抗Ⅲ型胶原单克隆抗体对体外培养关节软骨细胞代谢的影响

采用关节软骨细胞培养和同位素标记的方法观察抗Ⅲ型胶原单克隆抗体对软骨细胞代谢的影响,结果示抗Ⅲ型胶原单克隆抗体对家兔关节软骨细胞DNA和胶原合成都有明显的抑制作用,认为抗Ⅲ型胶原抗体可能协同抗Ⅱ型胶原抗体参与关节软骨损伤的自家免疫反应。     

运用双重免疫组织化学方法研究骨性关节炎关节软骨细胞的胶原表型

目的 :研究原发性骨性关节炎 (osteoarthritis,OA)关节软骨中软骨细胞的胶原表型。方法 :运用抗Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅹ型胶原单克隆抗体 ,对OA关节软骨标本分别进行Ⅹ型和Ⅱ型胶原以及Ⅹ型和Ⅲ型胶原双重免疫组织化学染色。结果 :在原发性OA关节软骨的深层和钙化层软骨细胞中 ,存在Ⅹ型和Ⅱ型胶原以及Ⅹ型和Ⅲ型胶原的共同分布现象。同一个簇聚软骨细胞团中不同细胞的胶原表型也各不相同。结论 :原发性OA关节软骨细胞在疾病环境中发生进一步分化 ,在不同的分化阶段细胞的胶原表型不同 ,其中早期肥大软骨细胞能够同时合成Ⅹ型和Ⅱ型胶原以及Ⅹ型和Ⅲ型胶原。     

雌激素对软骨细胞胶原表型表达的影响

目的 :观察雌激素对体外培养兔关节软骨细胞胶原表型表达的影响。方法 :体外培养雌兔关节软骨细胞 ,随机分为A、B两组 ,A组中加入 1 7β -雌二醇 0mol/L、1 0 - 6 mol/L、1 0 - 7mol/L、1 0 - 8mol/L、1 0 - 9mol/L、1 0 - 10 mol/L、1 0 - 11mol/L、1 0 - 12 mol/L干预 72小时 ;B组先用 1 0ng/mlIL - 1 β干预 2 4小时 ,随后分别加入 0mol/L、1 0 - 6 mol/L～ 1 0 - 12 mol/L 1 7β -雌二醇作用 72小时。采用RT-PCR方法观察软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达。结果 :1 0 - 6 mol/L雌二醇或单用IL - 1 β均抑制正常软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达 ,低浓度雌二醇 (1 0 - 11、1 0 - 12 mol/L)能够对抗IL - 1 β的抑制作用 ;所有软骨细胞均未表达Ⅲ型胶原mRNA ;几乎所有浓度雌二醇 (1 0 - 12 mol/L除外 )均诱导软骨细胞表达Ⅰ型胶原。结论 :雌激素对关节软骨细胞胶原表型表达的调控作用随其浓度变化而不同。对变性软骨细胞而言 ,低于生理浓度的雌激素 (1 0 - 12 mol/L)对维持其胶原表型最适宜。     

硅橡胶植入对关节软骨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原合成的影响

目的观察植入硅橡胶对兔关节软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原合成的影响.方法18只成年新西兰大白兔,每只动物右膝为实验组,在膝关节滑车处植入硅橡胶;左膝为对照组,膝关节滑车处造成关节软骨缺损后不植入硅橡胶.分别于术后4周、24周和48周取材,采用原位杂交的方法观察关节软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达,同时运用免疫组织化学的方法观察关节软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白的合成.结果实验组中关节软骨可见Ⅱ型前胶原mRNA和胶原蛋白的稳定表达.Ⅰ型前胶原mRNA从术后4周起即有表达,且随时间延长而表达增加.但Ⅰ型胶原染色仅在24周时方开始呈现阳性.Ⅲ型前胶原的mRNA则在各期均未探测到,但从24周起Ⅲ型胶原染色呈阳性.对照组关节软骨在术后4周时即可见到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原蛋白同时表达,且对照组中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原蛋白表达均呈减少趋势.结论(1)前胶原mRNA的表达早于胶原分泌.Ⅰ型前胶原mRNA表达在实验组中比对照组晚,而且实验组中Ⅰ型前胶原mRNA的表达时间较长,容易观察到阳性的表达信号,所以Ⅰ型前胶原mRNA可以成为早期骨关节炎(OA)的分子标志物.(2)Ⅲ型前胶原mRNA由于表达时间可能较短,所以即使在实验组有Ⅲ型胶原蛋白分泌,但不易查到有Ⅲ型前胶原mRNA的表达,因此Ⅲ型前胶原mRNA不是一个合适的早期OA的分子标志物.(3)硅橡胶植入对关节软骨的胶原合成有一定影响,但对关节软骨的影响小于对照组.硅橡胶植入修补关节软骨缺损可延缓骨关节炎的发病过程.     

肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6对人关节软骨细胞胶原基因表达的影响

目的：体外探讨肿瘤坏死因子－α（ＴＮ Ｆ－α）和白细胞介素－６（ＩＬ－６）对关节软骨细胞胶原表型表达的影响。方法：分离成人正常关节软骨细胞,用 ＴＮ Ｆ－α单独或与ＩＬ－６联合干预培养,采用形态学观察、流式细胞仪分析、Ｎｏｒｔ　ｈｅｒｎ杂交技术,检测关节软骨细胞表型。结果：ＴＮＦ－α可促使软骨细胞向成纤维细胞样细胞形态转化及分裂、增殖,抑制其表达特异性Ⅱ型胶原,而诱导其表达非特异性Ⅲ型胶原;ＩＬ－６有协同 ＴＮ Ｆ－α干扰软骨细胞表型表达的作用。结论： ＴＮＦ－α和ＩＬ－６是参与关节软骨细胞变性的介导因素。     

染矽尘大鼠早期肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达

 目的探讨染矽尘大鼠早期肺组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原形成的时间规律.方法采用气管暴露法建立矽肺动物模型.取肺组织制作石蜡切片,天狼猩红法染色,偏振光显微镜观察Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达,用图像分析系统对Ⅰ、Ⅲ型胶原进行定量分析.结果染矽尘后第3天,Ⅲ型胶原开始增生,染矽尘后第7天,Ⅰ型胶原开始增生,直至染矽尘后第28天.这2种胶原进行性增加.Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性面积百分比在染矽尘后均有不同程度的增加.染矽尘后第7天、第14天、第21天、第28天,Ⅰ型胶原阳性面积百分比分别增加27.12(P＜0.01),24.73(P＜0.01),16.01(P＜0.05),52.45(P＜0.01).染矽尘后第3天、第28天,Ⅲ型胶原阳性面积百分比分别增加2.20(P＜0.01)、24.13(P＜0.01).结论染矽尘大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原明显增加.Ⅰ、Ⅲ型胶原增生出现的时相有所不同,染矽尘后第3天,Ⅲ型胶原开始出现,染矽尘后第7天,Ⅰ型胶原开始形成,此后,Ⅰ、Ⅲ型胶原呈进行性增多的趋势.天狼猩红-偏振光显微镜法是一种定量检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的更加准确的方法.     

软骨细胞在微载体中的培养和快速扩增

目的：探索在短期内获得大量成活率高、分化良好的兔关节软骨细胞的方法,方法：应用胰蛋白酶、胶酶消化的方法从新生新西兰兔关节软骨处分离、培养软骨细胞,并将获得的软骨细胞在旋转生物反应应（RCCS）内应用Cytodex-3微载体进行培养。应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察,并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析。结果：并节软骨细胞可快速贴附于Cytodex-3微载体表面,细胞伸展后生长加速,到培养后期,细胞密度可达最初接种的20倍。在微载体上收获的软骨细胞Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结论：微载体细胞培养技术是一种简便、快速的体外细胞扩增方法,可为构体建组织工程化人工软骨提供大量软骨软件。     

人胰岛素样生长因子1基因转染关节软骨细胞及其稳定表达

目的　研究人胰岛素样生长因子 1 (hIGF 1 )基因转染关节软骨细胞获得稳定表达的可行性。方法　用脂质体转染法将含有hIGF 1cDNA的真核表达载体转染兔关节软骨细胞 ,经G4 1 8筛选 ,形成阳性细胞克隆。继续培养 4周 ,原位杂交检测hIGF 1的表达 ,免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原的表达。结果　G4 1 8筛选后所获得的阳性细胞克隆 ,原位杂交检测表明hIGF 1基因得到稳定表达 ,免疫细胞化学检测显示转染后的软骨细胞仍表达Ⅱ型胶原。结论　外源性hIGF 1基因能够在软骨细胞内获得稳定表达 ,而转染后的软骨细胞仍能稳定表达Ⅱ型胶原     

