抗人粒细胞集落刺激因子单克隆抗体的研制

应用杂交瘤技术，用重组人Ｇ－ＣＳＦ（ｒｈＧ－ＣＳＦ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，然后将其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１融合，成功地获得了多种能够分泌抗ｒｈＧ－ＣＳＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交癌细胞。对其中的２株杂交瘤细胞２Ａ６和２Ｃ２分泌ＭｃＡｂ的研究表明，它们能够特异性地和ｒｈＧ－ＣＳＦ结合，而与重组的人ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－２α和ＴＮＦ细胞因子无交叉反应，为抗Ｇ－ＣＳＦ特异性ＭｃＡｂ。这些杂交瘤细胞经反复冻存和复苏后，仍能稳定地分泌ＭｃＡｂ。     

重组人粒细胞集落刺激因子在恶性肿瘤化疗中的应用

目的评价基因重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ｒｈＧ－ＣＳＦ）对恶性肿瘤化疗后白细胞（ＷＢＣ）和中性粒细胞（ＡＮＣ）减少的防治作用。方法全组５２例；对照组２０例，为化疗后ＷＢＣ计数在１．０×１０９／Ｌ～３．０×１０９／Ｌ之间者，采用利血生、鲨肝醇等一般性治疗及中医药治疗；治疗组３２例，为化疗后ＷＢＣ计数＜３．０×１０９／Ｌ者，其中包括ＷＢＣ计数＜１．０×１０９／Ｌ，采用一般性治疗加ｒｈＧ－ＣＳＦ治疗。结果治疗组ＷＢＣ和ＡＮＣ在治疗后恢复至正常所需时间明显小于对照组（Ｐ＜０．０１）。结论ｒｈＧ－ＣＳＦ可明显缩短ＷＢＣ和ＡＮＣ降至正常以下持续的时间，促进早日恢复，使化疗可以如期进行     

重组人血管抑素的纯化和生物活性鉴定

目的：纯化大肠杆菌表达的重组人血管抑素（ｒｈＡＧＮ）并鉴定其抗血管生成生物活性。方法：通过超声破碎、包涵体洗涤、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ 凝胶过滤层析等步骤初步纯化ｒｈＡＧＮ,Ｌｏｗｒｙ法测定蛋白浓度,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析观察其纯度;应用 ＭＴＴ法观察在终浓度为 ０．１～３．０ ｍｇ／Ｌ范围内 ｒｈＡＧＮ对 １０ μｇ／Ｌ ＥＧＦ刺激的人真皮微血管内皮细胞系ＨＤＭＥＣ的增殖抑制活性;以ＰＢＳ为对照（ｎ＝５）,应用原位鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）技术观察１００ μｇ／只（ｎ＝５）和２００ μｇ／只（ｎ＝５）ｒｈＡＧＮ作用７２ ｈ对３０ｎｇ ｂＦＧＦ 诱导的鸡胚ＣＡＭ毛细血管生成的抑制作用。结果：①ｒｈＡＧＮ电泳纯度达到 ９６％,总回收率为 ６１．７％;②ｒｈＡＧＮ对 ＨＤＭＥＣ细胞增殖的最大抑制剂量约为 ２．０ ｍｇ／Ｌ,抑制率约９２．３％．半数最大抑制剂量在１．０ ｍｇ／Ｌ附近;③１００ μｇ／只和２００ μｇ／只ｒｈＡＧＮ组鸡胚ＣＡＭ 载样滤纸片下毛细血管数目分别为７９±２３条和３７±１１条,两组间比较差异显著（Ｐ＜０．０５）;与对照组（１４５±３６条）相比,均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。结论：ｒｈＡＧＮ达到了较高的电泳纯度,     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

重组人粒细胞集落刺激因子在治疗急性髓细胞白血病中的应用

目的：报告重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）在急性细胞白血病（ＡＭＬ）治疗中的应用及其疗效观察：方法应用中等剂量、短疗程（３－５天）ｒｈＧ－ＣＳＦ治疗ＡＭＬ２８例,并与同期未用ｒｈＧ－ＣＳＦ治疗的ＡＭＬ２８例进行比较。结果：ｒｈＧ－ＣＳＦ能显著缩短化疗后中性粒细胞计数（ＡＮＣ）的低下期及感染的持续时间,同时能明显减少化疗后的输血用量。     

