热休克蛋白gp96肽复合物免疫治疗小鼠骨肉瘤的研究

目的研究热休克蛋白gp96（HSPgp96）肽复合物体内外特异性抗肿瘤作用。方法采用^51Cr释放法测定经HSPgp96肽复合物修饰的树突状细胞（DC）对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性的影响，同时在骨肉瘤动物模型上观察HSPgp96肽复合物与修饰后的DC对骨肉瘤的生长状况及体内免疫水平的影响。结果HSPgp96肽复合物修饰的DC可激活小鼠脾淋巴细胞，后者能对人成骨肉瘤细胞系MG-63细胞进行特异性杀伤；HSPgp96肽复合物及修饰后的DC使IL-10表达水平明显降低，IFN-γ水平明显上升（P〈0．01），能有效抑制体内肿瘤的生长。结论HSPgp96肽复合物能很好地修饰体外诱导获取的DC，使DC具有很强的体内外抗肿瘤作用。     

HSPgp96与rIL-2治疗小鼠H22肝癌移植瘤的实验研究

目的：研究热休克蛋白gp96(Heat—Shock Protein gp96，HSPgp96)—肽复合物瘤苗与重组人白介素-2(Recombinant Human Interleukin-2，rIL-2)对小鼠H22肝癌移植瘤的治疗效果。方法：从H22肝癌细胞中提取和纯化HSPgp96。建立小鼠H22肝癌移植瘤模型，应用HSPgp96与rIL-2治疗并比较疗效，观察指标：瘤重，光镜、电镜下观察组织结构。结果：经鉴定获得纯化的HSPgp96。HSPgp96 5μg与rIL-2 25ku治疗小鼠H22肝癌有效。结论；该实验方法提纯的HSPgp96与重组人IL-2都能有效抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长。     

gp96多肽复合物介导的细胞毒性T淋巴细胞对食管腺癌细胞的免疫杀伤作用

目的:研究肿瘤细胞来源的gp96多肽复合物介导的对同一类型肿瘤的免疫治疗作用.方法:提取纯化食管腺癌细胞系SEG-1裸鼠成瘤组织的gp96蛋白多肽复合物,与外周血单个核细胞(PBMNC)诱导培养的树突状细胞(DC)结合,制备gp96-DC疫苗;台盼蓝拒染法测定淋巴细胞增殖率;ELISA方法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)培养上清液的γ干扰素(IFN-γ)含量,MTT法检测CTL对靶细胞SEG-1的杀伤率.结果:55 g瘤组织提取纯化gp96蛋白120μg;单独DC、单独gp96及gp96-DC均能刺激淋巴细胞增殖,产生CTL,释放IFN-γ,对靶细胞SEG-1均显示一定的杀伤作用,以gp96-DC的作用最明显,在效靶比40:1时,杀伤率为68%.单独DC诱导的CTL对SEG-1、K562的杀伤作用与非抗原刺激的淋巴细胞比较,统计学差异无显著性.结论:肿瘤来源的热休克蛋白gp96可使DC具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力,所产生的CTL对靶肿瘤细胞有明显的特异杀伤作用.     

肿瘤的热休克蛋白90-肽复合物诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞的体外研究

目的探讨肿瘤组织来源的热休克蛋白90-肽复合物(HSP90-PC)诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。方法高压液相色谱法分离纯化肾腺癌患者肿瘤组织HSP90-PC,同时从该患者外周血扩增树突状细胞及T细胞,以提取的HSP90-PC冲击树突状细胞,将致敏的树突状细胞与T细胞混合,流式细胞仪检测特异性CD8^* CTL的增殖情况。结果肿瘤组织来源的HSP90-PC致敏的树突状细胞可显著诱导T细胞增殖生成CD8^* CTL。结论从肿瘤组织中提取的HsP90-PC具有良好的免疫原性,用其致敏的树突状细胞可有效诱导CTL增殖,从而为肿瘤的免疫治疗提供了新的方法和依据。     

gp96多肽复合物对树突状细胞成熟及功能的影响

目的探讨gp96多肽复合物对树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟及功能的影响.方法应用液相层析技术从胃癌组织中提取gp96多肽复合物,用SDS-PAGE和Western blot进行性质鉴定,将提取的gp96多肽复合物加入外周血来源的单个核细胞诱导培养DCs,采用流式细胞技术检测DCs的表型变化,用3H-TdR掺入法检测DCs诱导的混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR).结果从1 g湿重的胃癌组织中可提取gp6多肽复合物30～50μg,用gp96多肽复合物诱导培养的DCs其表面分子的表达明显增高,并具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力.结论从胃癌组织中可以提取出gp96多肽复合物,gp96多肽复合物可促进DCs分化成熟,使其具有更强的抗原提呈能力.     