膝关节股骨外髁髁间侧壁软骨Ⅰ、Ⅲ型胶原和IL-1α、IL-1Ra分布的研究及其临床意义

目的 :观察分析成人股骨外髁髁间侧壁软骨组织IL - 1α、IL - 1Ra和I、Ⅲ型胶原分布特点。方法 :对 14例患者行膝前交叉韧带重建术、髁间窝成形时所取的股骨外髁髁间侧壁软骨标本进行免疫组化染色 ,观察软骨细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及IL - 1α、IL - 1Ra分布。结果 :Ⅰ型胶原见于软骨表层 ,Ⅲ型胶原分布于整个软骨表层和中间层。IL - 1α和IL - 1Ra分布一致 ,仅限于软骨表层。结论 :(1)股骨外髁髁间侧壁软骨与典型的正常负重区透明软骨不同。这可能是此区软骨的特征性表现 ,但不排除退变可能。 (2 )股骨髁间侧壁软骨作为正常软骨的移植来源 ,提供软骨细胞和骨软骨进行自体移植以修复软骨损伤时应该慎重。     

一氧化氮抑制兔关节软骨细胞II型胶原的合成

一氧化氮（NO）在骨关节炎和关节软骨代谢中具有重要的病理生理作用。为研究NO与关节软骨II型胶原的关系,我们在培养的兔关节软骨细胞中以药物刺激产生NO后,分别用ELISA及RT-PCR法测定II型胶原及前II型胶原α1链（COL2A1）mRNA表达量的变化。结果表明,0.2mM的硝普钠（SNP）可释放出大量NO,使软骨细胞II型胶原的含量减低,同时,RT-PCR法证实前II型胶原mRNA表达量也减少。100u/ml白细胞介素-1（IL-1）可刺激软骨细胞释放NO并使II型胶原量降低,其COL2A1mRNA表达量也减少。加用1mg/ml精氨酸甲酯（NAME,NO合酶抑制剂）后,则抑制了IL-1的作用,使NO产量下降,II型胶原含量部分恢复,COL2A1完全恢复。本试验证实了NO作为IL-1的下游分子抑制II型胶原的合成;其抑制作用是通过减少前II型胶原α1链mRNA表达量完成的。这在软骨细胞反分化过程中具有重要意义。     

应用自体血清培养大鼠关节软骨细胞生物学行为研究

目的:比较自体血清与胎牛血清体外培养大鼠关节软骨细胞生物学行为的差异。方法:分离培养雄性8周Sprague-Dawley(SD)大鼠软骨细胞,分别在5%、10%自体血清和10%胎牛血清中进行单层传代培养,采用光镜观察细胞形态变化,绘制生长曲线评估细胞增殖速度,通过甲苯胺蓝染色,Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色以及流式细胞仪分析细胞CD26、CD44及Ⅰ、Ⅱ型胶原表达以检测软骨细胞生物学行为的变化。结果:(1)在培养3代内,原代培养的软骨细胞形态呈多角形,而3代培养的细胞都为梭形,三组无明显差别;(2)5%自体血清培养的细胞的生长速度与10%胎牛血清培养的细胞接近,10%自体血清培养的软骨细胞的生长速度快于前两组;(3)甲苯胺蓝染色结果证明三组细胞均随传代数增加酸性粘多糖蛋白分泌量下降,且10%胎牛血清组比10%和5%自体血清培养组下降更明显,而10%与5%自体血清培养组之间无明显差异;(4)免疫组化染色和流式细胞仪检测结果表明10%与5%自体血清培养的软骨细胞Ⅱ型胶原表达高于10%胎牛血清培养的细胞(P<0.05),10%与5%自体血清组无显著性差异(P>0.05);随体外培养时间延长,三组细胞合成的Ⅱ型胶原均逐渐减少,Ⅰ型胶原表达逐渐增多。(5)流式细胞仪观察显示三组CD26表达虽有增加但无显著性差异,CD44表达均随传代数增加而逐渐增加,且在1、3代细胞之间具有显著性差异(P<0.05)。在3种培养条件下,相同代数的软骨细胞CD26和CD44表达无显著性差异。结论:本研究发现10%自体血清培养大鼠软骨细胞生长速度快,且仍可以较好保持细胞表型,推测在可能条件下使用浓度较高的自体血清可以缩短体外培养时间而达到较多细胞保持表型的目的。     

体外器官培养系统中纤维软骨组织修复的实验研究

半月板是一种纤维软骨组织，由纤维软骨细胞与以Ｉ型胶原为主的基质构成。以往认为纤维软骨细胞缺乏再生能力，使半月板损伤不能愈合。近来有研究表明脱离了基质的纤维软骨细胞在体外单层培养条件下有很强的增生分化能力。因此我们在体外器官培养并提供纤维蛋白支架的条件...     

