初级纤毛介导的Shh信号对大鼠骨髓基质细胞神经元样细胞分化的影响

目的 探讨初级纤毛介导的Sonic hedgehog(Shh)信号对大鼠骨髓基质细胞(MSCs)神经元样细胞分化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs。实验分为白藜芦醇正常培养组、白藜芦醇诱导组、Smoothened (Smo)激动剂SAG组、Smo抑制剂环巴明组,分别给予相应的药物处理。倒置显微镜下观察各组细胞形态; 免疫荧光法检测各组细胞初级纤毛及Shh信号通路相关蛋白\[Ac-Tu、Patched (Ptc)、Smo、Gli1\]的表达; RT-PCR检测各组细胞Smo、Gli1 mRNA的表达;蛋白质印迹法检测各组细胞Smo和Gli1蛋白的表达。结果 正常培养的大鼠MSCs不表达初级纤毛。经过预诱导或饥饿处理24 h后,MSCs表达初级纤毛及Ptc、Smo和Gli1蛋白,其中Smo和Gli1蛋白位于胞质,Ptc蛋白位于初级纤毛。正常培养时,白藜芦醇不能促使Smo移位及MSCs向神经元样细胞分化。当MSCs表达初级纤毛时,白藜芦醇及SAG可使Smo从胞质进入初级纤毛,同时伴随MSCs向神经元样细胞分化及 Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达水平的增加(P<0.05); 加入抑制剂环巴明后,Smo仍主要表达于胞质,Smo、Gli1 mRNA和蛋白的表达水平降低(P<0.05),MSCs向神经元样细胞的分化受抑制。结论 MSCs表达初级纤毛并存在Shh信号,初级纤毛介导的Shh信号参与调控大鼠MSCs的神经元样细胞分化。     

Hedgehog信号通路分子在食道鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨Hedgehog信号通路分子Gli1、Hip、PDGFRα、Smo和Su(Fu)基因在食道鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义。方法:应用原位杂交方法检测内蒙古医科大学附属医院胸外科2013年3月-2014年5月经手术切除、病理科确诊的12例食道鳞状细胞癌组织及距肿瘤边缘2 cm处经病理证实为正常组织的12例食管黏膜(阳性对照)中Hedgehog信号通路分子Gli1、Hip、PDGFRα、Smo和Su(Fu)基因的表达。结果:12例癌组织中,10例癌组织中均检测到Hedgehog信号通路分子Gli1、Hip、PDGFRα、Smo基因的表达,8例癌组织中检测到Hedgehog信号通路分子Su(Fu)基因的表达,而其在对照组中均未表达,两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。Gli1、Hip、PDGFRα、Smo及Su(Fu)基因的表达与患者的年龄、性别、组织学分级、临床分期无关,差异无统计学意义(P0.05)。结论:Hedgehog信号通路在食道鳞状细胞癌组织中存在高表达,其可能作为肿瘤治疗的新靶点。     

白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞的神经元样细胞分化伴Shh信号激活

目的 研究Sonic Hedgehog(Shh)信号在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法 采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs.MSCs分为3组,白藜芦醇诱导组:用含白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;对照组:用无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;正常组:不做诱导处理.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法、免疫印迹法检测NSE、MAP-2、GFAP、Smo和Gli1蛋白的表达和移位.结果 白藜芦醇诱导后细胞胞体收缩,伸出长突起,类似神经元.免疫荧光显示正常组及对照组MSCs轻度表达神经元NSE蛋白,白藜芦醇诱导组MSCs NSE、MAP-2阳性,但诱导前后细胞始终未表达胶质细胞GFAP蛋白.免疫荧光显示,MSCs具有初级纤毛,并表达Smo和Gli1.白藜芦醇诱导组Smo从细胞质进入初级纤毛,Glil从细胞质进入细胞核,同时,Smo、Glil蛋白的表达增加(P＜0.01).对照组则无明显变化.结论 白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞;此过程中Shh信号通路被激活,推测Shh信号在MSCs分化过程中可能发挥着重要作用.     