肾癌FasL表达异常对T淋巴细胞凋亡的影响

目的探讨凋亡相关基因产物FasL蛋白在肾癌中的表达及对T淋巴细胞凋亡的影响.方法采用免疫组织化学方法(VP法)对44例肾癌组织和10例相邻正常肾组织FasL蛋白表达进行检测;TUNEL法检测44例肾癌组织浸润性T淋巴细胞的凋亡;体外培养786-0肾癌细胞株和JurkatT淋巴细胞,流式细胞仪(FCM)检测JurkatT淋巴细胞的凋亡.结果肾癌组织FasL阳性表达率46.5%,高于正常肾组织中FasL的表达(23.2%,P＜0.05);肾癌浸润性T淋巴细胞凋亡率33.1%,和肾癌FasL表达呈正相关(r=0.96,P＜0.01);表达FasL的786-0肾癌细胞株可引起Fas(+)的JurkatT淋巴细胞凋亡.经干扰素-γ(IFN-γ)处理后的786-0细胞株可增强对JurkatT淋巴细胞的细胞毒效应.抗FasL抗体(NOK-1)对Fas介导的凋亡有抑制作用.结论肾癌组织免疫逃避机制之一是通过高表达FasL而引起肾癌浸润性T淋巴细胞凋亡;肾癌组织表达FasL能通过Fas/FasL通路主动杀伤Fas(+)的JurkatT淋巴细胞.     

膜细胞骨架蛋白-ezrin差异表达与肾癌转移、侵袭的关系

目的:探讨细胞骨架连接埃兹蛋白(Ezrin)在肾细胞癌中的表达及与肿瘤转移、侵袭的关系.方法:收集50例肾癌组织及40例相应癌旁正常肾组织,按肾癌组织(有无淋巴结转移,有无腔静脉瘤栓形成),癌旁正常肾组织,伴有淋巴结转移的肾癌组织,伴有腔静脉瘤栓形成的肾癌组织分组.采用RT-PCR,Western Blot,免疫组化检测ezrin的表达.结果:RT-PCR,Western Blot结果显示,在肾癌组织及癌旁正常肾组织中均可检测到ezrin mRNA及蛋白,且肾癌组织表达水平显著高于癌旁正常肾组织.免疫组化检测ezrin蛋白阳性表达率在肾癌组织中为96%(48/50),癌旁正常肾组织组为75%(30/40)(X2=10.350,P=0.002);ezrin mRNA表达阳性率肾癌组为82%(41/50),癌旁正常肾组织组为62.5%(25/40)(X2=4.321,P=0.038),肾痛组均显著高于癌旁正常肾组织组.免疫组化评分及ezrin mRNA阳性表达率,淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组[(9.500±2.502)vs(7.232±3.045),13/14 vs 16/36,P<0.05];腔静脉瘤栓形成组显著高于无腔静脉瘤栓形成组[(9.315±3.027)vs(7.563±2.991),14/14 vs 22/36,P<0.05].肾癌组织中ezrin蛋白,ezrin mBNA表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤分期、分级、肿瘤大小及肿瘤病理类型无关(P>0.05).结论:ezrin在肾癌组织中表达及其强度与肾痛淋巴结转移及腔静脉瘤栓形成有关,ezrin可能参与了肾癌的发生、侵袭和转移,测定肾癌组织中ezrin mRNA及蛋白有助于进一步评估肾细胞癌的预后和制定合理的治疗方案.     

