实时荧光定量PCR检测GI型诺瓦克样病毒方法的建立

目的建立临床粪便中GI型诺瓦克样病毒的实时荧光定量PCR检测方法。方法针对诺瓦克样病毒GI型保守序列,用序列比对软件设计特异性引物与探针,建立诺瓦克样病毒实时荧光定量PCR检测方法。并用常规RT-PCR和本文建立的实时荧光定量PCR对137份临床腹泻标本进行检测。结果该方法对诺瓦克样病毒检测准确,重复性好,标准曲线的线性范围为102～107拷贝,相关系数为0.9991。并且对临床标本的检出率显著高于普通RT-PCR。结论本研究建立的实时荧光定量PCR方法可用于检测临床腹泻粪便标本中的GI型诺瓦克样病毒,从而有效预防和控制该病毒的传染。     

实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用

目的建立快速检测手足口病肠道病毒的实时荧光定量PCR法,并作出应用分析。方法采用卫生部《手足口病预防控制指南》(2008年版)推荐的RT-PCR法,对丽水市2008年4～5月间发生的172例临床诊断手足口病患者的324份标本进行人肠道病毒、柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒EV71型特异性核酸的检测,同时采用实时荧光定量PCR法进行平行检测,比较两者的实验结果,分析实时荧光定量PCR方法的特异性和灵敏度。结果实时荧光定量PCR检测324份标本,肠道病毒通用核酸阳性70份,柯萨奇A16核酸阳性22份,肠道EV71病毒核酸阳性15份,与RT-PCR结果一致,符合率100%。结论实时荧光定量PCR法具有特异性强、灵敏度高等优点,是一种理想的手足口病肠道病毒的检测方法。     

RT-PCR和ELISA在检测小儿病毒性腹泻中的应用比较

[目的]RT-PCR和ELISA在检测小儿病毒性腹泻中的效能分析。[方法]收集我院2018年6月～2019年1月在门诊及住院的1个月～5岁400例儿童的腹泻粪便标本。利用RT-PCR和ELISA方法检测标本中的RV、NV、AstV和AdV病毒性病原。具体操作方法,严格按照试剂盒说明书进行操作。[结果]采用RT-PCR检出至少有132份标本含有至少1种病毒核酸:116份单一病毒核酸呈现阳性,14份双重病毒核酸呈现阳性,2份三重以上病毒核酸阳性。核酸阳性的检出率为36.7%。采用ELISA的方法检出98份标本含有至少1种病毒核酸:86份单一病毒核酸阳性,12份双重病毒核酸阳性。核酸阳性的检出率为27.2%。2种检测方法检测RV、NV、AstV和AdV病毒性病原差异有统计学意义。[结论]RT-PCR和ELISA 2种检测方法的检测结果具有很好的一致性。RT-PCR和ELISA此2种检测方法均以RV、NV的阳性检出率较高,RT-PCR法除对EAdV阳性检出率低于ELISA外,对其他3种病毒的检出率均高于ELISA。     

厦门地区病毒性腹泻诺如病毒感染状况

目的了解本地区病毒性腹泻患者诺如病毒感染情况,为进一步探索诺如病毒流行规律和防控对策提供依据。方法收集2007年4月至2008年7月3个监测哨点医院病毒性腹泻患者粪便标本共323份,应用ELISA方法检测粪便标本中病毒抗原,实时荧光逆转录聚合酶链反应法(Real-Time RT-PCR)分组别检测病毒核酸,部分病毒核酸阳性的标本扩增RdRp基因片段后测序验证病毒组别。结果323例患者粪便标本中,ELISA检测抗原阳性68例,阳性率21.05%;Real-Time RT-PCR检测核酸阳性107例,阳性率33.13%;诺如病毒检出率为38.08%。诺如病毒GGⅡ组占74.77%,少数为GGⅠ组(1.87%),尚有25份(23.36%)未定型。结论厦门地区存在诺如病毒流行,以GGⅡ组毒株流行为主,而且是病毒性腹泻的主要病原。     