Sonic Hedgehog信号通路在大鼠牙髓炎中的作用

目的:观察Sonic Hedgehog(Shh)信号分子在大鼠牙髓炎中的免疫定位,探讨Shh信号通路在牙髓防御和修复中所起的作用。方法:将15只SD大鼠随机分成1d、3d和7d组,每组5只,用穿髓开放法建立大鼠牙髓炎模型,3组大鼠分别于术后1,3,7d处死,取出下颌磨牙,常规组织学处理,免疫组化方法检测Shh,Smo,Ptc,Gli1的表达,并对Shh信号通路在大鼠牙髓炎中的表达进行半定量分析,对照组为大鼠正常牙髓。结果:大鼠牙髓炎模型1,3,7dShh广泛表达于穿髓孔下方牙髓间充质细胞及远离穿髓孔的根髓细胞中,表达量随炎症的进展无显著性提高(P>0.05)。Ptc、Smo、Gli1在大鼠牙髓损伤后1d未见阳性表达,3d和7d均表达于穿髓孔下方牙髓间充质细胞中,且表达量均有显著性提高(P<0.05)。空白对照组中Shh信号通路阴性表达。结论:Shh信号通路在牙髓炎过程中表达,提示其可能被激活,参与牙髓炎症反应。     

小GTP酶Arl6调控原纤毛生成和Shh信号转导

目的:研究小GTP酶Arl6对sonic hedgehog(Shh)信号通路的调控作用?方法:构建Arl6敲低稳转细胞株,检测Shh通路靶基因Gli1及Ptch1的mRNA表达水平;激光共聚焦显微镜下观察Arl6在原纤毛的定位,并且检测Arl6敲低细胞中原纤毛的生成情况?结果:Arl6的敲低抑制Shh信号通路的完全激活,在高浓度Shh条件性培养基或Smo激动剂Purm刺激下,靶基因Gli1 mRNA表达水平明显低于对照shControl组(P < 0.01),Ptch1 mRNA的表达水平也明显降低(P < 0.05);Arl6定位于原纤毛的基部小体,Arl6的缺失会影响原纤毛的生成;同时,Shh信号会刺激Arl6的表达(P < 0.05)?结论:小GTP酶Arl6的敲低抑制Shh通路的完全活化,与其抑制原纤毛生成有关?     

调控Smo活性对成年大鼠神经干细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨Shh信号通路中G蛋白偶联受体Smoothened（Smo）对成年大鼠神经干细胞（ANSCs）增殖、迁移的影响并阐明其作用机制。方法 培养ANSCs,分别添加Smo的激动剂Purmorphamine及其抑制剂Cyclopamine,细胞增殖-毒性实验（CCK8）检测其对ANSCs增殖的影响;细胞划痕实验检测其对ANSCs迁移能力的影响;实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Sonic Hedgehog（Shh）信号通路的细胞表面Patched蛋白（Ptch1）、G蛋白偶联受体Smo、转录因子（Gli1）以及神经导向因子（Slit1）和脑源性神经营养因子（BDNF）表达量的变化。结果 Smo激动剂PM对ANSCs的增殖有明显促进作用,48 h后PM组ANSCs的吸光度明显升高（P<0.01）;PM可以促进ANSCs的迁移,48 h后的PM组ANSCs划痕面积显著减小（P<0.01）;Smo抑制剂CPM对ANSCs的增殖和迁移均有显著的抑制作用;RT-PCR实验显示PM组细胞中的Ptch1、Smo、Gli1及Slit1、BDNF表达水平均明显增加（P<0.05）。结论 调控Smo的活性可以促进或抑制成年神经干细胞的增殖和迁移,其作用机制可能与调节BDNF和Slit1的表达有关。     

Nedd4调节Hedgehog信号通路的研究

Hedgehog信号通路在胚胎发育及胎儿组织自稳中发挥重要作用。异常的Hedgehog激活可导致许多癌症的发生。为了研究Hedgehog信号通路中新的调节因子,我们利用Smoothened (Smo)的C末端作为诱饵采用酵母双杂交筛查方法,鉴定出Nedd4蛋白与Smo具有相互作用。研究显示在转染的HEK293细胞中Nedd4与Smo结合,另外,Nedd4的过表达会增加Gli 荧光酶素报告基因的活性,反之,Nedd4的失表达可以使Gli依赖的Hedgehog信号通路激活消失。总之,我们的研究显示Nedd4正性调节Hedgehog信号通路,而且为癌症的治疗中抑制Hedgehog信号通路提供了一个潜在的作用靶点。     