人肾透明细胞癌组织中细胞增殖与凋亡及凋亡相关因子的表达

目的:本课题旨在通过检测人肾透明细胞癌组织中细胞增殖(PCNA)与凋亡(TUNEL法)及凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-9表达的变化,研究这些因子的表达与肾癌的关系.方法:标本离体后分成三组,(Ⅰ)肾透明细胞癌组;(2)癌旁组织组;(3)证常肾组织组,应用HE染色法、TUNEL法及免疫组织化学方法进行观察研究.结果:(1)HE染色结粜:肾透明细胞癌组织镜下可见肿瘤细胞体积较大,圆形或多边形,胞质染色浅,透明或颗粒状,核同缩,间质富有毛细血管和血窦.(2)TUNEL检测结果:在肾癌组织、癌旁组织及正常肾组织组均有凋亡发生.凋亡肾组织细胞表现为染色质凝集、边集,核固缩.正常肾组织组细胞核有弱的阳性表达,癌旁组织表达明显增多,肾癌组织阳性表达最少.(3)PCNA免疫组化染色结果:正常肾组织内的细胞核有弱的阳性表达,癌旁阳性表达增加,肾癌组织阳性表达明显增多.(4)Caspase-3、Caspase-9免疫组化结果:Caspase_3 Caspase-9在难常肾组织中可见少量弱的阳性反应,癌旁组织阳性表达增加,肾癌组织表达明显减少.结论:癌旁细胞组织Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达明显高于正常肾组织及癌组织,癌组织表达最少;而PCNA则相反,癌组织高于癌旁组织和正常肾组织,正常肾组织表达最少.癌组织中Caspase-3和Caspase-9表达下降,PCNA表达升高说明细胞凋亡减少,癌组织细胞增殖旺盛,是肿瘤形成的重要机制.Caspase-3、Caspase-9、PCNA于肾透明细胞癌的表达在肿瘤分期间无明显差异性.     

热休克蛋白70与肿瘤相关性研究进展

热休克蛋白70(heat shock prote in HSP70)是一组重要的应激蛋白,它在肿瘤,特别是恶性肿瘤中常有高表达,它能与癌基因、抑癌基因产物结合,具有抗肿瘤细胞凋亡作用。目前认为HSP70参与肿瘤免疫应答过程,肿瘤组织中提取的HSP70-肽复合物具有肿瘤特异性免疫原性,可诱导产生特异性抗肿瘤免疫效应,HSP70-肽复合物作为肿瘤疫苗具有很好的临床应用前景。     

人肾癌组织hTERT mRNA原位杂交分析及其意义

目的探讨人肾癌组织hTERTmRNA的转录水平、细胞定位及与肾癌生长和发展的关系。方法采用Digoxion标记原位杂交法,检测50例石蜡包埋存档的肾癌组织和40例相应正常肾组织及配对32例冰冻保存的肾癌组织和远离癌自身正常肾组织标本的hTERTmRNA转录水平和细胞定位。结果肾癌组织和正常肾组织的hTERTmRNA转录阳性率分别为:石蜡包埋组44%(22/50)和15%(6/40);冰冻保存组50%(16/32)和13%(4/32)。两组肾癌组织hTERTmRNA转录阳性率均较正常对照肾组织显著增高(P均<0.05);癌组织原位杂交阳性见于癌细胞,主要位于胞核,少数位于胞浆;而两组正常对照肾组织为弱阳性反应。结论人肾癌组织过度转录hTERTmRNA,可能与肾癌的生长、发展有关。     

Potent antitumor effect elicited by gp96-peptide complexes pulsed by dendritic cell on mice of H22 liver cancer

Objective： To improve DC-based tumor vaccination, we studied whether dendritic ceils （DCs） which cocultured with H22 liver cancer cells-derived heat shock protein （HSP） glycoprotein 96 （gp96） affect the T cell-activating potential in vitro and the induction of tumor immunity in vivo. Methods： Maturation of murine bone marrow-derived DC was induced by GM-CSF plus IL-4, which mimiced the immunostimulatory effect of DC. Cocultured DC and gp96-peptide complexes were used to vaccine H22 liver cancer cells of mice. Using murine models we compared the immunogenecity of DC modified by gp96-peptides complexes derived from murine liver cancer cells alone or inactive tumor cells. To verify the specificity of the vaccine, in vitro assays were executed. Serum cytokine levels were quantified to explore the supposed pathway of DC modified by gp96 peptide complexes and its effect on antitumor immune response. Results： DC modified by gp96-peptide complexes can activate spleen lymphocyte and the latter can specifically kill H22 cells but not Ehrilich ascites carcinoma cells. Modified DC can induce potent tumor-antigenspecific immune response, augment the proliferation of Thl cells, and inhibit tumor growth. Conclusion： In this study, we have developed a novel DC-mediated tumor vaccine by combing the gp96 antigenic peptides complexes and inducing immune response against specific tumor cells, gp96 can be identified as a potent DC activator.     

