实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

实时荧光定量PCR检测0139群霍乱弧菌研究

目的:利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测0139群霍乱弧菌的定量方法.方法:选取0139群霍乱弧菌糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记.对PcR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定.结果:本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定0139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例0139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致.结论:本文建立的检测0139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为0139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段.     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

非O1非O139群霍乱弧菌多重PCR和SYBR Green实时PCR检测方法的建立

目的建立检测非Ol非0139群霍乱弧菌的多重PCR和SYBRGreen实时PCR方法。方法分别以霍乱弧菌的外膜蛋白基因(ompW)、01和0139群O抗原编码基因(咖)设计引物,建立多重PCR和SYBRGreen实时PCR方法,评价两种方法检测非01非0139群霍乱弧菌的特异性、重复性和一致性及最低检测菌量。结果建立了检测非01非0139群霍乱弧菌的多重PCR和SYBRGreen实时PCR方法,根据特异性条带(多重PCR)和特异性熔解温度(SYBRGreen实时PCR),两种方法均能特异性检测非01非0139群霍乱弧菌,并能鉴别其他弧菌(5种)和肠道杆菌(3种);两种方法的最低检测菌量分别为7×10⁴ cfu／ml(多重PCR)和7×10²cftdml(SYBR Green实时PCR),差异有统计学意义(P<0.05);对实时PCR的重复性检测,批内变异系数(CV)为 0.22％～0.92％,批间cv为0.27％～1.41％;经370株非01非0139群霍乱弧菌的检测,两种方法的一致性均为100％。结论建立的两种方法其特异性、敏感性及重复性均好,可适用于不同条件下非0l非0139群霍乱弧菌的检测和鉴定。     

实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（RT—PCR）方法并进行水体标本的检测评价。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物，利用SYBRGreen染料，建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT—PCR方法，对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价。采集河口水标本增菌后进行RT—PCR检测，与分离培养方法比较评价实际应用价值。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT—PCR方法，根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增；对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增；RT—PCR检测524份河口水体标本的增菌液，与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性，并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。结论以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT—PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查。     

TaqMan荧光PCR技术在霍乱弧菌毒力基因检测中的应用

目的利用快速灵敏的TaqMan实时荧光定量PCR方法检测分离到的81株霍乱弧菌的毒力基因。方法根据霍乱弧菌毒力基因ctxAB和zot分别设计特异性引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上对分离到的菌株进行毒力基因的检测。结果81株霍乱弧菌中,有20株菌（24.7%）产CT毒素,来自于外环境的有19株;25株菌（30.9%）携带zot毒素基因;5株菌（6.2%）CT阴性而zot毒素基因阳性。使用这两套系统检测其他肠道致病菌无交叉反应,检测限可达到2～20cfu/ml。结论本研究所采用的TaqMan荧光定量PCR检测霍乱弧菌毒力基因灵敏度高,特异性好,为今后霍乱日常监测和疫情应急处理提供快检的平台。     

多重荧光定量PCR同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法研究

目的:利用多重荧光定量PCR技术检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌。方法:以溶藻弧菌等17种相关试验菌株做特异性检测;并将标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。结果:与传统的检测方法相比,该方法有很好的特异性且灵敏度高,检测时间短并可节省人力,具有快速方便等优点。结论:适用于样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的快速检测。检测限分别为:霍乱弧菌为280 cfu/ml;副溶血性弧菌为:100 cfu/ml;创伤弧菌为:450 cfu/ml。     

TaqMan荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立

目的：建立特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测霍乱弧菌。方法：根据GenBank上的霍乱毒素（cholera toxin，CT）基因序列，在其保守区域设计特异性引物与TaqMan探针，并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化，同时验证方法的特异性、敏感性和重复性。结果：本方法对霍乱弧菌的检测具有高度特异性，与副溶血性弧菌、沙门菌、志贺菌、变形杆菌、大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应；检测灵敏度达10cfu／ml；反应体系具有很高的稳定性；整个操作过程仅需2h。结论：本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速．适用于霍乱弧菌的日常监测和爆发疫情的应急诊断。     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

