基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin治疗肝癌的实验研究

目的　探讨一种新的基因 病毒治疗系统CNHK30 0 murineendostatin(简称CNHK30 0 mE)对肝癌的治疗作用。方法　利用基因重组技术构建一种用人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子控制腺病毒E1A基因表达并携带内皮抑素基因的基因 病毒治疗系统 ;通过 5 0 %组织培养感染剂量 (TCID5 0 )方法和细胞活性检测法四氮唑盐比色试验 (MTT法 )观察CNHK30 0 mE在 2种肝癌细胞株 (HepGII及Hep3B)及 1株正常的成纤维细胞株 (MRC 5 )中的病毒增殖能力和对细胞的杀灭能力 ;通过肝癌SMMC772 1细胞裸鼠皮下移植瘤模型观察该病毒对肝癌生长和对肿瘤血管生成的抑制作用 ;利用Western印迹法和酶联免疫吸附实验 (ELISA)法检测内皮抑素基因在体内和体外的表达。结果分别感染肝癌细胞株和正常细胞株 96h后病毒的增殖倍数相差 32 96倍 ,其达到半数杀伤量 (ED50 )时的感染复数 (MOI)值相差 2 5倍 ,差异有显著意义 ,且两者均明显优于ONYX 0 15 ;CNHK30 0 mE能明显抑制肝癌皮下移植瘤内血管的生成 ,对肿瘤生长的抑制作用与携带同一治疗基因的非增殖型腺病毒和不携带治疗基因的增殖型腺病毒ONYX 0 15相比均增强 (P均 <0 0 1) ;其所介导的内皮抑素基因在体内和体外的表达量均与携带该基因的非增殖型腺病毒载体相比均增高 (P <0 0 5和     

在结肠癌细胞内高效表达内皮抑素的增殖型腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带内皮抑素基因的增殖型腺病毒载体,寻找结肠癌的有效治疗方法.方法:通过RT-PCR克隆内皮抑素基因,293细胞内分别重组携带内皮抑素基因的增殖型(CNHK200-hE)和增殖缺陷型(Ad-hE)腺病毒,分别体外感染结肠癌细胞HT-29后比较两者在细胞病理效应、病毒增殖和内皮抑素表达量方面的差异.结果:CNHK200-hE感染结肠癌细胞96 h后可增殖2 000多倍;感染后7 d肿瘤细胞死亡率达96.2%,而对正常肝细胞基本无杀伤作用;随着感染时间的延长,肿瘤细胞培养上清液中内皮抑素表达量不断增加,第5天达1 090 ng/ml,显著高于Ad-hE感染组(P<0.01).结论:携带内皮抑素基因的增殖型腺病毒CNHK200-hE具有高效表达内皮抑素和在结肠癌细胞内增殖并杀灭肿瘤细胞的作用.     

增殖型腺病毒载体介导mIL-12基因对胃癌细胞的杀伤作用

目的:观察增殖型腺病毒载体介导的mIL-12基因对胃癌细胞的杀伤作用.方法:利用携带mIL-12基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株SGC-7901,通过病毒增殖实验、细胞病理效应、酶链免疫反应等分别观察病毒复制能力、病毒对胃癌细胞的杀伤作用及mIL-12表达水平.结果:携带mIL-12基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株SGC-7901具有肿瘤增殖型腺病毒ONYX-015的相似作用,可在肿瘤细胞内复制、增殖并杀死肿瘤细胞,而并不能在正常细胞内复制及增殖.该病毒在肿瘤细胞内的增殖能力是传统载体的近千倍.该载体携带的mIL-12基因的表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体体系,是传统基因治疗表达量的百倍.结论:CNHK200-mIL-12能在胃癌细胞中增殖并杀死胃癌细胞,并提高目的基因的表达水平,可能为胃癌治疗提供一新途径.     

溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ表达mIFN-γ及体外胃肠道肿瘤杀伤实验

目的研究携带鼠干扰素-γ(mIFN-γ)基因的溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ(简称CNHK300-Mγ)对胃肠道肿瘤细胞的体外杀伤作用和mIFN-γ的表达情况。方法采用CNHK300-Mγ、CNHK300、ONYX-015和AdEasy-mIFN-γ(简称AdEasy-Mγ)感染胃癌细胞株SGC-7901、大肠癌细胞株HT-29和正常成纤维细胞株MRC-5,通过TCID50法、CPE和四唑盐比色试验(MTT)检测CNHK300-Mγ、CNHK300和ONYX-015在上述肿瘤细胞和正常细胞中的增殖能力和杀伤作用,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CNHK300-Mγ和AdEasy-Mγ在上述肿瘤细胞和正常细胞中不同时相的mIFN-γ表达量。结果 CNHK300-Mγ具有类似于CNHK300的肿瘤细胞选择增殖性特性,能在胃肠道肿瘤细胞中大量增殖并杀灭肿瘤细胞,均强于ONYX-015,而在正常细胞中增殖和杀伤作用均较弱,类似于ONYX-015。CNHK300-Mγ感染胃肠道肿瘤细胞后有大量的mIFN-γ表达,并随着感染时间延长表达量也相应上升,而AdEasy-Mγ感染后只有少量mIFN-γ的表达,而且感染的时间延长表达量变化也不大。结论 CNHK300-Mγ能选择性增殖、杀灭肿瘤细胞,同时大量表达具有抗肿瘤作用的治疗基因,发挥多重抗瘤作用,有良好的临床应用前景。     

携带mIL—12基因的增殖腺病毒在鼻咽癌细胞中增殖及mIL—12高效表达

OBJECTIVE: To enhance the therapeutic effects on nasopharyngeal carcinoma by combining treatment with selectively replicating adenovirus and IL12. METHODS: Replicating adenovirus with mouse IL12 gene insert (CNHK200-mIL12) was constructed to transfect nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE3 and 915. Adenovirus hexon was detected by immunohistochemical staining and flow cytometry (FCM), and mIL12 expression examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The replication rates of CNHK200-mIL12 and dl1520 was determined by 50% tissue culture infectious dose (TCID50). RESULTS: Twenty-four hours after transfection with CNHK200-mIL12, most of cells were positive for adenovirus hexon and FCM demonstrated increased positivity rates of 39% and 4% among CNE3 and 915 cells respectively. It was observed that CNHK200-mIL12 replication increased by 1 000 folds with mIL12 expression level reaching as high as 84.5+/-4.6 ng in CNE3 cells and 75.6+/-3.4 ng in 915 cells as determined 72 h after transfection with 1x10(5) PFU CNHK200-mIL12 into 1x10(4) cells. CONCLUSION: CNHK200-mIL12 can replicate in vitro in nasopharyngeal carcinoma cells (dl1520 cells, for instance) with high mIL12 expression, which suggests that CNHK200-mIL12 may potentially be used to treat nasopharyngeal carcinoma.     

携带人分泌型内皮抑素基因重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备包含人分泌型内皮抑素基因的重组腺病毒,为下一步探讨其在血管生成依赖性疾病的治疗研究中的应用提供基础。方法以T-Endostatin质粒为模板,通过PCR扩增回收hEndostatin,将hEndostatin连接到pShuttle2中,构建pShuttle2-hEndostatin表达质粒,将此表达质粒连接到缺陷型腺病毒载体,构建Ad-hEndo。其线性化后转染HEK293T细胞,纯化后的重组腺病毒Ad-hEndo在HEK293T细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,并测定其滴度。结果利用PCR反应进行鉴定,扩增得到的hEndostatin经酶切鉴定,DNA测序证实为重组腺病毒,测定病毒滴度为5.2×109PFU/ml。结论本实验成功构建了人分泌型内皮抑素重组腺病毒Ad-hEndo,可直接用于血管生成依赖性疾病基因治疗的实验研究。     

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA的构建及对结肠癌治疗作用的体内研究

目的:构建一种结合抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤基因-病毒治疗系统CNHK200-hA,初步研究其在体内对结肠癌的治疗作用. 方法: 克隆人抗血管生成基因Angiostatin(k1-5),命名为hA. 利用病毒重组技术将hA插入肿瘤特异性增殖型腺病毒和非增殖型腺病毒的病毒基因组中,通过动物试验观察其对结肠癌的体内治疗作用. 结果: 构建了一种新型的基因-病毒治疗系统CNHK200-hA. 动物体内试验显示基因-病毒治疗系统CNHK200-hA能在结肠癌HT-29内高效表达K1-5蛋白,使肿瘤内血管明显减少,对结肠癌的疗效明显好于非增殖型腺病毒Ad-hA及肿瘤增殖型病毒ONYX-015. 结论: 插入了抗肿瘤新生血管生成基因hA的基因-病毒治疗系统CNHK200-hA在体内对结肠癌的治疗作用较非增殖病毒Ad-hA及肿瘤增殖病毒ONYX-015进一步提高.     