干预Hedgehog信号对肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的:探讨Hedgehog(HH)信号通路的活化和抑制对肾小管上皮细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法:根据干预措施将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分为对照组、活化组(10μg/L Shh)和干预组(10μg/L Shh加5μmol/L环杷明)。细胞培养24 h后,细胞免疫荧光染色检测HH信号关键分子Ptch1、Smo和Gli1,以及细胞增殖标志物PCNA的表达,real-time RT-PCR检测Ptch1和Smo m RNA的表达。结果:免疫荧光染色显示,对照组细胞维持一定的增殖状态,HH信号活性较低,PCNA表达水平较低;当外源性重组蛋白Shh活化NRK-52E细胞24 h后,Smo和Gli1 m RNA和蛋白表达显著升高,Ptch1的表达显著下调,这提示Shh可激活HH信号(P<0.05)。在此过程中,PCNA表达水平显著升高,NRK-52E细胞数量增加,同时伴随细胞形态的改变;在Shh的基础上加入环杷明干预后,HH信号被抑制(P<0.05),PCNA表达下降,NRK-52E细胞增殖被抑制,出现凋亡或坏死。结论:HH信号与肾小管上皮细胞的增殖密切相关。通过药物调控HH信号的活化,可影响PCNA的表达,进而影响细胞增殖效应。     

Sonic Hedgehog信号通路分子Shh和Smo在肝细胞肝癌中表达与意义

目的:探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路分子Shh和Smo在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及其意义?方法:用RT-PCR方法检测10例HCC组织及相应癌旁组织和肝癌细胞系HepG2?Huh7中Shh?Smo mRNA的表达?采用免疫组化方法检测30例肝癌组织及10例正常肝组织中Shh?Smo蛋白的表达?结果:RT-PCR结果显示HCC组织中Shh?Smo mRNA的表达率显著高于癌旁组织(P < 0.05);Shh?Smo mRNA在Huh7中的表达强度高于HepG2,但两者间无显著性差异(P > 0.05)?免疫组化结果显示Shh?Smo蛋白在HCC组织中阳性率分别为63.3%(19/30)?76.7%(23/30);Smo蛋白的表达与肿瘤大小相关(P < 0.05)?Shh?Smo蛋白在正常肝组织中均无表达?结论:Shh和Smo在肝癌中高表达,表明SHH信号通路可能参与肝癌的发生,为肝癌防治提供新的依据?     

Shh、Gli1和MMP-9在胃癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨胃癌组织中Hedgehog(Hh)信号通路分子(Shh和Gli1)与基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达以及临床意义.方法 采用免疫组织化学方法检测54例人胃癌组织、癌旁组织和30例正常胃黏膜组织中Shh、Gli1和MMP-9蛋白的表达.结果 胃癌组织中Shh、Gli1和MMP-9的阳性表达率分别为68.52％、61.11％和64.81％,明显高于癌旁组织(阳性表达率分别为27.78％、24.07％和22.22％)和正常组织(阳性表达率分别为36.67％、26.67％和33.33％)(P＜0.05);三者的表达均与胃癌患者性别、年龄、部位无关(P＞0.05);而与分化程度、浸润深度以及淋巴结转移相关(P ＜0.05);Shh、Gli1分别与MMP-9表达呈正相关.结论 Hedgehog( Hh)信号通路可能通过上调MMP-9的表达促进胃癌的侵袭转移.联合检测胃癌组织中Shh、Gli1和MMP-9蛋白水平,可作为胃癌预后的客观参考指标.     

前列腺癌患者Hedgehog信号通路相关蛋白的表达及其临床意义

目的研究Hedgehog(Hh)信号通路相关蛋白(Shh、Ptch和Gli1)在前列腺癌患者中的表达及其与疾病预后的关系。 方法取90例手术治疗的前列腺癌患者肿瘤组织及对应的癌旁正常组织标本,采用免疫组化法测定Shh、Ptch和Gli1表达,分析其与临床病理特征的相关性,采用Cox回归模型研究前列腺癌患者术后复发转移的危险因素,并利用Kaplan-Meier生存曲线分析Shh、Ptch和Gli1与无进展生存期的关系。 结果前列腺癌组织中Shh、Ptch和Gli1蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织(P＜0.05)。不同Shh、Ptch和Gli1蛋白表达的前列腺癌患者的临床分期、Gleason评分、合并骨转移的分布差异具有统计学意义(P＜0.05)。Cox回归分析显示,Hh信号通路相关蛋白表达阳性是术后复发转移的独立危险因素(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示,Hh信号通路相关蛋白表达与前列腺癌患者无进展生存期呈负相关(P＜0.05)。 结论前列腺癌患者肿瘤组织中Hh信号通路相关蛋白表达与肿瘤分化程度密切相关,对前列腺癌患者预后评估具有一定价值。     