实时荧光定量PCR快速检测腺病毒方法的建立与评价

目的建立针对人腺病毒Hexon基因的实时荧光定量Taq Man PCR检测方法,用于腺病毒感染的早期诊断及病毒核酸定量分析。方法根据人腺病毒Hexon基因高度保守区设计引物和Taq Man探针,建立人腺病毒实时荧光定量Taq Man PCR快速检测方法。对方法的灵敏度及特异性进行评价;选取3个浓度的标准品,进行5次重复检测,对方法的重复性进行验证;用该方法对90份临床标本进行检测。结果建立的检测方法对人腺病毒的检测与其它呼吸道病原无交叉反应;检测灵敏度为10拷贝/μl;对103、104、105拷贝/μl 3个浓度标准品分别进行5次重复检测,其Ct值的变异系数均小于5%。对临床90份发热病例的咽拭子标本检测的腺病毒阳性率为90%,与普通PCR检测法的结果(90%)一致;检测准确率达100%。结论本研究建立的Taq Man荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度和重复性均好,适用于人腺病毒的日常监测和暴发疫情的应急诊断。     

一起食源性O139群霍乱弧菌引起暴发疫情调查及其扑疫措施

目的分析某镇一起食源性O139群霍乱弧菌引起暴发疫情发生的原因、流行病学特征及扑疫措施,为政府制定相关政策和进一步采取防制措施提供科学依据。方法采用流行病学个案调查方法对此起疫情的所有就餐者开展调查。结果经流行病学调查、病原体检测和临床表现证实,此起疫情系宴席聚餐中鲜活甲鱼所携带的O139群霍乱弧菌污染食品所致,通过启动突发性公共卫生事件应急机制,迅速采取控制措施,此起疫情迅速得到控制,无二代病例和死亡病例。结论加强农村食品卫生安全管理,严格餐饮许可制度,广泛开展健康教育与健康促进工作,提高农村居民自我防病防疫意识,对防止食源性肠道传染病暴发疫情再发生具有重要意义。     

O139群霍乱弧菌L型变异和诱导实验的观察及致病性的探讨

[目的]探讨O139群霍乱弧菌L型变异及其与ElTor型的R型血清的关系。[方法]2002～2005年,我们采用酚肉汤传代、抗生素、胆盐和蒸馏水等实验室诱导方法进行观察。[结果]发现O139群霍乱弧菌6菌株经上述方法诱导可发生L型变异,其菌落特征和菌体形态均与L型的描述相符。[结论]实验结果证实O139群霍乱弧菌可诱导成L型,通过与O1群的R型血清凝集状况,表明其L型菌株未见到抗原的完全消失,其变异过程与ElTor弧菌相似,关系密切,推测自然界中亦存在O139群霍乱弧菌L型,且仍具有致病性。     

广西首次分离 O139群霍乱弧菌的病原学特征

目的 了解O139群霍乱弧菌的病原学特征。方法 采用经典的微生物学、噬菌体-生物分型方法进行生化、药敏和流行菌株的分型,并用家兔肠段结扎方法进行霍乱肠毒素检测。结果 4株菌与O139群霍乱诊断血清发生强凝集反应。与O1群多价血清不凝集;在庆大琼脂平板上菌落较O1群霍乱弧菌混浊、隆起。霍乱肠毒素检测均为中等毒力,对氟哌酸、丁胺卡那霉素敏感,对9种抗菌药物耐药。结论 霍乱肠毒素检测为中等毒力,具备引起流行的能力,为流行株。因此加强监测,及时做好防治措施十分必要。     

龙泉市首例O139群霍乱弧菌耐药性及毒力基因携带情况研究

目的：研究龙泉市首例O139群霍乱弧菌耐药性及毒力基因携带情况。方法：运用药敏试验及PCR方法．分要该霍乱弧菌的耐药性以及携带ctxA、tcpA毒力基因的情况。结果：该O139群霍乱弧菌对庆大霉素等9种抗生素多重耐药：仅对丁胺卡那、诺氟沙星和环丙沙星敏感；该O139群霍乱弧菌携带ctxA、tcpA毒力基因。结论：在对O139群霍乱弧菌引起霍乱的防治工作中应密切监测其耐药性以及携带毒力基因的情况。     