国产重组人粒细胞集落刺激因子治疗化疗后粒细胞减少症的临床疗效观察

目的：评价国产重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）治疗肿瘤化学治疗后引起的粒细胞减少症的临床疗效和不良反应。方法：采用随机、自身交叉的对照方法观察了６０例恶性肿瘤化疗患者应用国产ｒｈＧＣＳＦ的效果。结果：国产ｒｈＧＣＳＦ具有明显的升高中性粒细胞作用,表现为：①合并使用ｒｈＧＣＳＦ周期（Ａ周期）ＷＢＣ最低值、中性粒细胞绝对计数（ＡＮＣ）最低值明显高于单纯化疗周期（Ｂ周期）;②Ａ周期ＷＢＣ＜２０×１０９／Ｌ、＜３０×１０９／Ｌ、＜４０×１０９／Ｌ持续天数显著缩短;ＡＮＣ＜０５×１０９／Ｌ、＜１０×１０９／Ｌ、＜１５×１０９／Ｌ、＜２０×１０９／Ｌ持续天数显著缩短;③Ａ周期化疗序日ｄ２１的ＷＢＣ值、ＡＮＣ值明显高于Ｂ周期;④Ａ周期化疗序日ｄ２１ＷＢＣ＜４０×１０９／Ｌ的病例数、ＡＮＣ＜２０×１０９／Ｌ的病例数明显少于Ｂ周期。使用国产ｒｈＧＣＳＦ不良反应轻微。结论：国产ｒｈＧＣＳＦ是一种安全有效的治疗粒细胞减少症的药物。     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

CyP A三类免疫球蛋白自身抗体测定方法的建立与临床应用

目的：利用基因重组技术、大肠杆菌表达人环孢菌素Ａ结合蛋白（ｒｈＣｙＰＡ），建立测定抗ＣｙＰＡ自身抗体的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），探讨抗ＣｙＰＡ抗体与临床疾病的关系。方法：重组菌可溶性蛋白经饱和硫酸铵盐析和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱层析，获取ｒｈＣｙＰＡ蛋白，用该纯化物作为抗原，方阵滴定，建立ＥＬＩＳＡ技术，对各类自身免疫病进行评估测定。结果：ｒｈＣｙＰＡ经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析，分子量为１８０００。在系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）患者中，发现有４０．３％的患者检出有抗ＣｙＰＡ自身抗体（５８／１４４），三类免疫球蛋白（Ｉｇ）中，又以ＩｇＧ类抗体检出率最为突出，为２８％（４０／１４４）；而其它自身免疫病患者抗ＣｙＰＡ抗体总体检出率为０％～１８．１％。结论：建立的检测抗ＣｙＰＡ抗体的ＥＬＩＳＡ法，敏感、特异、可半定量测定。抗ＣｙＰＡ抗体的存在似与ＳＬＥ的发病有关。     

Gastroscopic Observation of 22 Cases with Special Types of Early Gastric Cancer

ＧａｓｔｒｏｓｃｏｐｉｃＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆ２２ＣａｓｅｓｗｉｔｈＳｐｅｃｉａｌＴｙｐｅｓｏｆＥａｒｌｙＧａｓｔｒｉｃＣａｎｃｅｒ￥ＳｈｅｎＹｕｎｚｈｉ，ｅｔａｌ．ＡＣＴＡＡＣＡＤＥＭＩＡＥＭＥＤＩＣＩＮＡＥＮＡＮＪＩＮＧ，１９９４，１４（１）...     

AA和MDS的细胞因子治疗

目的：探讨重组人红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）和重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）治疗再生障碍性贫血（ＡＡ）和骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ－ＲＡ）的临床疗效。方法：ＡＡ１２例,ＭＤＳ－ＲＡ７例,均采用ｒｈＥＰＯ和ｒｈＧ－ＣＳＦ联合治疗。结果：ＡＡ患者贫血改善且不需输血者７例（５８％）;粒细胞增加者１１例（９１％）;血小板增加者４例（３３％）;ＭＤＳ－ＲＡ患者贫血改善且不需输血者３例（４２％）;粒细胞增加者６例（８５％）;血小板增加者２例（２９％）。结论：应用ｒｈＥＰＯ和ｒｈＧ－ＣＳＦ治疗ＡＡ和ＭＤＳ－ＲＡ确实一部分病例可取得一定的疗效,但其作用机制尚有待进一步研究和探讨     

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

Purification and renaturation of recombinant human interleukin-2-pseudomonas exotoxin (IL2-PE66(4GLU)) fusion protein.]

OBJECTIVE: To evaluate the effect of a novel approach for purification and renaturation of recombinant human interleukin-2-pseudomonas exotoxin (IL2-PE66(4Glu)) fusion protein. METHODS: A novel purification method established in our laboratory was adopted for the purification of the inclusion body, and after renaturation, recombinant human IL2-PE66(4Glu) fusion protein was purified by DEAE-Sepharose FF ion-exchange chromatography. RESULTS: The purity of the fusion protein that retain its biological activity was as high as 95%, and a recovery rate over 80% of the refolded IL2-PE66(4Glu) fusion protein was achieved. CONCLUSION: The purification and refolding method for inclusion body adopted in this study is simple and practical, which lays the foundation for a large-scale production of the fusion protein.     