毛细管电泳片段分析法、荧光定量PCR法在ALRTI患儿咽拭子标本病原体诊断中的应用对比观察

目的 毛细管电泳片段分析法、荧光定量PCR法在急性下呼吸道感染患儿咽拭子标本病原体诊断中的应用。方法 急性呼吸道感染患儿65例（65份咽拭子标本）,分别采用毛细管电泳片段分析法、荧光定量PCR法检测患儿咽拭子病原体,比较两种方法病原体检出率,并分析两种检测方法与金标准（Sanger测序法）检测结果的一致性。结果 毛细管电泳片段分析法病原体检出率为52.3%（呼吸道合胞病毒21份、副流感病毒4份、衣原体病毒2份、腺病毒2份、鼻病毒2份、偏肺病毒3份、博卡病毒1份,其中1份为合胞病毒与鼻病毒混合感染）,荧光定量PCR法病原体检出率为45.0%（呼吸道合胞病毒20份、副流感病毒3份、衣原体病毒2份、腺病毒1份、鼻病毒1份）,两种方法病原体检出率比较,P>0.05。毛细管电泳片段分析法与Sanger测序法检测结果阳性一致率为100.0%,阴性一致率为100.0%,准确率为100.0%;荧光定量PCR法与Sanger测序法检测结果阳性一致率为86.2%,阴性一致率为93.5%,准确率为90.0%。结论 毛细管电泳片段分析法与荧光定量PCR方法病原体检出率无差异,但毛细管电泳片段分析法能检测...     

PCR-反向点杂交基因分型与实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒的研究

目的评价PCR-反向点杂交基因分型与实时荧光定量PCR在检测人乳头瘤病毒(HPV)的意义。方法同时采用PCR-反向点杂交基因分型和实时荧光定量PCR对121例女性宫颈脱离细胞标本进行HPV检测。其中PCR-反向点杂交基因分型能检测23种HPV亚型,实时荧光定量PCR定量检测常见的13种高危HPV亚型。结果 PCR-反向点杂交基因分型检测HPV的阳性率为28.10%(34/121),实时荧光定量PCR检测HPV的阳性率为16.53%(20/121),差异有统计学意义(P<0.05);二者检测的符合率为93.39%(113/121)。结论 PCR-反向杂交基因分型适用于HPV感染的筛查,而实时荧光定量PCR适用于HPV感染相关疾病的疗效与预后的判断。PCR-反向杂交基因分型与实时荧光定量PCR联合检测可提高HPV检测的特异性和敏感度,对于生殖道HPV感染以及子宫颈癌的早期发现、预防和治疗具有重要意义。     

实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用

目的探讨实时荧光逆转录聚合酶链式反应(rRT-PCR)在流感病毒检测中的应用,并比较与常规细胞培养方法的差异,以确定两种检测方法各自更适合的应用领域。方法收集烟台市两所国家级哨点医院就诊的流感样病例(ILI)咽拭子标本,应用实时荧光RT-PCR检测流感病毒核酸,阳性标本用狗肾传代细胞(MDCK)培养、分离流感病毒,比较两种检测方法的灵敏度及相关性差异。结果在617份标本中,实时荧光RT-PCR检测阳性152份,阳性率为24.64%;MDCK细胞培养法分离流感病毒79株,阳性率为12.80%。两者的阳性率差异有统计学意义(χ2=28.38,P<0.01)。结论实时荧光RT-PCR和细胞培养方法检测流感病毒具有一致的特异性。实时荧光RT-PCR可作为一种快速有效的流感病毒核酸检测法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断;细胞培养法作为流感病原学监测的基础,用于核实暴发疫情的实验室诊断,对病毒进行抗原性和基因特性分析。     

