荷CEA-rV的DC增强CD3AK对CEA阳性肿瘤特异杀伤作用的研究

目的 观察荷CEA-rV的DC增强CD3AK细胞对CEA阳性肿瘤细胞的特异性杀伤功能。方法 用脐血制备脐血单个核细胞（UBMC），培养3h后，收集悬浮细胞制备CD3AK，重悬贴壁细胞制备DC。DC培养3d时加入CEA-rV，制备CEA-vV＋DC；在CD3AK培养8d时，加入CEA-rV＋DC混合培养，制备CEA-rV＋DC＋CD3AK。用MTT法测效应细胞UBMC，CD3AK，DC＋CD3AK，CEA-rV＋DC＋CD3AK，分别对CEA阳性靶细胞：LOVO，A549和CEA阴性靶细胞：肝癌细胞株BEL-7402，红白血病细胞株K652的杀伤活性。结果 ①用CEA兔抗人单克隆抗体对四种靶细胞株的鉴定结果表明，LOVO和A549确是CEA阳性细胞株，BEL．7402和K562确是CEA阴性细胞株。②培养10d的DC流式细胞仪检测结果示：高表达MHCI，Ⅱ类分子CD86（82．7％），CD80（51．1％），CD83（57．5％），CD40（69.4％），低表达CD123分子，光学和电子显微镜观察，DC细胞呈不规则形，有大量突起和伪足，成熟DC直径15-20um，胞浆线粒体，内质网丰富。证明为成熟DC。③CD3AK细胞和单纯UBMC细胞的流式细胞仪的免疫分子表型结果是，无论CD3，CD4，CD8和CD28，在CD3AK细胞组中的比率都是UBMC组的二倍以上。说明CD3AK组中成熟T淋巴细胞量明显高于UBMC细胞组。④三种效应细胞CEA-rV＋DC＋CD3AK，DC＋CD3AK和CD3AK对四种靶细胞的杀伤率均比单纯UBMC组明显提高（P〈0.01），而且CEA-rV＋DC＋CD，AK组〉DC＋CD3AK组〉CD3AK组〉UBMC组。说明细胞因子，DC和CEA-rV都有进一步提高UBMC广谱的杀伤肿瘤细胞活性的作用。⑤CEA-rV＋DC＋CD3AK和CD，AK相比较，对CEA阳性细胞LOVO和A549的杀伤活性提高的显著性（P〈0．01）明显优于对CEA阴性细胞K562和BEL-7402显著性（P〈0．05）。说明CEA-rV＋DC能显著提高CD3AK细胞对CEA阳性肿瘤的特异杀伤活性。CEA-rV＋DC＋CD3AK组和DC＋CD3AK组相比，对CEA阴性细胞株的杀伤活性无显著差异（P〉0．05），而对CEA阳性细胞株的杀伤活性确能明显提高（P〈0．01）。进一步证实了CEA-rV能明显提高CD3AK对CEA阳性肿瘤的特异杀伤作用。结论 CEA-rV＋DC能明显提高CD3AK细胞对CEA阳性细胞株杀伤作用，单纯DC对提高CD3AK杀伤CEA阳性细胞的作用不显著，结果表明CEA-rV在提高CD3AK对CEA阳性肿瘤的特异杀伤作用中起着关键作用。     

荷CEA-rV的DC增强CD3AK对CEA阳性肿瘤的特异杀伤作用

癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）是一种常见的肿瘤相关抗原，是目前国际上公认的肿瘤标记物。在人体上皮细胞恶性肿瘤中，包括90％的胃肠道肿瘤、胰腺癌、80％以上的非小细胞肺癌和50％左右的乳腺癌，都呈CEA阳性。人们称这类肿瘤为CEA阳性肿瘤。罗超权等心。用牛痘病毒构建的CEA-重组基因痘苗病毒（CEA-rV）既有CEA抗原的高表达，又可刺激机体产生CEA抗体。     