腹腔注射内皮抑素腺病毒治疗原位胰腺癌的实验研究

目的探讨腹腔注射内皮抑素腺病毒治疗裸鼠原位胰腺癌的机制,观测其疗效。方法通过细胞内同源重组方法构建携带内皮抑素重组腺病毒Ad-mEndo,体外转染胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3,并测定感染的胰腺癌细胞上清液（鼠源性内皮抑素）mEndostatin蛋白的表达。荷瘤裸鼠腹腔注射腺病毒液Ad-mEndo,观察原位胰腺癌肿瘤的大小及测定肿瘤微血管密度。结果重组腺病毒Ad-mEndo体外能转染胰腺癌细胞株,并表达mEndostatin mRNA及蛋白。重组腺病毒Ad-mEndo治疗组肿瘤体积和微血管密度均显著小于生理盐水组,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）。结论重组腺病毒Ad-mEndo腹腔注射能有效抑制裸鼠原位胰腺癌的生长,为胰腺癌的治疗探索了一种新的治疗途径。     

应用重组分泌型内皮抑素腺相关病毒治疗肾细胞癌

【目的】研究重组分泌型内皮抑素腺相关病毒（rAAV—Endostatin，rAAV—ES）的抗肿瘤血管生成及抑制肾细胞癌进展的作用。【方法】应用rAAV—ES转染肾癌细胞，ELISA法测定上清液中重组内皮抑素的浓度并检测其对血管内皮细胞趋化运动的抑制作用；建立裸鼠肿瘤模型，检测肾癌细胞被感染后的成瘤率及全身应用rAAV—ES后抑制肿瘤发展的作用及其毒副作用。【结果】RCC细胞感染rAAV—ES后上清液中重组内皮抑素浓度为52．67ng／ml，对血管内皮细胞趋化运动的抑制率为38．13％；转染rAAV—Es后的肾癌细胞成瘤率为对照组的60％，体内实验证实全身应用rAAV—ES后血清中内皮抑素长期高效表达，肿瘤生长速度减慢，瘤体微血管密度变低，心脑组织检查未见缺血和其他病理改变。【结论】rAAV—ES无毒副作用，可有效地抑制肿瘤的血管生成，从而抑制肾细胞癌的发生和发展。     

Synergistic antitumor effects of in vivo production of human endostatin and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in mice after subcutaneous implantation of primary fibroblasts transfected by adenovirus-mediated gene delivery

Background Tissue inhibitor of metalloproteinase （TIMP）-1 is a multifunctional protein. The aim of the study was to examine the feasibility of using a combination of adenovirus-mediated gene delivery of TIMP-1 plus endostatin and cell transplantation techniques to treat tumor growth and metastasis in mouse melanoma.Methods A enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the level of TIMP-1 and endostatin in vitro and in vivo. A tumor bearing mouse model and an experimental lung metastasis model in animal experiments were used to explore the therapeutic effect of in vivo production of human TIMP-1 and endostatin after the implantation of primary fibroblasts infected with the indicated adenovirus into tumor-bearing mice and a cytochemical method was used to observe histopathological changes of the tumor. An experimental lung metastasis model was established by injecting B16BL6 cells into the tail vein of mice and adenovirus-infected primary fibroblasts were subcutaneously implanted into the mice 24 hours later. Twenty-one days after tumor cell injection, mice were sacrificed to examine the effect on nodules visible as black forms on the surface of the lungs in B16BL6 cells.Results TIMP-1 and endostatin were secreted into the supernatants of cultures of Ad-TIMP-1 and Ad-End-infected mouse primary fibroblasts. We also observed that implantation of fibroblasts infected with Ad-TIMP-1 alone, Ad-End alone, or Ad-TIMP-1 plus Ad-End resulted in detectable blood levels which may clearly inhibit the tumor growth and metastasis in a murine melanoma model.Conclusion These results suggest the high capacity of transfection for the delivery of TIMP-1 or endostatin gene constructs into primary fibroblasts, and demonstrate that the implantation of TIMP-1 and endostatin producing fibroblasts at a site in vivo where direct secretion of TIMP-1 and endostatin into the blood is possible represented a promising approach for the development of cancer therapy.     