3种方法对发热伴血小板减少综合征检测结果比较

目的 采用实时荧光PCR法、酶联免疫吸附法及细胞培养分离病毒株的方法,对2013年临床疑似发热伴血小板减少综合征患者急性期血进行检测比较,寻求快速、准确的鉴定新布尼亚病毒感染的方法。方法 对180例临床疑似病例的急性期血液首先采用实时荧光PCR法检测,筛选出新布尼亚病毒核酸阳性的样本,同时将阳性样本采用酶联免疫吸附的方法检测抗体及采用VERO-E6细胞培养的方法分离病毒株。结果 180份样本经实时荧光PCR法检测,阳性率为42.78%(77/180 Ct值≤35曲线形态与阳性对照一致呈S型的),ELISA方法检测抗体阳性率为44.16%(34/77),将核酸检测阳性的77份样本全部感染VERO-E6细胞获得病毒株32株,阳性率为38.55%(32/77)。结论 实时荧光PCR法更适合于新布尼亚病毒感染者早期实验室快速诊断,发病在1w左右的病例不适合用ELISA的方法做确证实验。细胞培养分离病毒虽然是金标准,但耗时、费力,对早期诊断意义不大,但适于研究或疫苗研发。     

定量PCR检测HCMV-DNA结合细胞培养分离病毒法诊断小儿HCMV感染

目的探讨实时荧光定量PCR检测HCMV-DNA结合细胞培养分离病毒,对诊断小儿HCMV感染的价值。方法使用实时荧光定量PCR法检测尿液HCMV-DNA与细胞培养分离尿液HCMV二种方法检测。结果（1）该实时荧光定量PCR检测HCMV-DNA体系,与相关的三种病毒（I型单纯疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒）无交叉反应,20例正常幼儿皆为阴性。（2）40例临床患儿实时荧光定量PCR检测尿液HCMV-DNA,阳性10例。其中,唇腭裂组阳性6例（6/11）,肺炎组阳性4例（4/29）,两组检出结果比较,差异有显著性（χ2=5.06,P〈0.05）,唇腭裂组阳性检出高于肺炎组。（3）40例临床患儿细胞培养法HCMV分离检测,阳性8例,其中,唇腭裂组阳性4例（4/11）,肺炎组阳性为4例（4/29）,两组检出结果比较,差异无显著性（χ2=1.21,P〉0.05）。（4）40例临床患儿,实时荧光定量PCR检测尿液HCMV-DNA与细胞培养分离病毒结果符合度比较,差异无显著性（χ2=3.33,P〉0.05）。二种方法阳性检出比较,差异无显著性（χ2=0.38,P〉0.05）。结论实时荧光定量PCR检测尿液HCMV-DNA,与细胞培养法分离病毒联合应用可提高HCMV感染诊断阳性率。     

90例病毒性胃肠炎患者粪便中诺如病毒检出情况分析

目的 了解病毒性胃肠炎患者中诺如病毒感染情况. 方法 收集北京市2007年2月5~17日共计90例病毒性胃肠炎患者的粪便标本,应用逆转录聚合酶链反应法 (RT-PCR) 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测粪便中诺如病毒核酸或抗原,并对RT-PCR阳性标本的PCR产物进行克隆测序. 结果 90例病毒性胃肠炎患者的粪便标本中,35例 (38.89%) RT-PCR为诺如病毒核酸阳性,序列分析结果显示,诺如病毒GⅡ型34例 (97.14%),GⅠ型1例 (2.86%);90例中,39例 (43.33%) 为ELISA检测诺如病毒抗原阳性.以RT-PCR检测结果作为金标准进行比较,ELISA的灵敏度和特异度分别为97.14% (34/35) 和90.91% (50/55) . 结论 诺如病毒是病毒性胃肠炎的主要病原,以GⅡ型流行为主.ELISA快速、简便,其灵敏度和特异度较高,可作为诺如病毒感染的初筛试验.     