软骨细胞的永生化及其生物学特性

软骨由软骨细胞、胞外基质(胶原纤维、蛋白多糖)及水组成。其中后两者所占比例较大,软骨细胞数量较少,所以从软骨中获得软骨细胞来源有限[1];并且软骨细胞增殖能力低,代谢缓慢,体外培养对密度高度依赖,且为有限增殖,传代到第9代左右,细胞出现老化现象,使传代难以为继。特别是软骨细胞在体外长期培养有去分化的趋势,表型(特别是Ⅱ型胶原)难以保持[2]。上述这些问题,都是软骨细胞库建立及软骨细胞工程必须解决的难题。因此,众多学者一直试图建立一种能够长期培养、表型稳定的永生化软骨细胞。一、永生化的定义及意义所谓“永生化”(ｉｍｍｏｒ…     

人关节软骨细胞的永生化及其表型的诱导

目的 用基因转染技术使人关节软骨细胞（HACs)向永生化转化，通过诱导使永生化软骨细胞的表型得到维持。方法 利用编码人类乳头瘤病毒16型E7基因片段（HPV16E7）的逆转录病毒表达载体pLXSN转染HACs，挑取转化细胞克隆并扩大增殖，继用核型分析，克隆形成实验，裸鼠致瘤实验检测转化特性，Nutridoma-sp及抗坏血酸盐无血清诱导培养基诱导并维持转化软骨细胞的Ⅱ型胶原表型。结果 HACs被HPV16E7成功转化，目前传代已达50代，转化的HACs为良性转化，诱导培养基能够使转化软骨细胞的Ⅱ型胶原合成增加并维持在正常水平。结论 HPV16E7能够使HACs良性转化并长期培养经诱导后转化软骨细胞的Ⅱ型胶原表型能够得到很好维持。     

藻酸盐凝胶三维培养条件下牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠对兔关节软骨细胞表型的影响

目的 探讨牛胰岛素一转铁蛋白-硒钠(ITS)对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞表型的影响. 方法 分离培养兔关节软骨细胞,将单层培养的P2代细胞接种于藻酸盐凝胶中,分别在DMEM培养液中加入10%胎牛血清(FBS).0.2%FBS+1%ITS、1%ITS即设为FBS组、ITS/FBS组,ITS组行DNA、蛋白聚糖(GAG)含量测定及组织化学检测. 结果 软骨细胞在藻酸盐凝胶中始终保持球形样外观,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性.3组GAG合成无显著性差异(P＞0.05).培养的第6天ITS组DNA含量低于FBS组(P＜0.05),第12天低于ITS/FBS组和FBS组(P＜0.05). 结论 ITS可促进藻酸盐凝胶中软骨细胞的增殖,并保持其表型.     

原代骺板软骨细胞的高效分离和体外培养观察

目的　设计原代骺板软骨细胞的高效分离法 ,并对骺板软骨细胞的体外培养进行初步观察。　方法　改良设计以 1g L的胰蛋白酶 / 1g L的乙二胺四乙酸 (EDTA)、1g L的透明质酸酶和 2g L的Ⅰ型胶原酶系列消化分离原代软骨细胞的三步酶消化分离法 ,观察其对幼兔骺板原代软骨细胞的分离效果 ;倒置显微镜和光镜下观察体外培养条件下细胞生物学特性。　结果　 ( 1)三步酶的消化可使软骨基质完全解离降解 ,细胞均得以分离 ,收获量与组织湿重呈非常显著的正相关 ,每克软骨的细胞收获量平均为 32 .3× 10 6 个 ,细胞存活率平均为 97.6 %。 ( 2 )原代和第 1代细胞附壁生长呈三角形或多角形 ,生长融合时呈卵圆形 ,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝 (TB)异染反应均呈阳性 ;第 3代以后细胞逐渐变为梭形 ,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性 ,TB异染反应明显减弱。结论　 ( 1)原代骺板软骨细胞三步酶消化分离法具有细胞收获率高、细胞存活率高、操作简便等特点。 ( 2 )随着传代培养次数的增加 ,骺板细胞出现去分化 ,逐渐失去软骨细胞的特异性表型。     

