基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达乙型脑炎病毒E蛋白。方法　反转录聚合酶链反应 (PCR)扩增乙型脑炎病毒 (JEV)E蛋白基因 ,克隆入原核表达载体pET 2 8a,转化大肠埃希菌BL2 1(ED3)。经异丙基巯基半乳糖 (IPTG)诱导表达后 ,十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白免疫印迹分析表达产物。结果　本室所保存毒株的E蛋白与已发表的序列比较 ,有 5个核苷酸改变 ,可分别导致氨基酸替代。所表达的E蛋白的相对分子质量约为 5 0 0 0 0 ,表达量约占菌体总蛋白的 35 %。结论　在大肠埃希菌中成功地表达了JEVE蛋白 ,为制备JE实验室诊断抗原和分析E蛋白基因结构与功能的关系打下了基础     

融合基因CPA-LTB在大肠埃希菌中表达条件的优化北大核心CSCD

目的在构建含有CPA-LTB融合基因的重组菌株基础上,对其表达条件进行优化,以获得高效表达的CPALTB融合蛋白。方法采用限制性内切酶酶切鉴定含CPA-LTB融合基因的重组质粒pCPA-LTB,然后采用均匀设计法对影响目的蛋白表达的因素和水平进行优化:设计实验方案,分别以不同浓度的IPTG和乳糖为诱导剂诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE检测不同条件下融合蛋白的表达情况。结果双酶切鉴定重组质粒含有CPA-LTB融合基因(1700bp),且阅读框架正确。以IPTG为诱导剂在pH 7.5、诱导温度31℃、转化菌菌液A600值为1.2、IPTG终浓度0.4mmol/L诱导6h,目的蛋白表达量最大,占菌体总蛋白相对含量的54%;以乳糖为诱导剂在pH 6.5、温度34℃、转化菌菌液A600值为0.6、乳糖终浓度0.1mmol/L诱导6h,融合蛋白的表达量最大,占菌体总蛋白相对含量的61%。优化前后两种诱导剂诱导表达的蛋白量分别增加63%和42%。结论 CPA-LTB融合基因表达质粒转化大肠埃希菌在优化的表达条件下高效表达目的蛋白,为研制α毒素基因工程亚单位疫苗奠定了基础。