实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分析

目的利用实时荧光定量PCR技术快速检测异烟肼耐药结核分枝杆菌。方法收集到医院就诊的结核病疑似患者痰液样本,提取痰液样本的总DNA,利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对结核分枝杆菌感染进行快速筛查,并与传统药敏试验进行比较,对两者的灵敏度、特异性、一致性进行比较分析。结果检测346例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出257例异烟肼敏感标本,101例异烟肼耐药标本;实时荧光定量PCR法共检测出异烟肼敏感和耐药标本225例98例,灵敏度为86.64%,特异性为93.92%,一致率为93.12%。结论跟传统药物敏感性实验相比,实时荧光定量PCR法检测速度快速、特异性强、灵敏度较高,可用于结核分枝杆菌耐异烟肼突变的快速检测,适于耐多药结核病的快速筛查。     

不同实时荧光定量PCR仪对外周血中EB病毒DNA检测结果的影响

目的:应用同一种商品化EB病毒核酸定量检测试剂盒在2款实时荧光定量PCR仪同时检测外周血标本中EB病毒载量,探讨不同类型的实时荧光PCR仪对EBV DNA定性和定量检测结果的影响.方法:提取179例外周血标本(包括102例全血和77例血浆)的DNA后,应用EB病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)分别在2款实时荧...     

细菌核酸提取方法对荧光定量PCR检测差异分析

目的 观察和分析常见食源性病原菌及粪便中病原菌DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果的影响。方法 以弯曲菌、副溶血弧菌和沙门菌为模型菌株,分别采用水煮法、细胞裂解法、试剂盒法(过滤法和磁珠法)提取病原菌DNA并进行荧光定量PCR检测并对试验结果作差异比较分析;应用细胞裂解法和过滤法分别提取24份随机抽样的粪便标本DNA,针对细菌16SrDNA特异序列进行荧光定量PCR检测,比较2种DNA提取方法对于病原菌检测结果的差异性。结果 在不同菌种、不同浓度的条件下,细胞裂解法提取细菌纯培养物DNA的Ct值均低于其他三种方法(P0.05),水煮法、过滤法、磁珠法的Ct值之间的比较结果呈现多样性。细胞裂解法提取粪便标本的病原DNA为模板进行细菌16S rDNA特异序列的荧光定量PCR检测结果阳性18份,阴性6份,试剂盒过滤法提取24份粪便标本检测结果皆为阳性。结论 在对纯培养的3种食源性病原菌进行荧光定量PCR鉴定时,为节省时间和成本可应用细胞裂解法或水煮法提取模板DNA,与2种商业试剂盒(过滤法和磁珠法)相比效果较好;对粪便标本病原菌进行荧光定量PCR检测时,试剂盒提取粪便标本病原DNA的扩增效果优于细胞裂解法。     

运用实时荧光定量RT-PCR和ELISA方法定量检测SHIV的对比分析

目的建立一种实时、灵敏、特异的针对人/猴免疫缺陷病毒(SHIV)的RNA载量检测方法,通过与酶联免疫吸附试验(ELISA)进行比较,成为监测SHIV病毒体外复制过程的常用方法。方法体外转录制备RNA标准品,利用TaqMan EZ逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒的反应体系和针对SHIV gag保守区91个碱基的Taq-Man探针与引物,建立一步法实时荧光定量RT-PCR。三种SHIV感染性分子克隆体外转染293T细胞,在不同的时间点采样,通过实时荧光定量RT-PCR和ELISA两种方法监测SHIV病毒复制过程。结果两种方法监测的病毒复制过程基本一致,转染后2~48小时病毒复制出现明显的对数生长期,之后进入平台期,p24浓度大约103pg/ml,而RNA载量大约在108拷贝/ml。两者具有很好的相关性(r2=0.834;P<0.001)。实时荧光定量RT-PCR灵敏度更高,检测范围更广,费用更低。结论所建立的一步法检测SHIV病毒载量的实时荧光定量RT-PCR方法,可以作为监测SHIV体外扩增的常用方法。     

丽江市古城区首次证实一起鼠间鼠疫疫情北大核心CSCD

目的对丽江市古城区的一起鼠间鼠疫进行判定。方法对1份干燥自毙大绒鼠标本进行鼠疫反相间接血凝抑制试验(RIHA)、聚合酶链式反应(PCR)及实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测。结果该标本经免疫学检测、PCR及RT-PCR检测均为阳性。结论确认丽江市古城区鼠间鼠疫疫情。     