荷CEA-rV的DC增强CD3AK对CEA阳性肿瘤特异性杀伤作用的研究

Objective： To survey the special killing activity of CD3AK on anti-CEA-positive tumor enhanced by umbilical cord blood dendritic cell （DC） loaded with CEA recombinant vaccinia virus （CEA-rV）. Methods： Freshly isolated umbilical blood mononuclear calls （UBMC） were cultivated for 3 h. Suspension cells and attached calls were used to induce CD3AK calls and DC separately. DC was loaded with CEA-rV on the 3rd day to prepare CEA-rV＋DC. CD3AK cells were co-cultured with CEA- rV＋DC on the 8th day, to prepare CEA-rV＋DC＋CD3AK. The killing activity of each effector＇s cell, which included UBMC, CD3AK, DC＋CD3AK and CEA-rV＋DC＋CD3AK, was measured respectively by MTT reduction assay. Results： （1） 4 target cells were con- firmed by CEA monoclonal antibody of rabbit anti-human. Lovo and A549 were really CEA positive cell lines, while Bel-7402 and K562 were CEA negative cell lines. （2） It was showed by flow-cytometry that the mature DC cultured at 10th day expressed MHC I, II molecules such as CD86, CDS0, CD83 and CD40 highly, but CD123 lowly. The expression rates of CD86, CDS0, CD83 and CD40 was 82.7%, 51.1%, 57.5% and 69.4%, respectively. The appearances and intra-cellular structures of DC were observed through light and electron microscope. The diameter of mature DC was 15-20 μm presented the irregular morphologic appearanca, much prominences and pseudopodium. There were abundant mitochondria and endoplasmic reticulum in DC endochylema. （3） The rates of CD3, CD4, CD8 and CD28 in CD3AK cells group were 2 folds higher than that in UBMC group by FACS. It was said that the numbers of the mature T lymphocyte in CD3AK cells group were much greater than that in UBMC group. （4） The killing activities to 4 target cells of 3 effector＇s cells, which included CEA-rV＋DC＋CD3AK, DC＋CD3AK and CD3AK, were much greater than that of UBMC （P〈0.01）. Moreover, comparing with the killing activities of 4 effector＇s： CEA-rV＋DC＋CD3AK group 〉 DC＋CD3AK group 〉 CD3AK group 〉 UBMC group. It showed that, cytokine, DC and CEA-rV could efficiently elevate the killing activity of UBMC on broad-spectrum tumor cells. （5） Comparing with the killing activities of CEA-rV＋DC＋CD3AK and CD3AK cells to CEA positive and negative cells, the killing activities of CEA-rV＋DC＋CD3AK to CEA positive tumor calls, Lovo and A549 calls （P〈0.01） were remarkably better than that to CEA negative tumor cells BEL-7402 and K562 cells （P〈0.05）. It was said that the CEA-rV＋DC could obviously enhance the killing activity of CD3AK on CEA positive tumor cells. Comparing with the killing activities of CEA-rV＋DC＋CD3AK and DC＋CD3AK cells, the killing activity of CD3AK on CEA negative tumor cells was no statistical difference （P〉0.05）. However, the killing activity to CEA positive cells of CEA-rV＋DC＋CD3AK group was notably higher than that of DC＋CD3AK group. Namely, CEA-rV could distinctly promote the special killing activity to CEA positive tumor cells of CD3AK, but could not do it to CEA negative tumor cells. Conclusion： CEA-rV＋DC could obviously enhance the special killing activity of CD3AK on CEA positive tumor cell lines, while the DC only couldn＇t. The results indicated that the CEA-rV played an important role during the special killing activity of CD3AK cells to CEA positive tumor cells.     

荷肿瘤抗原的DC细胞增强CD3AK细胞特异杀伤作用的研究

目的 探讨肺癌细胞株A549的肿瘤冻融抗原（Ag）负荷脐血来源树突状细胞（DC）（Ag＋DC）与CD3AK细胞混合培养制备的Ag＋DC＋CD3AK对肺癌细胞株A549特异杀伤活性的影响。方法 用脐带血单个核细胞（UBMC）分别制备DC细胞、CD3AK细胞,用肺癌细胞株A549的制备肿瘤抗原（Ag）,用Ag负荷DC制备Ag＋DC,再把Ag＋DC和CD3AK共培养制备Ag＋DC＋cD3AK细胞;用MTT法检测不同效应细胞：UBMC、CD3AK细胞,Ag＋CD3AK和Ag＋DC＋CD3AK细胞对A549肺癌细胞株的杀伤活性。结果 各种效应细胞对A549细胞的杀伤活性分别是：Ag＋DC＋CD3AK（62．11％）〉Ag＋CD3AK（50．34％）〉CD3AK（45．91％）〉UBMC（34．35％）,而且Ag＋CD3AK组的杀伤活性高于CD3AK组（P〈0．05）;Ag＋DC＋CD3AK组的杀伤活性更明显的高于CD3AK组（P〈0．01）。结论 Ag能增强CD3AK细胞对亲本靶细胞的特异杀伤活性,肿瘤抗原负荷的DC（Ag＋DC）能进一步增强CD3AK细胞对亲本靶细胞的特异杀伤活性,为CD3AK细胞的特异免疫治疗的临床应用提供了基础资料。     