杭州市O139群霍乱弧菌耐药变迁及毒力基因携带

目的 研究杭州市1994～2003年分离的O139群霍乱弧菌耐药性变迁以及携带ctxA、tcpA毒力基因的情况。方法 运用K—B法和PCR，检测90株O139群霍乱弧菌对抗生索的敏感性以及是否携带ctxA、tcpA毒力基因。结果 90株O139群霍乱弧菌中无丁胺卡那耐药的菌株，13株对诺氟沙星和环丙沙星耐药；对氨苄青霉索、复方新诺明分别有5年和6年的耐药率为100％；2002、2003年耐药谱增加到7种。87．87％的O139群霍乱弧菌同时携带ctxA、tepA毒力基因。结论10年来分离自杭州的O139群霍乱弧菌的耐药情况日益严重；O139群霍乱弧菌是否携带ctxA、tcpA毒力基因在对抗生素敏感性方面差异有统计学意义。     

与O139霍乱弧菌血清交叉凝集的麦氏弧菌

目的：对基层实验室上送的6株疑似O139霍乱弧菌进行检测及研究。方法：参照1999年《霍乱防治手册》第五版及相关资料进行检测。结果：该6株菌均系与O139霍乱弧菌血清有交叉凝集的麦氏弧菌。结论：该批菌株不是O139霍乱弧菌。而是麦氏弧菌。     

2009年通海县一起食源性O139霍乱暴发疫情的调查与应急处置

[目的]总结O139霍乱疫情应对经验,为今后的霍乱防治和处置提供借鉴。[方法]对2009年1月在玉溪市所属通海县四街镇四寨村发生一起霍乱暴发疫情,从病例的发现、确诊、报告、现场调查与处理、技术应对与行政应对等方面进行分析。[结果]在所有参宴的639人中,通过粪便或肛拭子检验,结合临床症状,确诊O139型霍乱病例20例（其中实验室确诊17例,临床诊断3例）,罹患率为3.13%;检出O139型霍乱弧菌健康带菌者27人,带菌率为4.23%。未发生二代病例、无死亡病例,疫情在1周内完全控制。检测霍乱病例和带菌者的密切接触者228人,检测当地未参加丧宴的67例腹泻病例标本,检测暴发点外环境标本432份,均未检出霍乱弧菌。条件Logistics回归分析结果,丧宴提供的煮萝卜是发病/带菌的危险因素,OR值为3.71。[结论]这是一起由O139霍乱弧菌引起的输入性食源性霍乱暴发疫情,由于发现、诊断、报告及时,应急处置措施得当,疫情得到快速彻底控制。     

重庆市01群霍乱菌株耐药性研究

目的了解198442005年重庆市01群霍乱弧菌的耐药性和耐药性的变迁。方法采用K-B法检测72株01群霍乱弧菌（小川型26株,稻叶型46株）对16种抗菌药物的敏感性。结果重庆地区01群霍乱弧菌对复方新诺明耐药、痢特灵和链霉素的耐药严重,耐药率分别为20.83％（15／72）、56.94％（41／72）和30.56％（22／72）,小川型和稻叶型的耐药性不同。人群分离株对丁胺卡那、庆大霉素、妥布霉素、氨苄西林、新霉素和强力霉素敏感,末发现耐药菌株。但05年分离的两株环境分离株具有较高的耐药性。结论未发现重庆市01群霍乱弧菌人群分离株的耐药性有明强改变,但与一些地区报道的耐药性有明显的不同,这种地区差别和重庆市01群不同血清型的耐药性的差别有待于进一步研究。     

O139群霍乱弧菌L型诱导实验观察

目的：探讨O139群霍乱菌的L型变异。方法：采用抗生素,胆盐和蒸馏水实验室诱导方法进行观察,结果：发现O139群霍乱弧菌MO45菌株经上述3法诱导可发生L型变异,其菌落特征和菌体形态均与L型的描述相符,结论：实验结果证实O139群霍乱弧菌可诱导成L,其变异过程与ElTor弧菌相似,检测自然界中亦存在O139群霍乱弧菌的L型。