人外周血γδT细胞激活后IL-2和IFN-γ表达的特点

目的: 探讨人外周血γδT细胞在不同刺激剂激活后产生Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ的不同特点。方法: 健康成人外周血单个核细胞(PBMC)用佛波醇酯(PMA)、离子霉素(ionomycin)和抗CD28单抗(mAb)以不同组合刺激6~8h后;用流式细胞术胞内细胞因子检测法测定γδT细胞和αβT细胞IL-2和IFN-γ的表达;或用结核杆菌抗原(Mtb-Ag)刺激γδT细胞加IL-2扩增3~8天后检测γδT细胞IL-2的表达。结果: PBMC经PMA+ionomycin刺激后,与αβT细胞中产生IL-2细胞(14.0%)相比,γδT细胞中极少数细胞(1.1%)表达IL-2;但分泌IFN-γ细胞在γδT细胞中(56.1%)明显多于αβT细胞(8.5%)。如加抗CD28mAb联合刺激后,IL-2产生细胞在αβT细胞中明显增加,但在γδT细胞中未见增加;而IFN-γ表达细胞在两类细胞中均有明显增加;PBMC用Mtb-Ag激活后扩增3天后在γδT细胞中开始检测到IL-2表达,第5~6天时达高峰,第8天时逐渐下降。结论: 多克隆短时刺激对PBMC中γδT细胞表达IFN-γ能力强于αβT细胞,但产生IL-2很少;MtbAg能诱导γδT细胞表达IL-2,但过程较慢。     

In vitro induction of specific anti-tumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene-transfected dendritic cells

Background  Objective evaluation of the antitumor effect of interleukin-12 (IL-12) gene-transfected dendritic cell (DC) vaccine on laryngeal carcinoma requires in vivo and in vitro tests. The aim of this study was to investigate the function of IL-12 gene transfected DC at initiating specific immune response to laryngeal carcinoma in vitro．

Methods  Recombinant adenovirus with IL-12 gene was constructed. DCs were isolated from the peripheral blood of patients with laryngeal carcinoma, pulsed with tumor lysate of laryngeal carcinoma cells (DC⁺Ag), and transfected with IL-12 (DC-IL-12⁺Ag). The cells pheotypes including CD83, CD86 and HLA-DR on surface of DCs were assayed by flow cytometry (FCM). The concentration of IL-12 in culture supernatant of DCs and interferon γ (IFN-γ) in culture supernatant of T cells cocultured with DCs were quantified by ELISA. Methyl thiazolys tetrazolium (MTT) was used to evaluate proliferation of autologous T lymphocytes and activation of cytotoxic T lymphocytes (CTL) stimulated by IL-12-transfected DCs pulsed with tumor lysate against laryngeal carcinoma cells.

Results  The recombinant adenovirus expressing IL-12 gene was constructed successfully. Gene-transfected DC plused with tumor lysate with IL-12 (DC-IL-12⁺Ag) expressed higher level of CD83, CD86 and produced higher level of IL-12 than untransfected DCs (DC⁺Ag) (CD83: (60.2±1.8)% vs. (50.7±1.2)%, P <0.05; CD86: (88.9±2.1)% vs. (78.2±3.9)%, P <0.05; IL-12: (262.5±3.0) ng/L vs. (103.8±5.1) ng/L, P <0.05). The proliferation of autologous T lymphocytes and production of IFN-γ stimulated by DC transfected with IL-12 were more obviously than untransfected DCs. Cytotoxicity of CTL stimulated by IL-12-transfected DC pulsed with tumor lysate against laryngeal carcinoma cells were significantly stronger than stimulated by untransfected DC.

Conclusion  It is a promising approach for IL-12-transfected DC pulsed with tumor lysate to increase the antitumoral effect.

     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL对MCF-7细胞的体外杀伤效应

目的:采用MCF-7乳腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞(DC),观察其体外诱导人T淋巴细胞产生特异性抗乳腺癌免疫的效能。方法:联合应用细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导出DC,体外负载MCF-7细胞冻融抗原,活化自身T淋巴细胞,采用ELISA法测定γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)水平,乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MCF-7细胞的杀伤效应。结果:负载抗原DC与T淋巴细胞共培养产生IFN-γI、L-12的水平,显著高于未负载抗原DC组(P<0.05)、单纯抗原组(P<0.01)和对照组(P<0.01);负载抗原DC诱导CTL对MCF-7的杀伤效应,显著高于其他3组(P<0.01)。结论:MCF-7细胞裂解物致敏DC诱导的人CTL,对MCF-7细胞具有明显的特异性杀伤效应。     