荷CEA-rV的DC诱导的CIK对CEA阳性原代肿瘤细胞的特异杀伤作用

目的：探讨携带CEA重组基因痘苗病毒（CEA-rV）抗原的树突状细胞（DC）诱导的杀伤细胞（CIK）对CEA阳性原代肿瘤细胞的特异性杀伤作用。方法：用脐血制备脐血单个核细胞（UBMC）、DC、CIK、DC＋CIK、CEArV＋DC＋CIK和CEA-rV＋DC＋UNBC细胞。取新鲜切除的食管癌组织和肺癌组织，制备原代培养的CEA阳性肿瘤细胞作为靶细胞。用MTT法测5组效应细胞对两种靶细胞的杀伤活性。结果：1）用CEA兔抗人单克隆抗体鉴定证实两种原代培养靶细胞系CEA阳性细胞。2）流式细胞仪测定DC的分子表型，证实为DC。3）流式细胞仪测定CIK的CD3^＋CD56^＋双阳性细胞达75．4％。4）DC＋CIK和CIK相比，对两种CEA阳性肿瘤细胞的杀伤率差异无统计学意义，P〉0．05。5）CE-rV4-DC＋CIK对两种CEA阳性肿瘤细胞的杀伤率（78．80％）明显高于DC＋CIK（52．94％），P％0．05。结论：CEA—rV＋DC能明显提高CIK细胞对原代培养的CEA阳性肿瘤细胞的杀伤活性，而单纯DC不能提高CIK的杀伤活性，说明CEA—rV在提高CIK对CEA阳性肿瘤细胞的特异杀伤作用中起重要作用。     

CEA-rV负荷DC诱导CIK对CEA+肿瘤细胞的杀伤研究

  目的 用CEA-rV负荷脐血来源树突状细胞（DC）后，再诱导CEA抗原特异的细胞因子诱导的杀伤细胞，研究其对CEA阳性肿瘤细胞株杀伤活性的作用。方法 用淋巴细胞分离液分离脐带血单核细胞，分别诱导DC、CIK细胞及CEA-rV负载DC后，再与CIK细胞混合培养诱导CEA特异的细胞毒性T淋巴细胞。分别用以上不同类型细胞杀伤CEA+和CEA-的肿瘤细胞株。结果 CEA-rV诱导的特异性CIK对CEA阳性肿瘤细胞的杀伤活性，Lovo为58.2 %、A549为62.4 %，较之DC-CIK组对CEA阳性肿瘤细胞Lovo为44.8 % 、A549为50.2 %，具有更高的杀伤活性，差异有统计学意义（P＜0.05）。CEA-rV诱导的特异性CIK对CEA阴性肿瘤细胞的杀伤活性K562为79.7 %、Bel7402为70.1 %，DC-CIK组对CEA阴性肿瘤细胞K562为78.7 %、Bel7402为67.8 % ，两组间无明显区别，差异无统计学意义（P＞0.05）。用CEA-rV诱导的特异性CIK对CEA阳性肿瘤细胞Lovo杀伤提高了89.4 %，A549提高了83.1 %；而对于CEA阴性肿瘤细胞K562杀伤提高了32.5 %，Bel7402提高了21.7 %，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 负载CEA-rV基因重组痘苗的DCs（CEA-rV-DCs）诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CEA-rV-DCs-CIK）对CEA阳性肿瘤细胞有特异性杀伤能力。     

CEA-重组痘苗病毒预防CEA阳性肿瘤的动物实验研究

目的：探讨ＣＥＡ－重组痘苗病毒对ＣＥＡ阳性肿瘤的预防作用。方法：构建ＣＥＡ阳性小鼠Ｈｅｐａ肝癌细胞模型。将实验鼠分为４组,先分别皮下接种痘苗病毒３次,再分别颈背部皮下注射ＣＥＡ阳性或ＣＥＡ阴性同源鼠Ｈｅｐａ肝癌细胞。观察动物反应并在接种癌细胞后每周测量一次肿瘤大小。结果：３个对照组各级部皮下均可见有瘤块形成,并且以相近速度快速增长,３组之间无统计学上的显著差异,而接种ＣＥＡ－ｒＶ／Ｈｅｐａ－ＣＥＡ     

双特异抗体介导的CD3AK对人小细胞肺癌细胞株的细胞毒作用

目的：研究在双特异性抗体的介导下ＣＤ３ＡＫ细胞（ＣＤ３单克隆栓激活的杀伤细胞）对人小细胞肺癌细胞株ＬＴＥＰ－ｓｍｌ的细胞毒作用。方法：用＾３１Ｃｒ－Ｎａ２ＣｒＯ４释放试验检测单抗（２Ｄ６、ＵＣＨＴ１）和双特异性抗体（ＷＳＴ－Ｈ７）与ＣＤ３ＡＫ共同对人小细胞肺癌细胞株的杀伤活性。持异性抗体体外能明显增强ＣＤ３ＡＫ细胞对人小细胞肺细胞株ＬＴＥＰ－ｓｍｌ的杀伤活性结论：与单纯ＣＤ３ＡＫ相比,加入双特异性     