2011年北京地区婴幼儿病毒性腹泻病原学研究

目的了解北京地区婴幼儿病毒性腹泻的病原学特点。方法采集2011年1月-12月5岁以下腹泻患儿的粪便标本并填写个案调查表,用ELISA试剂盒检测A组轮状病毒,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测人杯状病毒和星状病毒,采用PCR检测腺病毒。结果 604例粪便标本中,A组轮状病毒检出率15.89%,人杯状病毒检出率18.71%,星状病毒检出率2.98%,腺病毒检出率4.80%,病毒混合感染27例。11月份轮状病毒检出率最高,10月份人杯状病毒检出率最高。结论 A组轮状病毒和人杯状病毒为北京地区秋冬季婴幼儿腹泻的主要病原。     

实时荧光定量PCR在病毒检测中的应用

实时荧光定量PCR是通过荧光信号监测目的基因扩增数量的定量PCR技术,具有灵敏度高,检测速度快等优点。实时荧光定量PCR已被应用于乙肝病毒、登革热病毒、流感病毒、水疱口炎病毒等病毒的快速检测,在病毒快速分型、相似病毒的鉴别检测、耐药病毒突变体检测等临床和公共卫生领域得到广泛应用。狂犬病是危害严重的人兽共患病,病死率几乎为100%。实时荧光定量PCR技术已被应用于狂犬病病毒和狂犬病相关病毒的核酸检测,具有与金标准DFA相当的灵敏度和特异度,同时克服了金标准DFA的某些局限性,如检测速度更快,无需提取脑组织,对唾液、脑脊液等低病毒载量样本具有较好的检出效果,具有成为人间狂犬病诊断技术的潜力。灵敏度是传统RT-PCR的200倍以上,交叉污染的风险更低。实时荧光定量PCR也应用于欧洲蝙蝠病毒等狂犬病相关病毒的检测,可建立多重实时荧光定量PCR在单一检测体系对多种病毒进行快速鉴别,对于预防病毒性传染病具有重要的公共卫生意义。本文详细介绍了该技术的相关原理和方法,以及在病毒检测方面的国内外研究进展。     

实时荧光定量RT-PCR在脊髓灰质炎病毒型内鉴定中的应用

目的应用实时荧光定量RT-PCR(rRT-PCR)对脊髓灰质炎病毒(PV)进行型内鉴定(ITD)及基因型鉴定。方法以PV衣壳蛋白(Capsid Protein)VP1编码区基因序列为目标,设计并合成引物和Taqman探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测体系,对WHO发放的PV株和实验室分离的PV株进行型内鉴定(ITD)和疫苗衍生PV株(VDPV)筛选。结果 10份WHO考核标本经ITD试验结果和ITD筛查后的5份苗类似株(SL)VDPV实验结果,经WHO验证完全符合;青海省脊髓灰质炎(下称脊灰)实验室2017年在健康儿童中分离获得2株PV,经ITD和VDPV,结果为SL1。毒株经国家脊灰实验室验证,与上报结果完全符合。结论 rRT-PCR方法操作简便、快速,特异敏感,适用于PV的型内鉴定及其感染的实验室诊断。     

鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立检测鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）的实时荧光定量RT-PCR方法。方法根据LCMV核蛋白编码基因序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应体系和条件,建立LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,然后进行灵敏度、特异性和重复性试验,并对79份宁波口岸捕获的鼠样品进行检测。结果建立实时荧光定量RT-PCR方法对鼠肺总RNA检测的灵敏度为20pg,是常规PCR方法的100倍;试验的重复性良好,CV值为0.85%;试验的特异性为100%。用该方法检测79份鼠样品有3份LCMV阳性,与常规RT-PCR结果一致。结论成功建立了鼠LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,对于监测和防控鼠传LCM有重要意义。