重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

人脂联素球状结构域的表达、纯化和功能鉴定

目的表达和纯化人脂联素（adiponectin,APN）球状结构域并观察其生物学活性.方法用PCR方法复制人脂联素球状结构域（globular domain of adiponectin,gAPN）的cDNA,并克隆于pET28a（＋）原核表达载体中.将重组表达质粒pET28a（＋）-gAPN转化大肠埃希菌BL21（DE3）,37℃培养至A600达到0.6时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白的表达.细菌经超声破菌,得到粗提的包涵体洗涤变性后经镍柱亲和层析柱一步纯化,获得纯化的gAPN重组蛋白,复性后冻干保存.然后,用链佐星（streptozocin,STZ）诱导的小鼠高血糖模型检测其生物活性.结果IPTG诱导后有Mr约为17 000大小的目的蛋白表达,免疫印迹结果进一步表明,其具有人gAPN的抗原性.表达蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%以上,表达产物经变性、纯化、复性,可获得纯度90%以上的目的蛋白.该重组蛋白能够降低STZ诱导的小鼠高血糖模型的血糖水平.结论在大肠埃希菌BL21（DE3）中成功表达了人gAPN蛋白,经变性、纯化、复性后得到具有生物学活性的蛋白.     

抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体文库的筛选及可溶性抗体的制备

目的 制备高活性的可溶性抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体。方法 采用ＥＬＩＳＡ等方法从文库中筛选高活性的抗体，再通过大肠杆菌ＨＢ２１５１使其以可溶性抗体形式表达，结果 获得了可溶性抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体，结论 建立一种制备抗人血管生长素抗体的方法，该抗体在肿瘤的临床治疗上具有广阔的应用前景。     

重组人瘦素的分离纯化

目的：探索毕赤酵母表达的人瘦素的非亲和层析纯化方法。方法：采用强阴离子交换柱(Sepharose Qfast flow)和疏水层析柱(Phenyl Sepharose 6 fast flow)在pH7．5的条件下进行纯化。结果：经Q柱一步纯化后，产物纯度由42．3％到达89．6％，随后通过疏水层析纯化后，产物纯度达到96．2％。经SDS—PAGE证实为单一蛋白条带。结论：通过上述手段已成功分离纯化得到纯度较高的由毕赤酵母表达的重组人瘦素。     

一种简便、特异地获取目的基因片段并克隆的好方法

目的：以简便、特异的方法获取目的基因片段用于体外的构建重组体。方法：以引物互以的聚合酶链反应合成的目的基因片估该目的基因片段经限制性内切段经限制性内切核酸酶水解后被连接至克隆载体。克隆后经筛选并电泳鉴定。结果：以聚合酶链反应合成了目的基因片段，并获得相应重组体。经鉴定。该重组体确目的基因片段序列。结论：成功利用聚合酶链反应获得目的基因片段并获得相应重组体。以作为进一步研究的基础。     

γ-突触核蛋白的克隆、表达及纯化

目的对γ-突触核蛋白(synuclein)基因进行克隆,并对其表达及纯化条件进行优化。方法根据GenBank中γ-突触核蛋白的基因序列,设计PCR引物,从人脑cDNA文库中扩增γ-突触核蛋白的编码DNA序列,将其克隆至pGEX-6p-1载体中,构建重组质粒,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;对培养温度、IPTG的用量、诱导时间等条件进行了优化;用SDS-PAGE和质谱分析表达的目标蛋白;用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤纯化目标蛋白。结果γ-突触核蛋白在大肠杆菌中高效、可溶性表达,经质谱鉴定及SDS-PAGE分析,表达产物为γ-突触核蛋白。经过纯化,得到纯度高达98%的γ-突触核蛋白。结论成功地在大肠杆菌中高效表达了γ-突触核蛋白,并建立了纯化工艺,得到高纯度的重组蛋白,为进一步研究γ-突触核蛋白的晶体结构、生物学活性及功能,探讨其在肿瘤中的发病机制奠定了基础。     

脲梯度体积排阻色谱复性并同时纯化rhSCF

目的:用脲梯度体积排阻色谱(SEC)复性并同时纯化在大肠杆菌中高表达的人干细胞因子.方法:采用脲梯度SEC,根据蛋白质与小分子物质分离过程的迁移速度不同的原理,在色谱过程中通过脲浓度的线性梯度洗脱方式脱除变性剂脲而达到蛋白复性并同时纯化.结果:用脲梯度SEC复性重组人干细胞因子(rhSCF)能够使复性蛋白的产率提高,色谱过程中洗脱长度、流速以及蛋白浓度的变化对蛋白复性效率都有不同的影响.结论:用脲梯度SEC复性rhSCF可以使复性产率提高,其质量回收率从35.2%提高到51.4%.     

从基因重组大肠杆菌分离纯化重组人白介秦－2

从ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭ５２４８（Ｂｉｏ２７５ｃＩ８５７ＨＩ）中，经发酵培养，离心，超声破碎，溶解，二次凝胶过滤层析，复性处理及冷冻干燥，一次获得了３６ｍｇ较高纯度的重组人白介素－２。