兔半月板纤维软骨细胞的体外去分化研究

目的:比较研究不同代次间兔半月板纤维软骨细胞生物学特性的改变,为构建组织工程半月板和细胞治疗中的种子细胞优选提供进一步的理论和实践基础。方法:采用机械分离与酶连续消化相结合的方法体外分离兔半月板纤维软骨细胞,单层培养传代至第5代。采用相差倒置显微镜和SEM观察各代细胞的形态变化和超微结构,MTT法检测细胞增殖情况并描绘生长曲线,采用细胞化学染色和免疫组化鉴定细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白。结果:半月板纤维软骨细胞原代接种后8~12 h开始贴壁,48~72h大部分细胞贴壁,胞质逐渐展开,细胞变大伸长,形成突起,呈多角形,细胞形态规则,轮廓清晰,镜下观察有立体感,7~10 d后,细胞长满传代。传代后细胞贴壁生长能力和增殖速度明显加快,原代至第2代细胞形态较规则,多呈多角形,大小均一。第3代后随着传代次数的增加,细胞中梭形细胞增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长。第5代分裂相少见,密度稀疏,细胞形态不佳,约80%呈长梭形,分泌和增殖能力下降。SEM示第1代半月板细胞形态规则,呈多极性,表面有突起;第5代细胞形态不规则,多呈梭形。生长曲线可见第4代前半月板细胞生长速度及生长周期均相似,第5代后细胞生长速度减慢,增殖减缓。细胞化学和免疫组化染色分析胶原和蛋白聚糖的表达:随传代的进行,Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达逐渐减弱而Ⅰ型胶原表达逐渐增强。结论:体外单层培养条件下,随着传代的进行,细胞活力逐渐下降,生长速度减慢,传代周期延长,逐渐变为梭形,形态不规则。体外单层培养系统中半月板纤维软骨细胞表型随传代的进行,Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达逐渐减少而Ⅰ型胶原表达逐渐增多,体外单层培养条件下培养的半月板纤维软骨细胞从第3代开始逐渐失去其特异性表型,发生去分化,逐渐变为成纤维细胞的表型。体外单层分离培养的第5代前半月板细胞基本维持纤维软骨细胞的表型和生物学特性,可作为组织工程半月板的种子细胞。     

人半月板纤维软骨细胞培养及生物学特性研究

为探索分离培养人半月板纤维软骨细胞的简便实用方法，采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法，简便快速地获得大量成活率高的人半月板纤维软骨细胞，在F－12培养液中进行原代和传代培养，并对传代培养纤维软骨细胞进行了免疫组化鉴定，光镜及超微结构的观察，结果显示，光镜下，原代培养细胞呈线形，单层排列，电镜可见细胞内有丰富的粗面内质网及线粒体，细胞呈多极性，表面有突起，纤维软骨细胞免疫组化Ⅱ型胶原染色阳性，提示本实验建立的人纤维软骨细胞分离培养方法是一种可行的方法。，     

骨性关节炎关节软骨中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅹ型胶原的分布

目的 :研究成人骨性关节炎关节软骨中的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅹ型胶原的分布。方法 :分别用抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅹ型胶原单克隆抗体对成人骨性关节炎关节软骨切片进行免疫组织化学染色法。结果 :骨性关节炎关节软骨全层无Ⅰ型胶原 ;Ⅹ型胶原分布在深层和钙化层 ;Ⅱ型和Ⅲ型胶原分布相同 ,轻度病变时分布于软骨全层 ,中、重度病变时主要分布于中、深层。结论 :成人骨性关节炎关节软骨中不仅含有Ⅱ型胶原 ,而且含有大量Ⅲ型和Ⅹ型胶原 ,但无Ⅰ型胶原。Ⅹ型胶原和Ⅱ、Ⅲ型胶原的分布有重叠区     

行气消肿类中药对体外培养的软骨细胞代谢的影响

采用家兔关节软骨细胞体外培养的方法，观察４种中药黄柏、木香、续断和骨碎补不同浓度对培养的软骨细胞的影响，并采用同位素示踪观察软骨细胞ＤＮＡ、胶原和蛋白多糖的合成变化。结果显示，所有４种中药的不同浓度对软骨细胞ＤＮＡ合成均起抑制作用，除低浓度木香溶液外，对胶原合成亦呈抑制作用，１％和５％的黄柏和骨碎补对蛋白多糖合成有促进作用。认识培养软骨细胞对４种中药的特殊反应，为正确使用这些药物提供了新的参考依据。