端粒酶逆转录酶启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用

目的观察端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用。方法采用Western印迹检测了腺病毒E1A在细胞中的表达;通过病毒增殖实验和细胞生长抑制实验,验证CNHK300选择性复制和杀伤能力,并与ONYX-015(E1B55000蛋白缺失的2型和5型嵌和型腺病毒)和wtAd5(野生型腺病毒)进行比较;用携带绿色荧光蛋白的CNHK300-EGFP感染BJ和Hep3B,直观的观察其增殖过程。结果CNHK300病毒48h在Hep3B和HepGⅡ中的增殖倍数分别为40625和65326倍,与wtAd5增殖能力相近,较ONYX-015强几倍至十几倍。在BJ正常成纤维细胞中CNHK300病毒增殖能力减弱,CNHK300病毒48h增殖倍数为180倍,而wtAd5增殖能力仍可高达4000倍。CNHK300在MOI 0．5集落形成单位／细胞以下就可以有效地杀伤肝癌细胞,MOI 0．002集落形成单位／细胞时就可以杀伤半数Uep3B细胞,较ONYX-015具有更强的肿瘤杀伤能力。CNHK300对正常成纤维细胞的杀伤力明显弱于wtAd5,CNHK300在MOI100集落形成单位／细胞时BJ细胞存活率近50％。结论肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK300可选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中复制,并产生溶瘤作用,在正常细胞中复制能力和杀伤能力明显减弱,且无论选择性和杀伤能力均优于ONYX-015。     

转染内皮抑素基因对血管内皮细胞增殖的影响

目的通过接种转染携带小鼠内皮抑素基因的腺病毒到人血管内皮细胞(ECV304),观察内皮抑素基因表达对人血管内皮细胞增殖的影响。方法分对照Ⅰ组(磷酸盐缓冲液)、对照Ⅱ组(携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒)和实验组(携带小鼠内皮抑素基因的腺病毒),用二苯基四氮唑溴盐法(MTT法)测定各孔的光吸收值,计算细胞增殖抑制率。结果各组的细胞增殖抑制率分别为7%(对照Ⅰ组)、6%(对照Ⅱ组)和78%(实验组)。结论证实腺病毒携带的内皮抑素基因可以抑制人血管内皮细胞系的增殖,为进一步研究内皮抑素基因治疗提供实验基础。     

携带IL-24的溶瘤腺病毒作用于乳腺癌的体外实验研究

目的 构建携带IL-24基因的溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24,评估CNHK600-IL-24在体外对乳腺癌细胞的杀伤能力.方法 将IL-24基因插入腺病毒穿梭载体SG502-ΔCR2,与5型腺病毒骨架载体pPE3共转染至人胚肾293细胞,获得溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24.荧光显微镜观测及病毒体外增殖实验测...     

重组腺相关病毒介导内皮抑素的表达及体外活性研究

目的 构建携带人内皮抑素基因的重组腺相关病毒rAAV-hEndo,介导其体外表达并检测其生物活性。方法 采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-hEndo,测定其滴度及感染效率。免疫荧光染色检测内皮抑素蛋白在体外感染细胞中的表达,并通过MTT法、细胞周期检测及TUNEL法检测细胞凋亡指数,观察其对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响。结果 所制备的重组腺相关病毒滴度为2×10¹²vg/ml,感染效率达98%。免疫荧光染色显示内皮抑素蛋白主要表达于细胞胞质。rAAV-hEndo感染细胞培养上清对ECV304细胞72h增殖抑制率为67.3%。内皮细胞转染内皮抑素基因后细胞周期明显阻滞于G₁期,其G₁期占(72.5±4.0)%,与对照组(52.1±2.1)%比较有显著差异(P<0.01)。TUNEL法检测实验组内皮细胞凋亡指数为(32.6±3.2)%,与对照组(4.2±1.9)%比较有显著差异(P<0.01)。结论 所制备的重组腺相关病毒rAAV-hEndo能有效介导具有生物活性的内皮抑素表达,为进一步肿瘤抗血管生成基因治疗动物实验奠定了基础。     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