右归丸含药血清对骨髓间充质干细胞Hedgehog信号通路影响

目的:探究右归丸治疗骨质疏松症的疗效机制是否与激活Hedgehog信号通路,促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨分化有关,从而为右归丸预防治疗骨质疏松提供依据。方法:体外分离培养大鼠BMSCs,将SPF级大鼠随机分为4组,正常组、诱导液组、福善美组、右归丸组,对大鼠进行灌胃5 d。制备含药血清,并观察上述4组含药血清对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响。酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞中的音猬因子(Ssonic hedgehog,Shh)、12次跨膜蛋白(Ptched,Ptc)、Gli家族锌指蛋白-1(Gli family zinc finger-1,Gli-1)。结果:与正常组和阳性药物组及诱导液组相比,右归丸组的蛋白表达水平明显上升。结论:①Hedgehog信号通路的Shh、Ptc、Gli1的变化可能引起骨质疏松症;②右归丸可以诱导BMSCs内Shh、Ptc、Gli1蛋白的表达;③右归丸能够有效治疗骨质疏松,这种作用可能通过Hedgehog信号通路来实现。     

Hh信号通路抑制剂Cyclopamine对Hela细胞增殖、侵袭迁移的影响

目的:研究Hh信号通路抑制剂Cyclopamine作用Hela细胞后Gli1、FoxM1、上皮间质转化(EMT)过程相关标记物表达的改变及对其增殖、侵袭迁移能力的影响,探究Gli1、FoxM1、EMT过程的可能作用关系,以期为宫颈癌的分子靶向治疗提供多个靶点。方法:采用实时定量RT-PCR、Western Blot技术检测Hela、Siha细胞系Hh信号通路中Shh、Ptch1、Smo的表达情况,选择Hh信号通路表达较高的Hela细胞系作为后续实验细胞,利用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测不同浓度Cyclopamine作用Hela细胞后其增殖能力的改变;采用Transwell小室试验检测Hela细胞侵袭、迁移能力的改变,并采用实时定量RT-PCR、Western Blot技术检测Gli1、FoxM1、EMT过程标记物的表达情况。结果:(1)Hela细胞中Hh信号通路成分(Shh、Ptch1、Smo)在mRNA水平显著高于Siha细胞(P<0.01),且相应蛋白的表达强度也高于Siha细胞;(2)Cyclopamine对Hela细胞增殖的抑制作用具有时间、剂量依赖性;(3)Cyclopamine作用Hela细胞48h后,细胞侵袭试验显示,实验组侵袭细胞数较对照组明显降低(P<0.01)。细胞迁移试验显示,实验组细胞迁移细胞数较对照组明显降低(P<0.01);(4)Cyclopamine作用Hela细胞48h后,实验组Gli1、FoxM1、Vimentin在mRNA水平的表达显著低于对照组(P<0.05),且相应蛋白的表达强度也低于对照组;E-cadherin在实验组中mRNA层面的表达显著高于对照组(P<0.05),且相应蛋白的表达强度也高于对照组。结论:抑制Hh信号通路可显著降低Hela细胞系增殖、侵袭迁移能力,FoxM1很可能是Hh信号通路末端转录因子Gli1的下游靶基因,且其对宫颈癌细胞系增殖、侵袭迁移的作用很可能是通过EMT实现的。     

Hedgehog通路介导的白藜芦醇对胰腺癌Miapaca-2细胞增殖与凋亡的影响

目的:体外观察白藜芦醇(Res)对人胰腺癌Miapaca-2(PC-2)细胞生长及Hedgehog信号通路的影响。方法:3种不同浓度的白藜芦醇分别体外作用人胰腺癌PC-2细胞,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖;同时通过实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和Western bolt分析测定PC-2细胞Ihh、Ptch和Smo mRNA及蛋白的表达。结果:3个浓度组白藜芦醇可显著促进胰腺癌PC-2细胞凋亡,且呈浓度依赖关系,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);其中高浓度组白藜芦醇的集落个数明显减少,与5-FU组比较差异有统计学意义(P<0.01);3个浓度组白藜芦醇对胰腺癌PC-2细胞的增殖呈明显抑制作用,且抑制效应具有浓度效应和时间效应;与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);3个浓度组白藜芦醇作用于PC-2细胞后,Hedgehog信号通路中Ihh、Ptch、Smo蛋白和mRNA水平低于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),表达水平随着白藜芦醇浓度增加而逐渐降低。结论:白藜芦醇可促进胰腺癌PC-2细胞凋亡,抑制其增殖,其机制可能与其抑制Hedgehog信号通路中Ihh、Ptch和Smo的表达相关。     

Shh、Gli1、Foxm1蛋白在胃癌中的表达及临床意义

目的 探讨Hedgehog信号通路分子Shh及其下游转录因子Gli1与Foxm1在胃癌中的表达,进一步阐明其与临床病理特征的关系.方法 应用免疫组化法检测70例胃癌和30例胃正常黏膜中Shh、Gli1和Foxm1的表达,并分析胃癌组织中Shh、Gli1、Foxm1蛋白表达与临床病理因素的关系及其相关性.结果 Shh、G...     