胸腺五肽诱导重症肌无力细胞免疫抑制的临床观察

目的 探讨在不同刺激条件下,胸腺五肽(TP5)对重症肌无力患者外周血单个核细胞(PBMC)的IFN-γ的产生以及对不同T淋巴细胞亚群的影响,为TP5临床治疗重症肌无力提供实验学依据.方法 重症肌无力患者PBMC在抗CD3单克隆抗体的刺激下,观察TP5对IFN-γ产生的影响.同时使用流式细胞仪,在单个细胞水平上评价TP5对各亚群T淋巴细胞细胞因子IFN-γ表达的影响.结果 用抗CD3单克隆抗体和TP5(300μg/ml)刺激后,所有重症肌无力患者PBMC的IFN-γ表达水平明显受抑制(P_(儿童)=0.0001,P_(成人)=0.01);正常对照儿童和成人PBMC的IFN-γ表达水平亦明显下降(P_(儿童)=0.009,P_(成人)=0.0001).同一年龄分层组的比较,TP5对PBMC的IFN-γ表达水平的抑制程度在儿童MG组中较正常对照组弱,统计学有差异,而成人MG组与对照组比较差异无统计学意义(P_(成人)=0.481);TP5明显抑制CD8+(P_(MG)=0.025,P_(正常)=0.002)和CD4+T(P_(MG)=0.009,P_(正常)=0.004)细胞IFN-γ表达.结论 TP5能抑制治疗重症肌无力患者的细胞免疫应答.     

结核抗原特异性CD4~+中央型记忆T细胞的检测及分布特性研究

目的 比较活动期肺结核患者和纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)试验阳性健康人记忆T细胞的产生和分布特性.方法 取乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝静脉血,Ficoll进行密度梯度离心获取PBMCs.采用卡介苗刺激后,通过CD4、CD154、CCR7、CD45RA 4种抗体共染色,用流式细胞仪检测结核抗原特异性CD4+记忆T细胞.结果 以CIM+CD154+双阳性区设门,研究结核抗原特异性CD4+记忆T细胞,结果显示,肺结核患者CD4+CD154+CD45RA-CCR7+中央型T淋巴细胞亚群分布频率显著降低(P<0.05),CD4+CD154+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群的比例明显增高(P<0.05).结论 肺结核患者CD4+中央型记忆T淋巴细胞亚群的产生存在异常,可能与免疫功能低下和结核病发病密切相关.     

Heat Shock Protein 96 Induces Maturation of Dendritic Cells

Objective： Heat shock protein （HSP） has the promiscuous abilities to chaperone and present a broad repertoire of tumor antigens to antigen presenting cells including DCs. In this report, we analyzed the modulation of immature DC by lISP 96 （gp96）. Method： Murine bone marro6-derived DC was induced by GM-CSF plus IL-4, which aped the immunostimulatory effects of DC. Cocultured DC and gp96-peptide complexes （gp96-PC） or inactivated H22 cells, the expression of MHC class Ⅱ , CD40, CD80 was quantified by flow cytometry. The concentration of IL-12 and TNF- in culture supematants were determined by ELISA. C1 release assay was used to test specific cytotoxic T cell. Results： Our study demonstrated that the extent of DC maturation induced by gp96-PC, which was reflected in surface density of costimulatory and MHC Ⅱmolecules, was correlated with the secretion of IL-12 and with the T cellactivating potential in vitro. Conclusion： Heat shock protein 96 could be isolated and purified from H22 cells and could induce maturation of dendritic cell. Our findings might be relevance to the use of DC vaccine in therapy of human tumors.     

肾癌组织的端粒酶活性

目的 :探讨端粒酶活性与肾细胞癌之间的关系。方法 :采用改良TRAP法对 32例肾细胞癌组织及正常肾组织和可疑癌旁组织中端粒酶活性进行检测 ,同时了解其与临床生物学特征的关系。结果 :32例肾细胞癌组织中端粒酶强阳性 17例 ,阳性 12例 ,阴性 3例 ,阳性率 91% ;32例正常肾组织中端粒酶弱阳性者仅 2例 ,阳性率 6 % ;可疑癌旁组织阳性者 6例 ,阳性率 19%。三组端粒酶活性比较 ,阳性率差异有显著性 (P <0 0 1)。结论 :肾细胞癌组织中端粒酶活性检出率高 ,特异性强 ,无假阳性和假阴性。提示端粒酶活检测可作为判断肾肿瘤恶性程度的标记物 ,并可能成为判断肾肿瘤预后的一项指标