CD3AK细胞的研究进展

过继免疫疗法是目前治疗恶性肿瘤的一个重要辅助治疗方法。它是指体内回输免疫活性细胞,从而达到杀伤恶性肿瘤细胞的目的。与其他抗肿瘤药物相比,它可以在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下,直接杀伤肿瘤细胞,并且调节和增强机体的免疫功能。用于过继免疫疗法的免疫活性细胞必须具有较强的细胞毒活性和增殖力,目前常用的有抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CDlmon-odonal antibody activated killer cells,CD3AK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cells,LAg)及细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,aKl)[1~3]。其中研究最多最重要的就是CD3AK细胞。本文拟就其研究进展作一综述。     

CD3AK细胞生物学特性及抗肿瘤作用研究

过继输注体外激活的抗肿瘤效应细胞直接或间接地介导体内肿瘤消退是肿瘤生物治疗研究的重要课题之一。８０年代初,ＮＩＣ的Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等人发现的ＩＡＫ细胞及其在实验动物和人类肿瘤治疗中抗肿瘤作用的证实将这一工作推进到了一个新的阶段。迄今在用于过继免疫治疗的各种抗肿瘤效应细胞中,ＬＡＫ细胞和ＴＩＬ细胞已引入临床。但近年来的研究观察表明,ＬＡＫ细胞只对少数肿瘤有效,多数肿瘤疗效不佳。ＴＩＬ细胞的抗肿瘤作用虽然优于ＬＡＫ细胞,但由于前体细胞来源困难,临床推广应用受到一定的限制。因此,目前有关的研究工作随…     

人γδT细胞、CD3AK细胞、CIK和DCs对荷胃癌裸鼠的疗效

Rosenberg等将LAK细胞应用于临床以来,人们对肿瘤的细胞免疫治疗进行了深入的研究.由于肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子和肿瘤微环境,以及荷瘤机体抗肿瘤免疫效应细胞不同程度地存在数量和质量上的异常,因此,在肿瘤细胞免疫治疗上必须用固有免疫细胞联合适应性免疫细胞进行治疗,才能有效地清除肿瘤细胞或抑制肿瘤生长.本研究应用术后2年末复发胃癌患者的树突状细胞(dendritics cells,DCs)、CIK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞对已建立的人胃癌(SGC-7901细胞株)模型裸鼠进行单独或联合治疗,以观察这些细胞单用和联用的治疗效果.     

CD3AK/iNOS细胞对白血病细胞体外杀伤的研究

背景与目的:LAK细胞已用于临床移植物净化。CD3AK细胞是CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞。本研究旨在经逆转录病毒介导iNOS基因转染人免疫活性细胞CD3AK建立CD3AK/iNOS细胞,并探讨其对白血病细胞株K562及其耐药株K562/ADM的杀伤作用。方法:培养PA317/pLNC-iNOS细胞获得病毒上清;CD3McAb联合小剂量的IL-2激活分离的外周血单个核细胞;含逆转录病毒颗粒的细胞培养上清感染靶细胞CD3AK细胞。测定CD3AK/iNOS、CD3AK细胞培养上清NO含量以及iNOS活性。MTT法观察CD3AK/iNOS、CD3AK对K562和K562/ADM细胞杀伤活性。结果:(1)CD3AK/iNOS、CD3AK中NO含量分别为(378.60±41.57)μmol/L,(98.07±22.31)μmol/L(P<0.001);CD3AK/iNOS、CD3AK中iNOS活性分别为(20.77±2.49)U/ml,(9.81±1.96)U/ml(P<0.001)。(2)MTT法观察CD3AK/iNOS对K562和K562/ADM杀伤活性分别为(64.85±18.13)%,(63.80±9.93)%。CD3AK杀伤活性分别为(45.66±17.46)%,(47.85±12.01)%。CD3AK/iNOS与CD3AK相比差异有显著性(P<0.05)。结论:CD3AK/iNOS分泌的NO含量、iNOS活性较CD3AK明显提高,且对K562及K562/ADM杀伤作用也更强;但CD3AK/iNOS对K562及K562/ADM杀伤作用无显著性差异。     