黄芩素通过Smad信号通路抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞活化

探讨黄芩素是否通过Smad信号通路抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞(HSC-T6)活化。用不同浓度黄芩素和/或5 μg/L的转化生长因子β1(TGF-β1)刺激细胞,用免疫细胞化学法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,用Western blot法检测p-Smad 2、p-Smad 3表达。结果显示,TGF-β1可使HSC-T6细胞α-SMA表达增加,黄芩素预处理后,可剂量依赖性地降低α-SMA表达;TGF-β1可使HSC-T6细胞p-Smad 2和p-Smad 3的蛋白水平增加,500 nmol/L黄芩素预处理并未显著降低p-Smad 2和p-Smad 3的蛋白水平。结果说明,黄芩素可抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞活化,其机制与TGF-β1/Smad信号通路无关。     

Shh信号通路变化对小鼠胚胎腭突间充质细胞自噬的影响

目的：探讨地塞米松（dexamethasone,DEX）及平滑激动剂（smoothened agonist,SAG）干预下小鼠胚胎腭突间充质细胞Shh信号通路改变后,小鼠胚胎腭突间充质细胞自噬状态的变化。方法：体外培养胚胎14.5 d的C57BL/6J小鼠胚胎腭突间充质细胞,根据干预方式分为4组：对照组、地塞米松组（DEX组）、地塞米松+SAG组（DEX+SAG组）、单独SAG干预组（SAG组）。通过透射电镜观察各组细胞自噬体或自噬溶酶体的数量,Western blot检测各组Shh、Ptch1、Smo、Gli3A/R、Cyclin D1及自噬标志物LC3Ⅱ/Ⅰ和P62、Beclin-1的表达情况。结果：电镜结果显示,对照组和DEX组中自噬体/自噬溶酶体的数量无明显差异,而SAG干预后可观察到大量自噬体/自噬溶酶体。Western blot结果显示,与对照组相比,P62、Ptch1、Smo、Gli3A/R、CyclinD1在DEX组中明显降低（P<0.05）,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达无明显变化（P>0.05）;DEX+SAG组及SAG组中Ptch1、Smo、Gli3...     

Sonichedgehog信号通路中Gli蛋白活化和 肿瘤相关性的研究进展

摘要:Hedgehog(Hh)信号通路在脊椎动物的各种生理过程中都发挥着重要作用,包括细胞的生长和分化等。Sonic hedgehog(Shh)信号通路是 Hh信号通路中研究最深入的成员之一,主要在真核生物中发挥生物学功能。国内外多项研 究表明,人类各种肿瘤的发生发展都涉及Shh信号通路,多种因素引起的Shh异常活化会导致人体系统多种恶性肿瘤的 发生。神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白(glioma-associatedoncogenehomologue,Gli)是 Shh信号通路的关键成员之一, 参与调控肿瘤的发生和进展。该文总结了Shh信号通路中 Gli蛋白激活的分子机制及其在肿瘤发生发展中的作用,并 讨论了 Gli蛋白与肿瘤干细胞的相互作用,以及 Gli蛋白靶向治疗相关肿瘤的新思路。     

Hedgehog信号通路效应蛋白在大肠癌组织中的表达及意义

目的 探讨Hedgehog(Hh)信号通路中效应蛋白在人大肠癌、正常大肠组织中的表达及与病理特征的相关性.方法 采用免疫组化方法检测60份大肠癌和20份正常大肠组织中Shh、Ptchl和Glil蛋白的表达,并与临床病理因素进行相关性分析.结果 Shh、Ptchl和Glil蛋白在大肠癌组织中均为高表达,Shh、Ptchl蛋白与Gli1蛋白的表达呈正相关.结论 综合检测Shh、Ptchl和Gli1 蛋白对大肠癌的诊断、治疗及预后有较明显的指导意义.