实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（RT—PCR）方法并进行水体标本的检测评价。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物，利用SYBRGreen染料，建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT—PCR方法，对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价。采集河口水标本增菌后进行RT—PCR检测，与分离培养方法比较评价实际应用价值。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT—PCR方法，根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增；对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增；RT—PCR检测524份河口水体标本的增菌液，与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性，并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。结论以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT—PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查。     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

多重PCR与PCR-荧光探针法检测外环境霍乱弧菌的比较研究

目的：对比多重PCR与PCR-荧光探针法从外环境中直接检测霍乱弧菌的效果。方法：收集40份水样和40份水产品样本,再以20份已知特性菌株作对照。将上述样本和菌株进行培养后提取模板,分别进行多重PCR和PCR-荧光探针法检测。结果：两种方法均从40份水样中检出14份非O1非O139群霍乱弧菌,两种方法均能从40份水产品中检出29份O1群霍乱弧菌及3份非O1非O139群霍乱弧菌。以上检出霍乱弧菌均可经血清学试验证实。20份已知特性样本两种方法均鉴定无误,最低检出限均为10^2cfu/ml。结论：两种方法灵敏度和特异度均极高,多重PCR方法因能同时进行致病力的初步判断,检验速度相对较快,成本较为经济而更为实用。     

双重套式PCR方法在霍乱弧菌外环境监测中的应用

目的 建立一种能够检测O1群和O139群霍乱弧菌的套式聚合酶链反应方法,并应用于外环境水体标本的监测.方法 根据GenBank发表的O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的序列,运用DNAStar Primer Select软件各自设计6条引物,检测不同引物组合的特异性,建立双重套式PCR方法同时检测O1群和O139群霍乱弧菌;并对该方法进行敏感度、特异度、重复性及现场评价.通过比较套式PCR与常规PCR的DNA检出下限分析该方法的敏感度;对32份套式PCR阳性的水体样本(O1群11份,O139群21份)进行重复性评价,挑选部分阳性扩增产物进行测序,分析其与相应基因序列的一致性.结果 建立的检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重套式PCR体系,根据其扩增的片段大小能够区分O1群和O139群霍乱弧菌,而对其他弧菌DNA样品都未见特异性扩增;敏感度比常规PCR高15 000倍,且在多引物或者多模板共存于一个反应管的试验条件下,不会对敏感度产生干扰;32份套式PCR阳性的水样标本,经2次或3次套式PCR试验,结果显示该体系具有较好的重复性和一致性,阴性水样均无任何扩增产物,说明所用引物的特异性较好;序列分析表明扩增产物仅同霍乱弧菌相应的基因序列有100%的一致性.结论 本检测相应霍乱弧菌的双重套式PCR方法,具有灵敏、特异、快速、适合基层实验室的特点,可用于监测外环境水体中霍乱弧菌的存在及消长情况.     

实时荧光定量PCR检测0139群霍乱弧菌研究

目的:利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测0139群霍乱弧菌的定量方法.方法:选取0139群霍乱弧菌糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记.对PcR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定.结果:本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定0139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例0139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致.结论:本文建立的检测0139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为0139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段.     

胶体金免疫层析法检测水产品中O1群霍乱弧菌方法的建立与优化

〔目的〕研究了O1群霍乱弧菌免疫层析试纸的制备方法,通过对试纸材料的处理达到优化胶体金免疫层析体系的目的。〔方法〕建立了快速检测食品中O1群霍乱弧菌的胶体金免疫层析方法,并应用该方法对弧菌属、假单胞菌属及其他常见肠道致病菌,共29株进行检测,同时对180份水产品进行了样品添加试验,并用《出口食品中霍乱弧菌检验方法》(SN/T1022-2001)进行确证,全面评估了该方法的灵敏度、特异性、准确性等。〔结果〕该方法检测食品中O1群霍乱弧菌的灵敏度为105cfu/ml,与食品中常见的致病菌无交叉反应。该方法检测水产品中O1群霍乱弧菌的假阳性率为6.25%。〔结论〕该方法操作简便,灵敏度高,特异性强,准确性高,适用于食品的快速检测。     