人CD3AK细胞杀伤人肺腺癌细胞的形态学观察

抗CD3抗体激活的杀伤细胞(CD3AK细胞)是一种新型的免疫效应细胞，与LAK细胞相比具有广谱、较高的杀伤活性及低IL-2依赖性的特点，因而受到重视。关于其杀伤机制的研究目前尚无明确报道。本研究把体外培养中贴壁状态的人肺腺癌细胞与用抗CD3单克隆抗体激活的人外周血来源的CD3AK细胞共同培养，电镜下观察了两种细胞的相互作用和靶细胞被杀伤的过程．藉此对CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞的机制作一探讨。     

肝癌患者自体CD3AK细胞与LAK细胞的杀伤活性比较

目的 比较肝癌患者自体CD3AK细胞和LAK细胞的杀伤活性,为临床是供依据。方法 以流式细胞仪检测细胞的杀伤活性。结果 原发性肝癌患者自体的CD3AK细胞的NK活性和LAK活性均高于LAK细胞。结论 CD3AK细胞效果稳定,抗瘤效应明显高于LAK细胞,CD3AK细胞可望作为一种新的生物治疗手段用于肿瘤治疗。     

CD3AK细胞的生物学特性及其抗肿瘤作用

CD3AK细胞是用抗T细胞表而CD3分子的单克隆抗体激活的新型杀伤细胞，在肿瘤的免疫疗法中愈来愈受到重视。本文用抗CD3单克隆抗体(北医太免疫室提供)和rIL-2(日本盐野义制药株式会社产品)共同刺激人外周血单个核细胞(PBMC)，诱导CD3AK细胞，系统地研究了其生物特性及其体外抗肿瘤活性并与LAK细胞作比较。     

CD3AK杀伤机理及其杀伤活性调控效应的初步研究

应用抗CD3单抗和人rIL-2共同诱导人外周血单个核细胞制备人CD3AK细胞(CDAK).采用LDH释放法、ABC-CELISA法、流式细胞术等方法观察了CD3AK杀伤癌细胞的机理及人rIFN-α、rIFN-γ、rTNF细胞因子、化疗药顺氨氯铂(CDDP)和阿霉素(ADM)对CD3AK杀伤活性的调控效应.结果表明,①粘附分子ICAM-1/LFA-1参与CD3AK的杀瘤过程,并且rIFN-α、rTNF的促CD3AK杀伤效应亦是通过上述途径实现的.③CD3AK通过分泌可溶性杀伤因子间接杀伤癌细胞.③CD3AK通过膜相关TNF参与杀伤效应.④CD3AK介导癌细胞凋亡.⑤化疗药CDDP和ADM处理癌细胞后,提高其对CD3AK杀伤活性的敏感性,CDDP促杀伤效应与其上调癌细胞表面ICAM-1、HLA-ABC抗原表达有关.     

脐血CD3AK和LAK细胞免疫学特征的比较研究

γIL-2激活的脐血杀伤细胞(LAK)体内外抗肿瘤已有报道,而Anti-CD3McAb作为免疫增强剂,在骨髓、外周血的过继免疫中已取得明显疗效,脐血单个核细胞(MNC)能否被Anti CD3McAb激活为抗肿瘤的杀伤细胞(CD3AK)?是否比其LAK有更多的活性?为探讨这些问题,本实验采用γIL-2+Anti-CD3McAb和单纯γLI-2刺激脐血MNC,观察其表面抗原及细胞因子的变化,并探讨两者对K562和HL-60白血病细胞株的杀伤作用.     

CD3AK细胞的体外诱导及生物学特征的研究

采用抗CD3单克隆抗体(anti-CD3McAb)和基因重组人白细胞介素2(rIL-2)、植物血凝素(PHA)共同诱导人外周血单个核细胞(PBMC)制备CD3AK细胞,应用APAAP法、吉姆萨染色法分析CD3AK细胞的表型、核型等免疫生物学特征.结果表明,微量的niti-CD3AK(终浓度30～50ng/ml)辅以少量的rIL-2(100 U/ml)和PHAS(100μg/ml)共同培养,就能诱导和扩增CD3AK细胞,细胞扩增倍数随着anti-CD3McAb的使用浓度增大而增高,当anti-CD3McAb的使用浓度提高到500ng/ml时,CD3AK细胞扩增倍数可达800倍以上,显著高于LAX细胞的扩增倍数,细胞常呈集落生长.CD3AK细胞的表型分析结果,CD3~ ,CD4~ ,CD8~ 的CD3AK细胞比率分别为(72 ±14)%,(29±4)%,(47±23)%,提示CD3AK细胞是一类以CD3~ ,CD4~ ,CD8~ 细胞为主的异质细胞群,并具