鼠内皮细胞抑制素的克隆及在COS-7细胞中的分泌表达

目的从小鼠肝脏中克隆出ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ并在ＣＯＳ－７细胞中分泌表达,为其在肿瘤抗血管基因治疗中的应用打下基础。方法用ＲＴ－ＰＣＲ从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素ｃＤＮＡ并克隆入测序载体ＰＵＣ－Ｔ测序证实后,装入分泌表达载体ｐＳＥＣ－ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,用ＤＥＡＥ－葡聚糖转染ＣＯＳ－７细胞,从ｍＲＮＡ水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达。结果测序结果显示所克隆的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

鼠IFN-λ2腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建鼠IFN-λ2重组腺病毒载体。方法:用人水疱口炎病毒诱导小鼠原代脾细胞表达IFN-λ2,通过RT-PCR获取IFN-λ2 cDNA,将其亚克隆至pShuttle-CMV载体,经PmeⅠ线性化后,与腺病毒的骨架载体pAdEasy在BJ5183菌中同源重组,转染293A细胞包装扩增,RT-PCR检测重组腺病毒的目的基因,TCID50法对构建的腺病毒进行滴度测定。用鼠IFN-λ2重组腺病毒感染小鼠肺腺癌细胞,蛋白质印迹法检测细胞中IFN-λ2蛋白的表达,倒置显微镜观察鼠IFN-λ2重组腺病毒对鼠肺腺癌细胞生长的抑制作用。结果:成功克隆鼠IFN-λ2的cDNA,序列与基因库公布序列完全一致;经酶切鉴定表明成功构建鼠IFN-λ2重组腺病毒载体;重组腺病毒载体在293A细胞中成功包装及扩增;包装成功的重组腺病毒中含有目的基因,病毒滴度为2×1010pfu/ml;蛋白质印迹显示感染细胞的上清中有鼠IFN-λ2蛋白的表达,倒置显微镜显示感染的鼠肺腺癌细胞生长受到抑制。结论:成功构建了鼠IFN-λ2重组腺病毒载体,并能介导鼠IFN-λ2蛋白的表达进而抑制鼠肺腺癌细胞的生长,为进一步开展抗肿瘤研究及基因治疗奠定基础。     

子宫内膜异位症患者腹腔液血管内皮生长因子与内抑素的表达

OBJECTIVE: To investigate the relationship of vascular endothelial growth factor (VEGF) and endostatin with endometriosis. METHODS: The levels of vascular endothelial growth factor and endostatin were measured using ELISA in 50 women with endometriosis (stage I-II26 cases and stage III-IV 24 cases) in comparison with 42 women without endometriosis. RESULTS: The VEGF, endostatin concentrations and VEGF/endostatin ratio in endometriosis group were significantly higher than the mean value in the control group (P<0.01). The VEGF and endostatin levels in stages III and IV were both significantly higher than those in stages I and II(397+/-81 pg/ml vs 315+/-64 pg/ml, 125+/-62 ng/ml vs 66+/-40 ng/ml, P<0.01). However, the VEGF/endostatin ratio was lower in the advanced stages. There was no significant difference between follicular phase and luteal phase except that the VEGF level in follicular phase was higher than that in luteal phases. CONCLUSIONS: Both VEGF and endostatin may play a role in the regulation of angiogenesis of endometriosis, and the balance of angiogenic stimulators and inhibitors may be critical to the development of endometriosis.     

Retroviral endostatin gene transfer inhibits human colon cancer cell growth in vivo

Thegrowthandprogressionoftumorsisdependentonangiogenesis 1Theabilitytomodulatethe“angiogenicswitch”byup regulatingthereleaseofangiogenesisinhibitorsanddown regulatingtheproductionoftumor associatedangiogenicfactorsshouldprovideastrategytodisrupttumorsviatheirvascularnetwork 1,2 　Amongthealreadydescribed potentialangiogenesisinhibitors,themostpotentoneisafragmentoftype XⅧcollagen ,namelyendostatin 2 　Inthisstudy ,weconstructedaretrovirusthatexpressesasecretableendostatin ,andassesseditsbio…