一起 O139群霍乱疫情的实验室检测方法探讨

目的寻求适合 O139群霍乱疫情的病原学检测方法,以便为 O139群霍乱疫情的防控提供及时可靠的科学依据。方法用实时荧光定量PCR仪进行 O139群霍乱弧菌的核酸检测、常规分离培养、 O139群霍乱弧菌快速检测（胶体金法）。结果O。群霍乱弧菌的核酸检测阳性结果9份,且从这9份标本中分离到阳性菌株9株,有7份试样第一次增菌液胶体金法呈阳性反应,2份试样经过第二次增菌后胶体金法才呈阳性反应。结论实时荧光定量PCR法和胶体金法作为辅助检测 O139群霍乱弧菌的方法,可以较快得到初步结果,将两种方法与传统的分离培养鉴定相结合,可以保证结果的及时性和准确性。     

O1群霍乱弧菌胶体金法快速检测

目的 了解胶体金法检测O1群霍乱弧菌的特异性、灵敏度和实用性.方法 取患者粪便标本,先用碱性蛋白胨水35℃增菌6 h,然后用胶体金法进行检测,同时作霍乱弧菌常规培养,培养出细菌后用血清凝集法作为鉴别诊断O1群霍乱弧菌的金标准,用统计学方法对胶体金法诊断试验的评价指标进行计算..结果 700份样本中,常规法培养出O1霍乱弧菌105株,胶体金法试验阳性108株,经χ2检验,差异无统计学意义(χ2=0.24,P>0.05),表明胶体金法检测O1群霍乱弧菌与常规培养法检测结果之间的差异无统计学意义.胶体金法检测O1群霍乱弧菌诊塑试验的灵敏度为93.33%,特异性为98.32%,阳性预测值为90.74%,阴性预测值为97.18%,假阴性率为1.68%,假阳性率为6.67%.结论 胶体金法检测O1群霍乱弧菌特异性高(98.32%),灵敏度好,与常规培养法的一致性也较高,在快速检测O1群霍乱弧菌中有一定应用价值.     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

龙泉市首例O139群霍乱弧菌耐药性及毒力基因携带情况研究

目的：研究龙泉市首例O139群霍乱弧菌耐药性及毒力基因携带情况。方法：运用药敏试验及PCR方法．分要该霍乱弧菌的耐药性以及携带ctxA、tcpA毒力基因的情况。结果：该O139群霍乱弧菌对庆大霉素等9种抗生素多重耐药：仅对丁胺卡那、诺氟沙星和环丙沙星敏感；该O139群霍乱弧菌携带ctxA、tcpA毒力基因。结论：在对O139群霍乱弧菌引起霍乱的防治工作中应密切监测其耐药性以及携带毒力基因的情况。     

萍乡地区O139群霍乱弧菌TcpA基因序列分析

目的　探讨O13 9群霍乱JX株的TcpA基因序列 ,分析该株基因的特点。方法　采用PCR扩增技术 ,检测含O13 9群霍乱标本 ,对TcpA基因阳性者进行核苷酸序列测定 ,分析基因变异情况。结果　发现阳性标本中 ,对其中 1株进行了TcpA基因序列测定 ,该序列与TcpAET(O13 9株 )同源性为 10 0 % ,与EVC序列同源性为 96%。结论　本株与O1群 (EVC)遗传关系最近 ,对萍乡地区霍乱防治具有重要意义。     

O139群霍乱弧菌L型诱导实验观察

目的：探讨O139群霍乱菌的L型变异。方法：采用抗生素,胆盐和蒸馏水实验室诱导方法进行观察,结果：发现O139群霍乱弧菌MO45菌株经上述3法诱导可发生L型变异,其菌落特征和菌体形态均与L型的描述相符,结论：实验结果证实O139群霍乱弧菌可诱导成L,其变异过程与ElTor弧菌相似,检测自然界中亦存在O139群霍乱弧菌的L型。     

O139群霍乱弧菌L型变异和诱导实验的观察及致病性的探讨

[目的]探讨O139群霍乱弧菌L型变异及其与ElTor型的R型血清的关系。[方法]2002～2005年,我们采用酚肉汤传代、抗生素、胆盐和蒸馏水等实验室诱导方法进行观察。[结果]发现O139群霍乱弧菌6菌株经上述方法诱导可发生L型变异,其菌落特征和菌体形态均与L型的描述相符。[结论]实验结果证实O139群霍乱弧菌可诱导成L型,通过与O1群的R型血清凝集状况,表明其L型菌株未见到抗原的完全消失,其变异过程与ElTor弧菌相似,关系密切,推测自然界中亦存在O139群霍乱弧菌L型,且仍具有致病性。     

与O139霍乱弧菌血清交叉凝集的麦氏弧菌

目的：对基层实验室上送的6株疑似O139霍乱弧菌进行检测及研究。方法：参照1999年《霍乱防治手册》第五版及相关资料进行检测。结果：该6株菌均系与O139霍乱弧菌血清有交叉凝集的麦氏弧菌。结论：该批菌株不是O139霍乱弧菌。而是麦氏弧菌。     

O139霍乱弧菌在模拟水中自发L型变异及其意义探讨

目的：探讨O139霍乱弧菌在水中自发变异为L型菌的情况；方法：采用消毒模拟水样长期观察，定期培养，检查L型菌及原菌。结果：多次从模拟水中检出L型菌,但检出频率与不同水体、不同环境温度有关。结论：O139霍乱弧菌在水中可自发变异成L型菌，且与该菌在水体中的存活时间长短有关。     

O139群霍乱弧菌16S rRNA基因分型分析

[目的]研究北京市O139群霍乱弧菌的分子生物学特征。[方法]对北京市1998～2000年的30株O139群霍乱弧菌进行PCR霍乱肠毒素（CT）基因检测,以16SrRNA为探针对菌株DNA进行Southern杂交后对图谱进行核糖体基因（RT）分型分析。[结果]对30株霍乱弧菌RT图谱进行分析,共存在5种16SrRNA核糖体基因型,其中CT阳性的O139群霍乱弧菌为RT1型,CT阴性的O139群霍乱弧菌为RT2-RT5型。[结论]北京市不同年份的O139群霍乱弧菌CT阳性菌株核糖体基因型较为单一,CT阴性菌株基因型具有明显的多样性。提示北京市O139群霍乱弧菌CT阳性菌株和CT阴性菌株遗传发生上相距较远。     

市售甲鱼带菌引发霍乱疫情病原学研究

[目的]弄清O139群霍乱弧菌在我市引起突发公共卫生事件的原因及传播来源,找到防控措施。[方法]用碱性胨水对所采样品进行增菌,四号琼脂平板作病原菌分离,Cpi20E作生化学鉴定,O139诊断血清作菌群诊断,同时用PCR作菌株毒力测定,引物是CtxA,用KB法作药物敏感试验。[结果]我市O139群霍乱疫情共作样本215件,检出42株病原性弧菌,并从相关食物链甲鱼中检出3株,生化鉴定率为99.9%,从病人及甲鱼中检出的O139群霍乱弧菌生化反应一致,毒力基因相同。对青霉素等数10种抗生素耐药、先锋类及复哌酸敏感。[结论]我市O139群霍乱疫情由外地输入甲鱼带染所致,病人及甲鱼中检出O139群霍乱弧菌具有同源性。     

用多基因PCR检测和区分不同群型霍乱病原菌

目的 建立一种快速、敏感的诊断方法,用于检测和区分霍乱弧菌Ｏ１群古典型（ＣＶＣ）,埃尔托型（ＥＶＣ）、Ｏ１３９群和非Ｏ１和Ｐ１３９群,方法 分别针对霍乱弧菌肠毒素Ａ亚单位（ｃｔｘＡ）基因,Ｏ１３９群特异基因、霍乱弧菌溶血素Ａ亚单位（ｈｌｙＡ）基因和毒力协同调节菌毛Ａ亚单位（ｔｃｐＡ）基因设计引物,建立多基因ＰＣＲ方法。ＰＣＲ产物经电泳,根据扩增条带的大小和数目,可检测和区分ＣＶＣ、ＥＶＣ,Ｏ１３９